Gezielte Labeling von Neuronen in einem bestimmten Functional Micro-Domäne des Neocortex durch Kombination Intrinsic Signal-und Zwei-Photonen-Imaging

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Mikrodomänen in einer funktionellen Karte präzise anzuvisieren, um die Struktur und Funktion von Neuronen mit hoher Auflösung zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst eine intrinsische Signalbildgebung über einen großen Bereich des Kortex durchgeführt wird, um eine Karte des interessierenden Stimulusmerkmals zu erhalten. Der zweite Schritt besteht darin, die genaue Position in der Karte zu bestimmen, die für die hochauflösende Photonenbildgebung angestrebt werden soll.

Nach sorgfältiger Positionierung der mit Fluoreszenzfarbstoff beladenen Pipette werden die Neuronen mit dem Fluoreszenzmarker markiert. Schließlich werden hochauflösende bis photonenreiche Bilder von neuronalen Reaktionen oder Strukturen gesammelt. Letztendlich kann eine intrinsische Signalmerkmalskarte verwendet werden, um eine Region von Interesse zu finden, wie z. B. eine Orientierungswindrad-Singularität, die dann für die Untersuchung mit Einzelneuronenauflösung anvisiert werden kann.

Der Hauptvorteil dieses Protokolls besteht darin, dass man den Kortex mit demselben Mikroskopaufbau und nur wenigen schnellen Anpassungen am System auf verschiedenen räumlichen Skalen abbilden kann. Dies ermöglicht es, diese Techniken zu kombinieren, um die intrinsische Signalkarte mit Kursauflösung als Leitfaden für die Auswahl einer Region von Neuronen zu verwenden, die mit Fluoreszenzsonden für eine hochauflösende Bildgebung markiert werden soll. Das Tier wurde gemäß einem von einem institutionellen Tierpflegeausschuss genehmigten Protokoll betäubt, und der Schädel wurde freigelegt und gereinigt.

Zahnzementmischung wurde verwendet, um eine Kopfplatte aus Edelstahl mit einer rechteckigen Öffnung in der Mitte am Schädel zu befestigen. Eine Metallkammer auf der Oberseite der Kopfplatte dient als Reservoir für die Bildgebung mit dem Wasserimmersionsobjektiv. Die Kopfplatte wurde mit Metallpfosten auf einem XY-Tisch befestigt.

Verwenden Sie einen Zahnbohrer, um eine große Knochenfläche innerhalb der rechteckigen Öffnung der Kopfplatte auszudünnen. Auftragen von Knochenwachsen, die erforderlich sind, um gelegentliche Blutungen zu stoppen. Der dünne Bereich muss sich über die Grenzen der geplanten Kraniotomie hinaus erstrecken.

Bohren Sie dann für die Kraniotomie einen zwei mal zwei Millimeter großen quadratischen Umriss in den Knochen. Spülen Sie die Kammer regelmäßig mit frischer künstlicher Gehirn-Rückenmarksflüssigkeit, um Knochensplitter zu entfernen und die Wärmeabgabe an die darunter liegende Hirnrinde zu minimieren. Hebe nun den Knochen mit einer Zange Nummer drei an.

Verwende eine Pinzette mit der Nummer fünf und eine Vana-Federschere, um die oberen Schichten der Dura zu entfernen, wobei die untere Schicht intakt bleibt. Die letzte Schicht der Dura ist transparent und die Schalengefäße sollten gut sichtbar sein. Tragen Sie einen Tropfen warmes 2%aeros auf, das in A CSF gelöst ist, und legen Sie sofort ein Deckglas über die Kraniotomie.

Zuerst ein mit A CSF getränkter Gelschaum um die Außenseite des Deckglases, um zu verhindern, dass das Agros während der intrinsischen Signalbildgebung austrocknet. Befestigen Sie dann die CCG-Kamera mit intrinsischer Signalbildgebung an der Standard-C-Halterung oben auf den beiden Fotomikroskopen und platzieren Sie eine Beleuchtungslichtquelle auf dem Lufttisch in der Nähe der XY-Tischposition und befestigen Sie den Lichtleiter über der Kraniotomie. Ziehen Sie den primären dichroitischen Spiegel und den Spiegel unterhalb der Seamount-Öffnung zurück, so dass das reflektierte rote Licht, das für intrinsische Signale benötigt wird, direkt von der Kraniotomie zur CCD-Kamera gelangt.

Setzen Sie einen Infrarotfilter in den Strahlengang ein, um eine Erwärmung der Rinde zu verhindern. Platzieren Sie dann einen Filter, der grünes Licht durchlässt, und zeichnen Sie ein digitales Referenzbild der kortikalen Oberflächenblutgefäße auf. Bewegen Sie als Nächstes den Z-Fokus auf 500 Mikrometer unter der kortikalen Oberfläche.

Ersetzen Sie den grünen Filter durch einen roten Filter, um den Kortex für die Messung intrinsischer Signale zu beleuchten. Stellen Sie sicher, dass der Kortex gleichmäßig beleuchtet ist. Schirmen Sie die Kraniotomie vor dem von der visuellen Reizanzeige erzeugten Licht ab und präsentieren Sie eine Sequenz von visuellen Reizen und zeichnen Sie Reflexionsdatenbilder auf, um eine Orientierungskarte zu erstellen. Sammeln Sie innerhalb von 10 Minuten Daten, die vier Wiederholungen einer Sequenz von acht Reizen mit vier Orientierungen und zwei Richtungen für jede Orientierung entsprechen.

Analysieren Sie nun die intrinsischen Signaldaten, um eine Farbkarte mit falscher Ausrichtung zu generieren, wie hier zu sehen. Wählen Sie dann potenzielle Zielregionen für die Zwei-Photonen-Markierung von Neuronen aus. Zum Beispiel zeigen Orientierungs-Windrad-Singularitäten Punkte in der Karte, an denen alle bevorzugten Orientierungen zusammenlaufen.

Überlagern Sie als Nächstes die Orientierungskarte und das Bild des kortikalen Oberflächengefäßsystems und verwenden Sie das Layout der funktionellen Domänen und die Position großer Oberflächengefäße, um ein Ziel auszuwählen, wobei Stellen mit großen Blutgefäßen und Arterien vermieden werden. Bereiten Sie die fluoreszierenden D-Lösungen vor und ziehen Sie eine Pipette mit langer Verjüngung gemäß den Anweisungen im schriftlichen Protokoll. Laden Sie fünf Mikroliter der Farbstoffmischung in die Pipette.

Entfernen Sie dann die letzte Schicht Dura, um das Einführen der Pipette zu erleichtern und Zwei-Photonen-Bilder von höchster Qualität zu erhalten, wie in diesem Diagramm dargestellt. Die Pipette muss in einem Winkel von 30 Grad in den Kortex getrieben werden, um zwischen Kammer und Objektiv zu gelangen. Daher befindet sich die kortikale Oberflächenposition der Pipetteneintrittsposition nicht direkt über der Zielregion.

Um beispielsweise eine Zielregion 200 Mikrometer unterhalb der kortikalen Oberfläche zu markieren, beträgt die Eintrittsposition der Pipette auf der kortikalen Oberfläche etwa 350 Mikrometer lateral der Zielposition. Bewegen Sie den XY-Tisch, um die Eintrittsposition der kortikalen Oberfläche unter dem 20 x oder 40 x Objektiv zu zentrieren. Sobald die Eintrittsposition unter dem Objektiv zentriert ist, erhöhen Sie die Z-Position des Objektivs um zwei Millimeter.

Schalten Sie dann das grüne Epi-Fluoreszenzlicht ein, visualisieren Sie den roten Alexa-Farbstoff in der Pipette und bewegen Sie die Pipette, bis sich die Spitze über der Eintrittsposition der kortikalen Oberfläche befindet. Während Sie die Pipettenspitze durch das Okular des Mikroskops mit Hellfeldbeleuchtung betrachten, senken Sie die Pipette ab, bis die Spitze die gewünschte Eintrittsposition auf der kortikalen Oberfläche erreicht. Entfernen Sie anschließend das Objektiv und verwenden Sie fusselfreie Absorptionsstangen, um überschüssige zerebrale Rückenmarksflüssigkeit aus der Kraniotomie abzuleiten und den angrenzenden Knochen zu trocknen.

Tragen Sie dann einen Tropfen warmes 3%arose auf, gelöst in A CSF, um den Kortex zu stabilisieren. Sobald der Aros erstarrt ist, setze ein 40 x Objektiv ein und fülle die Kammer wieder mit einem Liquor. Verwenden Sie anschließend die diagonale Achse des Mikromanipulators, um die Pipette zu bewegen, bis die Spitze die gewünschte Tiefe in der Hirnrinde erreicht.

Gelegentliche Druckstöße des DI-Gemischs verringern die Wahrscheinlichkeit, dass die Pipettenspitze verstopft, wenn die Pipette die zweite Schicht erreicht. Drei kleine Stöße des DI-Gemischs erhellen den extrazellulären Raum und zeigen eine dichte Ansammlung von kreisförmigen Zellkörpern als dunkle Schatten zum Laden von neuronalen Körpern in einer Kortexkugel mit einem Durchmesser von 300 bis 600 Mikrometern. Injizieren Sie das Dix-Gemisch mit 30 bis 90 Impulsen in den extrazellulären Raum. Jeder Impuls eine Sekunde, zwei bis 10 PSI.

Warten Sie nach Abschluss der Injektion einige Minuten, dann entfernen Sie die Pipette und das Objektiv. Der fluoreszierende Kalziumindikator wird innerhalb einer Stunde vollständig von den Neuronen aufgenommen. Entfernen Sie abschließend die für den Download verwendeten Aros und spülen Sie die Aufnahmekammer aus.

Geben Sie einen kleinen Tropfen von zwei bis 3% auf die Oberfläche und legen Sie schnell ein Deckglas über die Kraniotomie. Setzen Sie ein Objektiv mit hohem NA 20 x in den Objektivhalter ein und zentrieren Sie die beschriftete kortikale Region unter dem Objektiv neu. Mit dem XY-Tisch wird die Kraniotomie von Fremdlichtquellen abgeschirmt und hochauflösende Bilder der markierten Neuronen in vivo aufgenommen.

Alternativ kann die Einzelzell-Elektroporation zur Untersuchung der dendritischen Morphologie oder der funktionellen Bildgebung von Dendriten verwendet werden. Bei dieser Methodik werden die DI nach dem schriftlichen Protokoll erstellt. An der entsprechenden Stelle des Eingriffs wird dann die Pipettenspitze neben einer neuronalen Zellkörpermembran positioniert und mit einer Axo ein bis drei Impulse angelegt.

Die unmittelbare Füllung des Neurons mit Farbstoff lässt sich mit der Zwei-Photonen-Mikroskopie gut sichtbar machen. Dieses Bild zeigt einen mit zwei Photonen abgebildeten Bereich, der Zellkörper zeigt, die mit dem fluoreszierenden Kalziumindikator OGB 1:00 AM in der visuellen Kortexschicht zwei drei markiert sind, der Maßstabsbalken stellt 100 Mikrometer dar. Dieses Bild zeigt die Orientierungspräferenz einzelner neuronaler Zellkörper von der gleichen Stelle, die im vorherigen Bild gezeigt wurde.

Eine organisierte Karte der bevorzugten Stimulusorientierung ist um die Windradsingularität herum zu sehen, die in der abgebildeten Region zentriert war. Hier sehen wir die Orientierungskarte, die mit intrinsischer Signalabbildung erhalten wurde. Das schwarze Quadrat entspricht dem Bereich, der im vorherigen Bild mit zwei Photonen zu sehen ist.

Dieses Bild zeigt die Dendriten und den Zellkörper eines einzelnen Neurons, überlagert mit der Orientierungskarte. Das Neuron wurde mit Alexa Etage 5 94 unter Zwei-Photonen-Führung elektroporiert. Da der Z-Stapel in vivo gesammelt und dendritische Prozesse offline mit Neuro Lucid als Software verfolgt wurden.

Die Orientierungskarte wurde mit Hilfe von intrinsischer Signalbildgebung vor der Einzelzell-Elektroporation erstellt. Der Maßstabsbalken stellt 100 Mikrometer dar. Diese 10 Mikrometer große Z-Projektion von der kortikalen Schicht eins zeigt apikale Dendriten.

Die roten Pfeile zeigen Stacheln entlang der Dendriten, während diese 10-Mikron-Z-Projektionen aus der kortikalen Schicht zwei drei basale Dendriten mit Stacheln zeigen, die durch rote Pfeile und Axone durch weiße Pfeile gekennzeichnet sind. Diese Methode ist nützlich, um funktionelle Karten im Kortex auf verschiedenen räumlichen Skalen zu untersuchen und Neuronen in einem bestimmten Bereich von Interesse genau ins Visier zu nehmen. Innerhalb der Karte haben wir die Anwendung der Methode zur Untersuchung orientierungsselektiver Karten demonstriert, aber sie kann auf andere visuelle Merkmalskarten wie Netzhaut, Toppy, Augendominanz und Richtung erweitert werden, oder auf andere sensorische Modalitäten, die funktional organisierte Karten haben, wie z. B. solche, die die Somato-Empfindung oder das Hören kodieren.