Analyse der SNARE-vermittelte Membranfusion Verwendung eines enzymatischen Cell Fusion Assay

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, durch Aktivierung der Expression von Beta-Galacto vermittelte Zellfusionsereignisse zu quantifizieren. Dies wird erreicht, indem zunächst V- und T-SNARE-Proteine ektoptisch an der Oberfläche von Cost-7-Zellen exprimiert werden. Der nächste Schritt des Verfahrens besteht darin, die Zellen, die V-SNARE-Proteine exprimieren, mit denjenigen zu kombinieren, die T-SNARE-Proteine exprimieren.

Dies führt zu einer SNARE-vermittelten Zellfusion und der aktivierten Expression von Beta-Galacto. Letztendlich wird die durch Zellfusion induzierte Beta-Galacto-Aktivität mittels eines Spektrophotometers gemessen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie dem mikroskopischen SAL-Region-Assay besteht darin, dass sie mehrere SNARE-Kombinationen analysieren kann.

Quantitativ betrachtet, obwohl diese Methode verwendet werden kann, um den Mechanismus und die Regulation der SNARE-vermittelten Membranfusion zu untersuchen, lässt sie sich auch für Hochdurchsatzstudien anwenden. Die Demonstration des Verfahrens erfolgt durch Doc Na Hassan, einen Postdoktoranden, und David Humphrey, einen Techniker aus meinem Labor, am Tag vor der Transfektionsbeladung.

24-Well-Platten mit 12-Millimeter-Glas-Deckgläsern vorbereiten, wobei zwei Wells für jede Kombination von Zellen, die eindeutige Plasmide in dem Experiment auf diesen Deckgläsern exprimieren, vorgesehen werden. 30.000 Cost-7-Zellen, die in DMEM ergänzt mit 4,5 Gramm pro Liter Glukose und 10 % FBS kultiviert wurden, ansäen, um zu transfizieren. Den V-Zellen jeweils ein Viertel Mikrogramm des TTA-Plasmids und einen Satz Expressionsplasmide hinzufügen.

Umgekehrte Proteine von Interesse, in diesem Fall umgekehrte Vamps, um die T-Zellen zu transfizieren: Geben Sie ein Viertel Mikrogramm des Plasmids, das TRE fehlt Z kodiert, sowie den komplementären Satz an Plasmiden, die die umgekehrten Proteine von Interesse kodieren, hinzu. In diesem Fall SNAP25, Syntaxin 1 und Syntaxin 4. Transfizieren Sie nun die CoSt7 mit Lipofektamin gemäß den Anweisungen des Herstellers und kultivieren Sie die Zellen für 24 Stunden. 24 Stunden nach der Transfektion fixieren Sie die Zellen 10 Minuten lang in supplementiertem Paraformaldehyd. Nach der Fixierung spülen Sie die Zellen dreimal mit PBS++ ab und blockieren Sie die Zellen anschließend 30 Minuten lang mit supplementiertem FBS.

Nach der Blockierung inkubieren Sie die Zellen 30 Minuten lang mit dem monoklonalen Anti-mic-Antikörper Nine E 10. Anschließend waschen Sie die Zellen viermal mit PBS plus plus und inkubieren sie dann eine Stunde lang mit FITC-konjugierten sekundären Antikörpern in einer Verdünnung von 1 zu 500. Nach weiteren vier Waschungen mit PBS plus plus bringen Sie die markierten Zellen in einem handelsüblichen Anti-Fade-Reagenz zur Deckglasmontage ein.

Die Zellen sind nun bereit für die konfokale Mikroskopie. Am Tag vor der Transfektion säen Sie 1,2 Millionen Cos-7-Zellen pro 100-Millimeter-Zellkulturschale und 200.000 Cos-7-Zellen pro Vertiefung in einer 6-Loch-Platte für jede zu analysierende Plasmidkombination aus. Bereiten Sie eine Vertiefung vor, kultivieren Sie die Zellen 24 Stunden lang. Am nächsten Tag fügen Sie die Plasmide für die Transfektion hinzu: Für V-Zellen transfizieren Sie ein Plasmid, das das umgekehrte Protein der Interesse ausdrückt, sowie fünf Mikrogramm pTet-off in jede 100-Millimeter-Kulturschale.

Transfizieren Sie Kontrollzellen in einer 100 Millimeter Kulturschale mit einem leeren Vektor und P te off in denselben relativen Konzentrationen wie die V-Zellen. Nachdem alle Plasmide den V-Zellen und den Kontrollzellen hinzugefügt wurden, geben Sie Tcommycin zu diesen Vertiefungen, um die N-Glykosylierung von Vamps zu verhindern. Transfizieren Sie in jeder Vertiefung der 6-Loch-Platten die T-Zellen mit einem Mikrogramm PBIG zusammen mit den komplementären Plasmiden, die die Proteine des Interesses exprimieren.

Transfizieren Sie nun die Cost-Sieben-Zellen gemäß den Herstelleranweisungen mit Lip. Kultivieren Sie die Zellen anschließend 24 Stunden lang. 24 Stunden nach der Transfektion lösen Sie die V-Zellen mithilfe eines enzymfreien Puffer zur Zell-Dissociation von ihren Kulturschalen ab. Spülen Sie die Zellen zunächst einmal mit 20 Milliliter PBS ab.

Dann fünf Milliliter enzymfreies Dissoziationspuffer hinzufügen. Nach einer 10-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur lösen sich die Zellen durch kräftiges Klopfen auf die Platte; überprüfen Sie unter dem Mikroskop, ob sie sich abgelöst haben. Wenn weniger als die Hälfte der Zellen abgelöst ist, weitere fünf Minuten warten und die Platte erneut antippen.

Setzen Sie die Inkubation im Ablösungspuffer fort, bis mehr als die Hälfte der Zellen abgelöst hat. Anschließend zählen Sie die V-Zellen mit einem Hämozytometer. Danach resuspendieren Sie die V-Zellen in einem konzentrierten Heis-Puffer-DMEM auf eine Konzentration von etwa 480.000 Zellen pro Milliliter.

Geben Sie nun ein Milliliter der resuspendierten V-Zellen in jede Vertiefung, die die T-Zellen enthält, und stellen Sie die Platten zurück in den Inkubator. Nach sechs, zwölf oder 24 Stunden gemeinsamer Kultivierung waschen Sie die Zellen mit PBS und geben Lysepuffer hinzu. Danach lösen Sie die Zellen vorsichtig von den Vertiefungen ab und überführen sie in Röhrchen zur Zentrifugation.

Nach der Zentrifugation das Überstand in ein neues Röhrchen überführen und die Expression von Beta-Galacto mit einem im Handel erhältlichen Assay entsprechend den Herstelleranweisungen messen. Achten Sie während dieses Protokolls darauf, die Cholera-metrische Reaktion nach 90 Minuten durch Zugabe von einmolarer Natriumcarbonatlösung zu stoppen, um die Ergebnisse auszuwerten. Die Absorption bei 420 Nanometern in einem Spektrophotometer messen. Wenn CO7-Zellen mit umgekehrten SNARE-Plasmiden transfiziert wurden, wurden umgekehrte SNARE-Proteine an der Zelloberfläche exprimiert.

Mittels Durchflusszytometrie wurden die Expressionslevel von SNARE-Proteinen an der Zelloberfläche gemessen. Um ihre Membranfusionskapazitäten vergleichen zu können, mussten VAMPs auf gleichem Level exprimiert werden. Daher wurde die Konzentration jedes verwendeten SNARE-Plasmids für die Transfektion titriert und für die Transfektion optimiert.

Unter solchen Bedingungen wurden VAMPs 1, 3, 4, 5, 7 und 8 sowie Syntaxin 1 und 4 jeweils auf dem gleichen Niveau an der Zelloberfläche exprimiert; die neuronalen SNAREs, die die synaptische Exozytose vermitteln, wurden verwendet, um die Durchführbarkeit des Assays zu testen. Tatsächlich wurde eine starke Beta-Galaktosidase-Expression nachgewiesen, wenn V-Zellen, die VAMP 2, und T-Zellen, die Syntaxin 1 und SNAP 25 exprimieren, kombiniert wurden. Wenn jedoch entweder VAMP 2 oder SNAP 25 nicht exprimiert wurden, wurde lediglich eine Grundlinienaktivität der Beta-Galaktosidase detektiert, was darauf hindeutet, dass Zellfusion und Expression der Beta-Galaktosidase insgesamt auf den Wechselwirkungen von v- und t-SNAREs beruhen. Syntaxin 1, SNAP 25, VAMP 1, VAMP 3 und VAMP 8 wiesen vergleichbare und die höchsten Fusionsaktivitäten auf.

Im Gegensatz dazu deutet die Grundlinien-Beta-GAL-Aktivität darauf hin, dass die Protein-Kombination keine Membranfusion vermittelt, wie sie beispielsweise zwischen VAMP5 und SYNTAXIN1 stattfindet. SNAP25. Bei der Durchführung des enzymatischen Fusionsassays ist es wichtig, Unicamycin hinzuzufügen, um die N-Glykosylierung von ESNA-Proteinen zu verhindern, und DTT hinzuzufügen, um die Bildung von Disulfidbrücken zwischen ESNA-Proteinen zu verhindern.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man den Zellfusionsassay durchführt.