Bakterielle Erkennung und Identifizierung mit elektrochemischen Sensoren

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, Bakterien mit elektrochemischen Sensoren zu erkennen und zu identifizieren. Dies wird erreicht, indem zunächst die ribosomale RNA aus den Bakterien freigesetzt wird, um eine Hybridisierung mit der fluorierten Detektorsonde zu ermöglichen. In einem zweiten Schritt wird die an die Detektorsonde gebundene ribosomale RNA zur Arbeitselektrode hinzugefügt, was eine Hybridisierung mit der Fängersonde auf der Sensoroberfläche ermöglicht. Als nächstes wird das Anti-Fluorescein-Meerrettich-Peroxidase-Konjugat an die fluorierte Detektorsonde binden lassen.

Schließlich können in interferometrischem Strom, dessen Intensität mit der Anzahl der ribosomalen Einfangsonden korreliert, RNA-Detektorsondenkomplexe auf der Sensoroberfläche erhalten werden. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber kulturbasierten Methoden besteht darin, dass Bakterien in etwa 45 Minuten nachgewiesen und identifiziert werden können, wodurch das Gewicht über Nacht vermieden wird. Damit ein Bakterium eine sichtbare Kolonie auf einer EDGAR-Platte bilden kann, würde die Anwendung dieser Technik das Management von Infektionskrankheiten verbessern.

Denn die frühzeitige Erkennung von bakteriellen Erregern ist essentiell für eine gezielte Antibiotikatherapie und verbesserte klinische Ergebnisse. Diese Methode ist jedoch nützlich für die Diagnose von Infektionskrankheiten, kann aber auch auf andere diagnostische Probleme, wie z. B. die Immundiagnostik, angewendet werden. Beginnen Sie damit, die dilatative Capture-Sonde 10 Minuten lang bei Raumtemperatur mit Hexan-Dithiol zu inkubieren, um sicherzustellen, dass die Thiolgruppe auf der Capture-Sonde reduziert wird, was zu konsistenteren Ergebnissen führt.

Nach der Inkubation tragen Sie einen Stickstoffstrahl auf, um Gold zu tragen. 16 Sensorarray-Chips für fünf Sekunden, um Feuchtigkeit oder Partikel zu entfernen. Kleine Flüssigkeitsmengen müssen vorsichtig auf die Arbeitselektrode im Sensorarray aufgetragen werden. Die visuelle Demonstration dieser Technik ist von entscheidender Bedeutung.

Durch die ordnungsgemäße Durchführung der Pipettier-, Wasch- und Trocknungstechniken wird die Variabilität von Chip zu Chip erheblich reduziert. Tragen Sie als Nächstes sechs Mikroliter der HDT-Dilatationssondenmischung auf die Arbeitselektrode aller 16 Sensoren des Sensorarrays auf und lagern Sie die Sensorchips in einer abgedeckten Petrischale bei vier Grad Celsius über Nacht am nächsten Tag, waschen Sie die Sensorchips zwei bis drei Sekunden lang mit deionisiertem Wasser und trocknen Sie die Chips dann fünf Sekunden lang unter einem Stickstoffstrahl. Tragen Sie nun sechs Mikroliter Attrihydrochlorid, Natriumchlorid, EDTA MERCAPTOETHANOL Lösung auf die Arbeitselektrode aller 16 Sensoren auf und inkubieren Sie die Sensoren 50 Minuten lang in einer Petrischale bei Raumtemperatur.

Zur Vorbereitung der Proben für den elektrochemischen Sensor-Assay. Übertragen Sie einen Milliliter der Bakterienkultur in der logarithmischen Phase des Wachstums in ein Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie die Zellen dann fünf Minuten lang bei 16.000 g. Bitte beachten Sie, dass pathogene Bakterien in einer Biosicherheitshaube gehandhabt werden sollten.

Nachdem Sie den Snat entfernt haben, legen Sie eine Pipettenspitze mit 10 Mikrolitern eines molaren Natriumhydroxids auf den Boden des Mikrozentrifugenröhrchens und pipettieren Sie einige Male auf und ab, um das Pellet gründlich zu resuspendieren. Nach fünfminütiger Inkubation der Suspension bei Raumtemperatur werden 50 Mikroliter PBS, das Rinderserumalbumin oder BSA enthält, und eine fluoreszeinmodifizierte Detektorsonde hinzugefügt, um das bakterielle Lysat zu neutralisieren. Dann inkubieren Sie das neutralisierte Lysat 10 Minuten lang bei Raumtemperatur.

Beginnen Sie diesen Schritt, indem Sie die Mercaptoethanol-Lösung von einem der vorbereiteten Sensorchips zwei bis drei Sekunden lang mit deionisiertem Wasser waschen. Nach dem Trocknen des Chips, wie gerade gezeigt, tragen Sie vier Mikroliter des neutralisierten Bakterienlysats auf die Arbeitselektroden auf. 14 der Sensoren.

Geben Sie dann vier Mikroliter des brückenbrückenden Oligonukleotids in der PBS plus BSA plus fluoresceinmodifizierten Detektorsonde auf die beiden Positivkontrollsensoren. Nachdem Sie die Lysat- und Positivkontrollsensoren 15 Minuten lang inkubiert haben, waschen und trocknen Sie den gesamten Sensorchip wie zuvor. Tragen Sie nun vier Mikroliter Anti-Fluorescein-Meerrettichperoxidase oder HRP in PBS-haltigem Kasein auf die Arbeitselektroden aller 16 Sensoren auf.

Waschen und trocknen Sie den Sensorchip nach einer 15-minütigen Inkubation. Bringen Sie als Nächstes einen Filmschachtaufkleber auf der Oberfläche des Sensorchips an, legen Sie den Chip in die Pipette der Sensorchiphalterung, pipettieren Sie 50 Mikroliter TMB-Substrat auf alle 16 Sensoren und schließen Sie die Sensorchiphalterung. Verwenden Sie schließlich einen Helios-Chip-Leser, um Pyrometrie- und zyklische Telemetriemessungen für alle 16 Sensoren zu erhalten.

Der soeben beschriebene elektrochemische Assay ist ähnlich wie ein Sandwich, Eliza, aufgebaut, wie in dieser Abbildung gezeigt. Die ribosomale Ziel-RNA-Hybridisierung mit Fänger- und Detektorsonden wird durch eine Redoxreaktion entwickelt, die durch HRP katalysiert wird, das an Anti-Fluorescein-Antikörperfragmente konjugiert ist, die die Drei-Kiefern-Fluorescein-Bindung auf der Detektorsonde binden. Eine wichtige Komponente der Assay-Sensitivität ist die Oberflächenchemie der Goldelektrode. Die Goldelektrode ist mit Mercaptoethanol und Salz beschichtet und wird durch Zugabe von dilatativen Einfangsonden funktionalisiert.

Die Sandwich-Hybridisierung der ribosomalen Ziel-RNA mit der Capture-Sonde und der Fluorescein-markierten Detektorsonde führt zu einem Komplex, der durch Zugabe des Anti-Fluorescein-Meerrettichperoxidase-Konjugats und des TMB-Substrats detektiert wird. Der parametrische Strom M wird durch den Redoxzyklus erzeugt, der sich aus der Oxidation des TMB durch Meerrettichperoxidase und der Reduktion des TMB durch die Elektronen aus der Elektrode ergibt. Die hier gezeigten Assays verwenden einen genfluidischen 16-Sensor-Array-Chip.

Jeder der Sensoren im Array enthält drei Elektroden, eine funktionierende Referenz- und eine Hilfselektrode, die Kontaktpunkte am Rand des Chips haben. Der Chipleser verfügt über Pogo-Pins, die mit jedem der Kontaktpunkte verbunden sind. Der Chip-Reader dient als Schnittstelle für das Sensorarray mit einem Potentiometer, das von einem Computeralgorithmus gesteuert wird.

Hier werden Beispiele für einen elektrochemischen Sensorstromfluss gezeigt. Der Stromfluss in den Sensoren ist in den ersten Sekunden nach Beginn der parametrischen Messungen künstlich hoch. Aufgrund der Ansammlung von oxidiertem Substrat während der Zeit vom Auftragen von TMB auf die Sensoroberfläche bis zur Initiierung des Lesealgorithmus erreicht der Stromfluss dann schnell einen stationären Zustand und genaue Sensormesswerte können zuverlässig innerhalb von 60 Sekunden erhalten werden.

Die Variabilität von Sensor zu Sensor ist relativ konstant, so dass es möglich ist, 16 verschiedene Sensor-Assays parallel auf dem Gen fluidic 16 Sensor Array Chip durchzuführen Positiv- und Negativkontrollen sind als Positivkontrolle unerlässlich. Auf diese Weise wird ein synthetisches überbrückendes DNA-Oligonukleotid verwendet, das sowohl mit der Einfang- als auch mit der Detektorsonde hybridisiert und als synthetisches Ziel bekannter Konzentration dient. Die Ergebnisse wurden unter Verwendung der Bridging-Oligonukleotid-Funktion als interne Kalibrierungskontrolle erzielt, um die Variation von Chip zu Chip zu minimieren.

Je größer der negative Strom der Elektrode ist, desto höher ist das Signal. Bei der Prüfung von Erfassungs- und Detektorsonden. Die Nachweisgrenze sollte durch die serielle Verdünnung einer Probe bekannter Konzentration bestimmt werden, wie in dieser Abbildung gezeigt, es besteht eine lineare logarithmisch-korrelation zwischen der Probenkonzentration und der Signalausgabe über den Dynamikbereich des Assays.

In diesen Balkendiagrammen sind die repräsentativen Ergebnisse für Proben, die Esia coli und Kleb Seal und Ammoniak enthalten, die häufig im Urin von Patienten mit Harnwegsinfektionen gefunden werden, dargestellt. Die Signale für die meisten Sensoren sind niedrig und ähnlich, und diese negativen Ergebnisse können zusammengefasst werden, da die Hintergrundsignalreaktivität mit dem KE-Sondenpaar den Kanon von E. coli unterscheidet. Das brückenbildende Oligonukleotid dient als Positivkontrolle und interner Kalibrierstandard. Diese Technik kann auf den Nachweis von antibiotikaresistenten Bakterien in klinischen Proben angewendet werden, indem die phänotypische Reaktion der Bakterien auf Antibiotika gemessen wird.

Diese Technik kann verwendet werden, um die optimale Therapie für einen einzelnen Patienten zu bestimmen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Bakterien erkennen und identifizieren können, indem Sie die atrischen Ströme in den verschiedenen speziesspezifischen Sensoren im Chip vergleichen.