Name: Analyse der SNARE-vermittelte Membranfusion Verwendung eines enzymatischen Cell Fusion Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Lernen Sie einen enzymatischen Zellfusions-Assay zur Quantifizierung SNARE-vermittelter Membranfusionen mittels β-Galactosidase-Expression. Diese Methode ermöglicht die Analyse verschiedener SNARE-Kombinationen in COS-7-Zellen.

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Diese Arbeit wird durch Anschubfinanzierung von der University of Louisville und CA135123 von den National Institutes of Health (bis CH) unterstützt.

Ein. Zellkultur und Transfektion <ol><li> COS-7-Zellen werden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 4,5 g / l Glukose und 10% fötalem Rinderserum (FBS) ergänzt war. </li><li> Plasmid Transfektion mit Lipofectamin nach den Anweisungen des Herstellers (Invitrogen) durchgeführt. </li></ol> 2. Fluoreszenzmikroskopische Analyse der Zelloberfläche SNARE Expression <ol><li> Am Tag vor der Transfektion wurden 3 x 10 4 COS-7-Zellen werden auf 12-mm sterilen Deckgläschen (Fisher Scientific) in 24-well Platten ausgesät enthalten. </li><li> Für v-Zellen in jedem Well, 0,25 ug des Plasmids, das tTA kodiert (pTet-Off, CLONTECH) mit 0,25 ug der Plasmide, dass ausdrückliche umgedreht Vamps kotransfiziert. </li><li> Für T-Zellen in jedem Well wird 0,25 ug des Plasmids, das TRE-LacZ (PBI-G, CLONTECH) mit 0,25 ug jedes der Plasmide, dass ausdrückliche umgedreht SNAP-25 und syntaxins 1 oder 4 kotransfiziert. </li><li> 24 Stunden nach transfection, Zellen werden mit 4% Paraformaldehyd in PBS + + 10 min (PBS mit 0,1 g / l CaCl2 und 0,1 g / l MgCl 2 ergänzt), und dann in 10% FBS in PBS blockiert + + 30 min fixiert. </li><li> Die Zellen werden 1,5 h mit den anti-Myc monoklonalen Antikörper 9E10 (neat Hybridomkulturüberstand) inkubiert. </li><li> Nach vier Waschungen mit PBS + + werden die Zellen für 1 Stunde mit FITC-konjugierten Sekundärantikörper (Jackson Immunoresearch Laboratories) in einer Verdünnung von 1:500, inkubiert. </li><li> Nach vier Waschungen mit PBS + +, die markierten Zellen werden in Prolong Gold-antifade Reagenz (Invitrogen) montiert ist. </li><li> Konfokale Bilder werden auf einer Olympus Laser-Scanning-konfokalen Mikroskop gesammelt. Die Bilder werden mit dem Adobe Photoshop-Software verarbeitet. </li></ol> 3. FACS Analyse der Zelloberfläche SNARE Expression <ol><li> Am Tag vor der Transfektion 2 × 10 5 COS-7-Zellen werden in jede Vertiefung einer 6-Well-Platten ausgesät. </li><li> 24 Stunden nach transfection mit der aufgeklappten SNARE, pTet-Off und pBI-G Plasmiden werden die Zellen mit 1% Paraformaldehyd in PBS + + für 15 min fixiert und dann in 10% FBS in PBS + + 15 min blockiert. </li><li> Die Zellen werden mit den anti-Myc monoklonalen Antikörper 9E10 für 60 min inkubiert. </li><li> Nach dreimaligem Waschen mit PBS + + werden die Zellen mit FITC-konjugierten sekundären Antikörpern (Verdünnung 1:200) 45 min bezeichnet. </li><li> Nach dreimaligem Waschen mit PBS + + werden die Zellen von den Platten mit einem Zellenabstreifer abgeschabt. </li><li> 15.000 Zellen werden mit Hilfe eines FACSCalibur Durchflußzytometer (BD Biosciences). Die mittlere Fluoreszenzintensität jeder Probe wird unter Verwendung der CellQuest Pro Software. </li></ol> 4. Enzymatische Cell Fusion Assay <ol><li> Am Tag vor der Transfektion 1,2 × 10 6 COS-7-Zellen werden in jede 100-mm-Gewebekulturschalen Schale überimpft und 2 × 10 5 COS-7-Zellen werden in jede Vertiefung einer 6-Well-Platten ausgesät. </li><li> Für v-Zellen, 0,5 - 5 ug jeder flipped VAMP Plasmid wird mit 5 pg von pTet-Ab in den Zellen in jeder 100-mm-Kulturschale cotransfiziert. Kontrollzellen mit dem leeren Vektor pcDNA3.1 (+) und pTet-Off cotransfiziert. Um die N-Glykosylierung von VAMPS 1, 4, 5, 7 und 8, Tunicamycin verhindern (10 ug / ml) in Zellkulturmedium während der Transfektion eingeschlossen. </li><li> Für T-Zellen in jedem Well der 6-Well-Platten, blätterte 1 pg SNAP-25-Plasmid und pBI-G mit 0,5 ug kotransfiziert umgedreht Syntaxin1 Plasmid oder 0,05 ug umgedreht syntaxin4 Plasmid. </li><li> 24 Stunden nach der Transfektion werden die v-Zellen von Kulturschalen mit der enzymfreien Zelldissoziation Buffer (Invitrogen) abgenommen ist. Abgelösten Zellen werden mit einem Hämozytometer gezählt und in HEPES-gepufferter DMEM mit 10% FBS, 6,7 ug / ml Tunicamycin und 0,67 mM DTT ergänzt. </li><li> 4,8 × 10 5 resuspendiert v-Zellen werden in jede Vertiefung bereits mit den T-Zellen zugegeben. </li><li> Nach 6, 12 oder 24 hr rat 37 ° C in 5% CO 2 </sub&gt; die Expression von β-Galactosidase unter Verwendung des β-Galactosidase-Enzym-Assay-System mit Reporter-Lysepuffer nach den Anweisungen des Herstellers (Promega). Kurz gesagt werden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen, und dann in der Reporter-Lysepuffer lysiert. Zelllysate werden mit gleichen Volumen von 2 × Assay Puffer gemischt. Als Blindprobe wird der Reporter-Lysepuffer mit dem Assay 2 × Puffer gemischt. </li><li> Nach 90 min wird die kolorimetrische Reaktion durch Zugabe von 1 M Natriumcarbonat gestoppt. </li><li> Die Absorption bei 420 nm wird mit einem HITACHI 100-40 Spektralphotometer. </li></ol>

<ol><li>Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+intracellular+protein+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of intracellular protein transport.</a> Nature. 372, 55-63 (1994).</li>
<li>Jahn, R., Lang, T., Sudhof, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Membrane fusion.</a> Cell. 112, 519-533 (2003).</li>
<li>Bonifacino, J. S., Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanisms+of+vesicle+budding+and+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The mechanisms of vesicle budding and fusion.</a> Cell. 116, 153-166 (2004).</li>
<li>Jahn, R., Scheller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNAREs--engines+for+membrane+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">SNAREs--engines for membrane fusion.</a> Nature. 7, 631-643 (2006).</li>
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<li>Gossen, M., Bujard, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+control+of+gene+expression+in+mammalian+cells+by+tetracycline-responsive+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 5547-5551 (1992).</li>
<li>Hanson, P. I., Heuser, J. E., Jahn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotransmitter+release+-+four+years+of+SNARE+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+neurobiology%22%5BJournal%5D)">Neurotransmitter release - four years of SNARE complexes.</a> Current opinion in neurobiology. 7, 310-315 (1997).</li>
<li>McMahon, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellubrevin+is+a+ubiquitous+tetanus-toxin+substrate+homologous+to+a+putative+synaptic+vesicle+fusion+protein.+%5Bsee+comments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cellubrevin is a ubiquitous tetanus-toxin substrate homologous to a putative synaptic vesicle fusion protein. [see comments.</a> Nature. 364, 346-349 (1993).</li>
<li>Steegmaier, M., Klumperman, J., Foletti, D. L., Yoo, J. S., Scheller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle-associated+membrane+protein+4+is+implicated+in+trans-Golgi+network+vesicle+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Vesicle-associated membrane protein 4 is implicated in trans-Golgi network vesicle trafficking.</a> Molecular biology of the cell. 10, 1957-1972 (1999).</li>
<li>Zeng, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+synaptobrevin%2FVAMP+homologous+protein+%28VAMP5%29+is+increased+during+in+vitro+myogenesis+and+present+in+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">A novel synaptobrevin/VAMP homologous protein (VAMP5) is increased during in vitro myogenesis and present in the plasma membrane.</a> Molecular biology of the cell. 9, 2423-2437 (1998).</li>
<li>Galli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+tetanus+neurotoxin-insensitive+vesicle-associated+membrane+protein+in+SNARE+complexes+of+the+apical+plasma+membrane+of+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">A novel tetanus neurotoxin-insensitive vesicle-associated membrane protein in SNARE complexes of the apical plasma membrane of epithelial cells.</a> Molecular biology of the cell. 9, 1437-1448 (1998).</li>
<li>Wong, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endobrevin%2C+a+novel+synaptobrevin%2FVAMP-like+protein+preferentially+associated+with+the+early+endosome%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Endobrevin, a novel synaptobrevin/VAMP-like protein preferentially associated with the early endosome.</a> Molecular biology of the cell. 9, 1549-1563 (1998).</li>
</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Das Originalbild Zellfusion Assay 6 bestimmt SNARE-vermittelte Zellfusion Ereignisse durch Fluoreszenzmikroskopie. Hier beschreiben wir eine innovative Assay, SNARE-vermittelte Zellfusion Ereignisse quantifiziert durch aktivierte Ausdruck β-Galactosidase und spektrometrische Messung. Unter Verwendung dieses Tests analysieren wir routinemäßig 15-20 v-und t-SNARE-Kombinationen in einem einzigen Experiment. Mittels Durchflusszytometrie zur SNARE-Expression auf der Zelloberfläche zu messen, zu titrieren wir die E...

<table border="1"><tbody><tr><td> Namen von Reagenz und Ausrüstung </td><td> Firma </td><td> Katalognummer </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 12800-017 </td></tr><tr><td> COS-7-Zellen </td><td> ATCC </td><td> CRL-1651 </td></tr><tr><td> Tunicamycin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T7765-5MG </td></tr><tr><td> pTet-Off </td><td> Clontech </td><td> K1620-A </td></tr><tr><td> pBI-G </td><td> Clontech </td><td> 6150-1 </td></tr><tr><td> Lipofectamin </td><td> Invitrogen </td><td> 18324-012 </td></tr><tr><td> Enzymfreien Zelldissoziationslösung </td><td> Invitrogen </td><td> 13151-014 </td></tr><tr><td> Kaninchen anti-tet Repressor polyklonalen Antikörpers </td><td> Millipore </td><td> AB3541 </td></tr><tr><td> FITC-konjugiertem Esel-anti-Maus-IgG (H + L) </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> 715-095-150 </td></tr><tr><td> Laser Scanning konfokalen Mikroskop </td><td> Olymp </td><td> FV1000 </td></tr><tr><td> FACSCalibur Durchflusszytometer </td><td> BD Biosciences </td><td></td></tr><tr><td> β-Galactosidase-Enzym-Assay-System mit Reporter Lysis Buffer </td><td> Promega </td><td> E2000 </td></tr><tr><td> Modell 100-40 UV-VIS Spektralphotometer </td><td> Hitachi </td><td> C740843 </td></tr></tbody></table>

analyse der snare-vermittelte membranfusion verwendung eines enzymatischen cell fusion assay

Analysis of SNARE-mediated Membrane Fusion Using an Enzymatic Cell Fusion Assay

Die Interaktionen von SNARE (s oluble N-Ethylmaleimid-sensitiver Faktor a ttachment Protein re Rezeptor)-Proteine ​​auf Vesikeln (v-SNARE) und Zielmembranen (t-SNAREs) katalysieren intrazellulären Vesikelfusion 1-4. Rekonstitution Assays sind für Sezieren des Mechanismus und Regulation des SNARE-vermittelte Membranfusion 5. In einer Zellfusion Assay 6,7 sind SNARE-Proteine ​​ektopisch an der Zelloberfläche exprimiert wird. Diese &quot;umgedreht&quot; SNARE-Proteine ​​Laufwerk Zell-Zell-Fusion, die belegen, dass SNAREs ausreichen, um Zellmembranen fusionieren werden. Weil der Zellfusion Assay auf mikroskopische Analyse basiert, ist es weniger effizient, wenn verwendet, um mehrere v-und t-SNARE Wechselwirkungen quantitativ zu analysieren. Hier beschreiben wir einen neuen Assay 8, SNARE-vermittelte Zellfusion Ereignisse quantifiziert durch aktivierte Ausdruck β-Galactosidase. Zweidas Tetracyclin-gesteuerten Transaktivator (tTA) und ein Reporterplasmid, das die LacZ-Gen unter Kontrolle des Tetracyclin-Response-Element (TRE-LacZ) kodiert: Komponenten des Tet-Off Genexpressionssystem 9 sind als eine Auslese-System verwendet. Wir transfizieren tTA in COS-7 Zellen, die umgedreht V-SNARE-Proteine ​​auf der Zelloberfläche (v-Zellen) und transfizieren TRE-LacZ in COS-7 Zellen, die umgedreht T-SNARE-Proteine ​​auf der Zelloberfläche (t-Zellen) . SNARE-abhängigen Fusion der v-und t-Zellen führt zur Bindung von tTA an TRE, die transkriptionale Aktivierung von LacZ und Expression von β-Galactosidase. Die Aktivität von β-Galactosidase wird quantifiziert unter Verwendung eines kolorimetrischen Verfahren durch Absorption bei 420 nm auf. Die Vesikel-assoziiertes Membranproteine ​​(Vamps) sind v-SNAREs, die in verschiedenen Post-Golgi vesikulären Kompartimenten befinden 10-15. Durch Expression VAMPS 1, 3, 4, 5, 7 und 8 auf dem gleichen Niveau, zu vergleichen wir ihre MembranfusionAktivitäten unter Verwendung des enzymatischen Zellfusion Assay. Basierend auf spektrometrische Messung, bietet dieser Test einen quantitativen Ansatz zur Analyse von SNARE-vermittelte Membranfusion und für High-Throughput-Studien.

Um eine quantitative Zellfusion Assay zu entwickeln, nutzen wir die starke Aktivierung der Transkription durch die Bindung von tTA an TRE. In Abwesenheit von tTA ist Transkription des LacZ-Gens in TRE-LacZ still. Wenn tTA vorhanden ist, bindet es an den TRE und aktiviert die Transkription der LacZ. Abbildung 1 zeigt ein Flussdiagramm der enzymatischen Zellfusion Assay. tTA in v-Zellen transfiziert, die Ausdruck v-SNARE-Proteine ​​auf der Zelloberfläche und TRE-LacZ in...

Wir haben eine Zellfusion Assay, SNARE-vermittelte Membranfusion Ereignisse quantifiziert durch aktivierte Ausdruck β-Galactosidase entwickelt.

Analyse der SNARE-vermittelte Membranfusion Verwendung eines enzymatischen Cell Fusion Assay

Die Interaktionen von SNARE-Proteinen (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor) auf Vesikeln (v-SNAREs) und auf Zielmembranen ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, durch Aktivierung der Expression von Beta-Galacto vermittelte Zellfusionen zu quantifizieren. Dies wird erreicht, indem zunächst V- und T-SNARE-Proteine ektoptisch an der Oberfläche von Cost-7-Zellen exprimiert werden. Der nächste Schritt des Verfahrens besteht darin, die Zellen, die V-SNARE-Proteine exprimieren, mit denen zu kombinieren, die T-SNARE-Proteine exprimieren.Dies führt zu einer SNARE-vermittelten Zellfusion und der aktivierten Expression von Beta-Galacto. Letztendlich wird die durch Zellfusion induzierte Beta-Galacto-Aktivität mittels eines Spektrophotometers gemessen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie dem mikroskopischen SAL-Region-Assay besteht darin, dass sie mehrere SNARE-Kombinationen analysieren kann.Quantitativ betrachtet, obwohl diese Methode verwendet werden kann, um den Mechanismus und die Regulation der SNARE-vermittelten Membranfusion zu untersuchen, lässt sie sich auch für Hochdurchsatzstudien anwenden. Die Durchführung der Prozedur wird Doc Na Hassan, ein Postdoktorand, und David Humphrey, ein Techniker aus meinem Labor, am Tag vor der Transfektionsbeladung demonstrieren.24-Well-Platten mit 12-Millimeter-Glas-Deckgläsern vorbereiten, wobei zwei Wells für jede Kombination von Zellen, die eindeutige Plasmide in dem Experiment auf diesen Deckgläsern exprimieren, vorgesehen werden. 30.000 Cost7-Zellen, die in DMEM ergänzt mit 4,5 Gramm pro Liter Glukose und 10 % FBS kultiviert wurden, in jedes Well geben, um sie zu transfizieren. Zu jedem Well ein Viertel Mikrogramm des TTA-Plasmids und einen Satz Expressionsplasmide hinzufügen.Umgekehrte Proteine von Interesse, in diesem Fall umgekehrte Vamps, um die T-Zellen zu transfizieren: Geben Sie ein Viertel Mikrogramm des Plasmids, das TRE-Lacks-Z kodiert, sowie den komplementären Satz an Plasmiden, die die umgekehrten Proteine von Interesse kodieren, hinzu. In diesem Fall SNAP-25, Syntaxin-1 und Syntaxin-4. Transfizieren Sie nun die CoSt-7 mit Lipofektamin gemäß den Anweisungen des Herstellers und kultivieren Sie die Zellen für 24 Stunden. 24 Stunden nach der Transfektion fixieren Sie die Zellen 10 Minuten lang in supplementiertem Paraformaldehyd. Nach der Fixierung spülen Sie die Zellen dreimal mit PBS++ ab und blockieren Sie die Zellen anschließend 30 Minuten lang mit supplementiertem FBS.Nach der Blockierung inkubieren Sie die Zellen 30 Minuten lang mit dem monoklonalen Anti-mic-Antikörper 9E10. Anschließend waschen Sie die Zellen viermal mit PBS++ und inkubieren sie dann eine Stunde lang mit fluoreszenzmarkierten sekundären Antikörpern in einer Verdünnung von 1:500. Nach weiteren vier Waschungen mit PBS++ mounten Sie die markierten Zellen in einem handelsüblichen Anti-Fade-Reagenz.Die Zellen sind nun bereit für die konfokale Mikroskopie. Am Tag vor der Transfektion säen Sie 1,2 Millionen costs-sieben-Zellen in jede 100-Millimeter-Zellkulturschale und 200.000 costs-sieben-Zellen in jede Vertiefung einer 6-Loch-Platte für jede zu analysierende Plasmidkombination. Bereiten Sie eine Vertiefung vor, kultivieren Sie die Zellen 24 Stunden lang. Am nächsten Tag fügen Sie die Plasmide für die Transfektion hinzu: Für V-Zellen transfizieren Sie ein Plasmid, das das umgekehrte Protein der Untersuchung exprimiert, sowie fünf Mikrogramm p-tet-off zu den Zellen in jeder 100-Millimeter-Kulturschale.Transfizieren Sie Kontrollzellen in einer 100-Millimeter-Kulturschale mit einem leeren Vektor und P te off in denselben relativen Konzentrationen wie die V-Zellen. Nachdem alle Plasmide den V-Zellen und den Kontrollzellen hinzugefügt wurden, geben Sie Tcommycin zu diesen Vertiefungen, um die N-Glykosylierung von Vamps zu verhindern. Transfizieren Sie in jeder Vertiefung der 6-Loch-Platten die T-Zellen mit einem Mikrogramm PBIG zusammen mit den komplementären Plasmiden, die die Proteine von Interesse exprimieren.Transfizieren Sie nun die Cost-Sieben-Zellen gemäß den Herstelleranweisungen mit Lip. Kultivieren Sie die Zellen anschließend 24 Stunden lang. 24 Stunden nach der Transfektion lösen Sie die V-Zellen mithilfe eines enzymfreien Zell-Dissociationspuffers von ihren Kulturschalen ab. Spülen Sie die Zellen zunächst einmal mit 20 Millilitern PBS ab.Dann fünf Milliliter enzymfreies Dissoziationspuffer hinzufügen. Nach einer 10-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur lösen sich die Zellen durch kräftiges Klopfen auf die Platte; überprüfen Sie unter dem Mikroskop, ob sie sich abgelöst haben. Wenn weniger als die Hälfte der Zellen abgelöst ist, weitere fünf Minuten warten und die Platte erneut antippen.Setzen Sie die Inkubation im Ablösungspuffer fort, bis mehr als die Hälfte der Zellen abgelöst hat. Anschließend zählen Sie die V-Zellen mit einem Hämozytometer. Danach resuspendieren Sie die V-Zellen in einem konzentrierten Heis-Puffer-DMEM auf eine Konzentration von etwa 480.000 Zellen pro Milliliter.Fügen Sie nun ein Milliliter der resuspendierten V-Zellen in jede Vertiefung mit den T-Zellen hinzu und stellen Sie die Platten wieder in den Inkubator. Nach sechs, zwölf oder 24 Stunden gemeinsamer Kultivierung waschen Sie die Zellen mit PBS und geben Lysepuffer hinzu. Danach lösen Sie die Zellen von den Vertiefungen ab und überführen sie in Röhrchen zur Zentrifugation.Nach der Zentrifugation das Überstand auf ein neues Röhrchen überführen und die Expression von Beta-Galacto mit einem im Handel erhältlichen Assay entsprechend den Herstelleranweisungen messen. Achten Sie während dieses Protokolls darauf, die Cholera-metrische Reaktion nach 90 Minuten durch Zugabe von einmolarer Natriumcarbonatlösung zu stoppen, um die Ergebnisse auszuwerten. Die Absorption bei 420 Nanometern in einem Spektrophotometer messen. Wenn CO7-Zellen mit umgekehrten SNARE-Plasmiden transfiziert wurden, wurden umgekehrte SNARE-Proteine an der Zelloberfläche exprimiert.Mittels Durchflusszytometrie wurden die Expressionslevel von SNARE-Proteinen an der Zelloberfläche gemessen. Um ihre Membranfusionskapazitäten vergleichen zu können, mussten VAMPs auf gleichem Level exprimiert werden. Daher wurde die Konzentration jedes verwendeten SNARE-Plasmids für die Transfektion titriert und für die Transfektion optimiert.Unter solchen Bedingungen wurden VAMPs 1, 3, 4, 5, 7 und 8 sowie Syntaxin 1 und 4 jeweils auf dem gleichen Niveau an der Zelloberfläche exprimiert; die neuronalen SNAREs, die die synaptische Exozytose vermitteln, wurden verwendet, um die Durchführbarkeit des Assays zu testen. Tatsächlich wurde eine starke Beta-Galaktosidase-Expression nachgewiesen, wenn V-Zellen, die VAMP 2 exprimieren, mit T-Zellen, die Syntaxin 1 und SNAP-25 exprimieren, kombiniert wurden. Wenn jedoch entweder VAMP 2 oder SNAP-25 nicht exprimiert wurden, wurde lediglich eine basale Beta-Galaktosidase-Aktivität detektiert, was darauf hindeutet, dass Zellfusion und Expression der Beta-Galaktosidase insgesamt auf den Wechselwirkungen von v- und t-SNAREs beruhen. Syntaxin 1, SNAP-25, VAMP 1, VAMP 3 und VAMP 8 wiesen vergleichbare und die höchsten Fusionsaktivitäten auf.Im Gegensatz dazu deutet die Grundlinien-Beta-GAL-Aktivität darauf hin, dass die Protein-Kombination keine Membranfusion verursacht, wie sie beispielsweise zwischen VAMP5 und SYNTAXIN1 stattfindet. SNAP25. Während der Durchführung des enzymatischen Fusionsassays ist es wichtig, Unicamycin hinzuzufügen, um die N-Glykosylierung von ESNA-Proteinen zu verhindern, und DTT hinzuzufügen, um die Bildung von Disulfidbrücken zwischen ESNA-Proteinen zu verhindern.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man den Zellfusionsassay durchführt.

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Methode zur Messung des Viral Fusion Kinetics auf der Single Particle Stufe

In diesem Video zeigen wir effiziente Elektrofusion von...

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Dieses Protokoll beschreibt ein konfokales Bildgebungsverfahren zum Nachweis von drei Fusionsmodi in rindischen Nebennierenchromaffinzellen. Diese Fusionsmodi umfassen 1) Close-Fusion (auch Kiss-and-Run genannt), bei der sich die Fusionspore öffnet und schließt, 2) Stay-Fusion, bei der die Fusionspore geöffnet und die geöffnete Pore erhalten bleibt, und 3) Shrink-Fusion, einschließlich der Schrumpfung der fusionierten Vesikel.

Konfokale Mikroskopie zur Messung von drei Modi der Fusionsporendynamik in Nebennierenchromaffinzellen

Lernen Sie einen enzymatischen Zellfusions-Assay zur Quantifizierung SNARE-vermittelter Membranfusionen mittels β-Galactosidase-Expression. Diese Methode ermöglicht die Analyse verschiedener SNARE-Kombinationen in COS-7-Zellen.

Analyse der SNARE-vermittelte Membranfusion Verwendung eines enzymatischen Cell Fusion Assay

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