Name: Gezielte Labeling von Neuronen in einem bestimmten Functional Micro-Domäne des Neocortex durch Kombination Intrinsic Signal-und Zwei-Photonen-Imaging (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-12T11:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: Erfahren Sie die präzise Markierung von Neuronen in funktionellen Mikrodomänen des Neocortex durch Kombination von intrinsischer Signalbildgebung und Zwei-Photonen-Mikroskopie. Diese Methode ermöglicht hochaufgelöste Studien neuronaler Strukturen.

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Gnade Dion für das Verfolgen der Dendriten in 5A gezeigt;; Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem National Eye Institute R01EY017925 und R21EY020985 und Finanzierung von den Dana &amp; Whitehall Foundations PK Wir danken auch Matthew Petrella für die Unterstützung bei chirurgischen Eingriffen unterstützt und Pratik Chhatbar für Anmerkungen zum Manuskript.

Ein. Chirurgische Vorbereitung <ol><li> Induzieren Anästhesie und kontinuierlich überwachen Herzfrequenz, endexspiratorischen CO 2, EEG und Temperatur. Alle Verfahren wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee der Medical University of South Carolina genehmigt und wurden auf die wir zuvor veröffentlichten 9,15 basiert. </li><li> Setzen Sie den dorsalen Oberfläche des Schädels, indem die Haut mit einem Skalpell. Sezieren die Bindegewebe über dem Knochen mit einer Brudon Kürette. Reinigen Sie die Knochen mit Wattestäbchen Applikatoren und Baumwollgaze. Bewerben Knochenwachs (bei Bedarf) auf den Schädel, gelegentlich Blutungen durch kleine Emissarien stoppen. </li><li> Bringen Sie einen Titan oder Edelstahl Kopfplatte auf den Schädel (über die Region von Interesse, wo die Kraniotomie durchgeführt werden), indem Zahnzement mit schwarzer Farbe (siehe Materialien) gemischt. Eine rechteckige Öffnung in der Mitte der Kopfplatte bietet Zugang für den Kraniotomie und optische Bildgebung. Bringen Sie ein Metall-Kammer auf der Oberseite des Kopfes Platte. Diese Kammer wird als Fluidreservoir zur Bildgebung dienen mit dem Wasser Immersionsobjektivlinse. </li><li> Sichern Sie die Kopfplatte mit einem xy mit Metall-Beiträge. </li><li> Auszudünnen einen großen Bereich des Knochens innerhalb der rechteckigen Öffnung der Kopfplatte durch Verwendung eines Dentalbohrers. Der zu verdünnen muß gut über die Grenzen des geplanten Kraniotomie erstrecken. Die dicke Schädel des nicht-Nagetier-Säuger muss ausgedünnt, wenn Bilder mit hoher Auflösung aus der Großhirnrinde erworben werden, weil am Ort Kraniotomie, die Dicke des Knochens wird die Dicke der Agarose zwischen dem Deckglas und neokortikalen Oberfläche diktiert werden (siehe unten) . </li><li> Bohren eines 2 x 2 mm quadratischen Umriss im Knochen für die Kraniotomie. Spülen Sie die Kammer regelmäßig mit frischen künstliche Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF) an Knochen Scherben zu entfernen und zu minimieren Wärmeabgabe an den zugrunde liegenden Kortex. Bewerben Knochenwachs nach Bedarf auf gelegentliche Blutung zu stoppen. </li><li> Lift der Knochen Klappe mit einem # 3 Pinzette. </li><li> Entfernen Sie alle, aber die untere Schicht der Dura mit einer feinen Pinzette (# 5CO) und Vannas Frühjahr Schere. Die Dura in Nicht-Nagetier Säugetieren ist dick und undurchsichtig, kann aber in verschiedenen Schichten entfernt werden. Blutung ist selten, kann aber mit Gelfoam gestoppt werden und kein Blut Rückstände sollten vorsichtig aus dem verbleibenden Schicht der Dura mit einer Pinzette und Spülen mit ACSF entfernt werden. Die letzte Schicht der Dura ist transparent und Pia Schiffe sollten deutlich sichtbar sein durch. Verlassen dieses letzte Schicht der Dura intakt während intrinsische Signal Bildgebung die Erfolgsrate der Bulkbeladung fluoreszierender Kalzium-Indikatoren für die anschließende Zwei-Photonen-Imaging-Phase des Experiments zu erhöhen (siehe Diskussion). </li><li> Geben Sie einen Tropfen warmen 2% Agarose (gelöst in ACSF) und sofort einen Deckglas über die Kraniotomie. Prüfen der Kraniotomie um sicherzustellen, dass respiratorischen und Herz-Kreislauf Pulsationen minimal sind durch Verwendung eines chirurgischen Präpariermikroskop oder die Okulare des zweiteiligenPhotonen-Mikroskop im Hellfeld-Modus. </li></ol> 2. Intrinsic Signal Optical Imaging <ol><li> Hinzufügen Gel-Schaum mit ACSF um die Außenseite des Abdeckglases, um die Agarose von Trocknung während intrinsische Signal Bildgebung verhindern eingeweicht. </li><li> Bringen Sie die intrinsische Signal Imaging CCD Kamera mit dem Standard-C-Mount-Anschluss auf der Oberseite des Zwei-Photonen-Mikroskop (Abbildung 1). Legen Sie die Beleuchtungslichtquelle in der Luft Tisch in der Nähe der xy-Ebene (Abbildung 1A). Position und sichern Sie die Lichtleiter über die Kraniotomie und Kopfplatte / Kammer (Abbildung 1B). Einfahren des primären dichroitischen Spiegel und die unterhalb der C-Mount-Port, so dass das reflektierte rote Licht für intrinsische Signale benötigt wird direkt von der Kraniotomie zur CCD-Kamera (1C-D). Mit dem 4x Luftobjektiv (0,13 NA, 17 mm WD), einem 2 x 2 mm Sichtfeld ist für intrinsische Signal Bildgebung zur Verfügung. </li><li> Legen Sie eine Wärme-Filter in der light Pfad, um den Kortex von Erwärmung zu verhindern. Verwenden eines Filters, der grünes Licht (546 nm Mittelpunkt λ) und Aufzeichnen eines digitalen Referenzbildes der kortikalen Oberfläche Blutgefäße hindurchgeht. </li><li> Bewegen Sie den z Fokus auf 500 um unterhalb der kortikalen Oberfläche. Verwenden Sie einen roten Filter (630 nm Zentrum λ), um den Cortex zur Messung intrinsische Signale zu beleuchten. Positionieren Sie die Lichtleiter, so dass die kortikale Oberfläche gleichmäßig ausgeleuchtet wird. Abschirmen Kraniotomie aus dem Licht von dem visuellen Stimulus-Display hergestellt. Präsentieren Sie eine Abfolge von visuellen Reizen und aufzeichnen Reflexionsdaten Bildern. Um eine Ausrichtung der Karte innerhalb von 10 min zu erzeugen, Daten erfassen, welche 4 Wiederholungen einer Sequenz von 8 Stimuli (4 Orientierungen und zwei Richtungen für jede Richtung). </li><li> Analysieren Sie die intrinsische Signal Daten an eine falsche Farbe Orientierungsplan generieren. Wählen potenziellen Zielregionen für Zwei-Photonen-Kennzeichnung von Neuronen, zB Orientierung pinwheel Singularitäten - Punkte in der Karte, woAlle bevorzugten Orientierungen konvergieren (Abbildung 2A). Überlagern die Ausrichtung der Karte und das Bild der kortikalen Oberfläche Gefäßsystem (2B-C). Verwenden das Layout der funktionalen Domänen und die Lage der großen Oberfläche Gefäße, um ein Ziel auszuwählen, die Vermeidung Bereichen mit großen Blutgefäßen und Arteriolen 15. </li></ol> 3. Bulk Loading fluoreszierender Kalzium-Indikatoren <ol><li> Vorbereiten einer Lösung aus 20% Pluronic / DMSO nach Zugabe von 1 g Pluronic in 5 ul DMSO. Das Gemisch wird bei 60 ° C für 10 min bis zum vollständigen Lösen des Pluronic. Man läßt das Gemisch auf Raumtemperatur abkühlen. Add 4 ul des Pluronic / DMSO-Gemisch zu einer 50 ug Fläschchen der fluoreszierende Kalzium-Indikator Oregon Green 488 Bapta-1 AM (OGB-1 AM). Dann fügen Sie 1 ul einer roten Farbstoff (Alexa Fluor 594, 2 mM Stammlösung) und 35 ul der Pipette Lösung (siehe Materialien) für eine Endkonzentration von 1 mM OGB-01.00. Beschallen die Lösung für ½ Stunde inein gekühltes Wasserbad und dann Zentrifuge mit einer 0,45 um-Filter, um Verunreinigungen zu entfernen. </li><li> Ziehen Sie einen Langkegel Pipette mit einem äußeren Durchmesser der Spitze von 2,0-2,5 um. Beladung 5 ul der Farbstoffmischung in die Pipette. </li><li> Entfernen Sie die letzte Schicht, um Dura Pipette Einführen zu erleichtern und zu erhalten, die höchste Qualität Zwei-Photonen-Bildern. </li><li> Bestimmung der exakten Position auf der kortikalen Oberfläche daß die Pipette platziert werden muss, um sein Ziel in kortikalen Schicht 2/3 zu erreichen. Unsere vorgegebenen kortikalen Ziel ist ein Windrad Singularität in der Ausrichtung Karte (Abbildung 2). Die Pipette ist in die Rinde in einem 30 °-Winkel angetrieben werden, um zwischen der Kammerwand und dem Ziel passieren. Somit, um die Zielregion 200 um unterhalb der kortikalen Oberfläche bezeichnen, wird die Pipette Eingabeposition auf der kortikalen Oberfläche ungefähr 350 um quer zur Soll-Position (3 AB) sein. </li><li> Bewegen des XY-Tischs (an dem das Tier und die pipette Mikromanipulator platziert sind) für die Zentrierung der kortikalen Oberfläche Eintrittsposition unter dem Objektiv (3C). Verwenden Sie ein 20x oder 40x-Objektiv mit einem Arbeitsabstand (WD) von mindestens 3 mm (siehe Materialien), um sicherzustellen, dass die Pipette wird leicht in die Hirnrinde, ohne das Ziel oder den Knochen an der Wand entlang der Kraniotomie. Sobald der Eintrag Position unter dem Ziel zentriert ist, erhöhen die Z-Position des Ziels um 2 mm (Figur 3D). Mit der grüne Auflicht-Fluoreszenz Licht eingeschaltet, um den roten Farbstoff Alexa in der Pipette zu visualisieren, benutzt das diagonale Achse der Mikromanipulator, um die Pipette zu bewegen, bis ihre Spitze zentriert ist (und fokussiert) unter dem Objektiv unmittelbar oberhalb der kortikalen Oberfläche Eingabeposition ( Abbildung 3E). </li><li> Pipette senkrecht abzusenken (entlang der z-Achse), bis die Pipette erreicht den kortikalen Oberfläche (3F), die sich während kontinuierlich die Pipettenspitze durch die okulars des Mikroskops. Verwendung Hellfeldbeleuchtung sind die kortikalen Oberfläche Blutgefäße und verbleibende Meningen (pia und Arachnoidea) leicht sichtbar wie die Pipette den kortikalen Oberfläche nähert. Wenn die Pipette nicht erreicht den gewünschten Eintrag Position, heben Sie die Pipette und kalibrieren Targeting basierend auf den vaskulären Wahrzeichen an der kortikalen Oberfläche. </li><li> Entfernen Sie das Ziel, Wick überschüssige Liquor aus dem Kraniotomie und trocknen Sie die angrenzenden Knochen mit fusselfreien Absorption Speeren. Geben Sie einen Tropfen warm 3% igen (gelöst in ACSF), um den Kortex, sichtbar durch die Kraniotomie (3G) ist zu stabilisieren. In Nicht-Nagern, 3% Agarose notwendig Pulsationen für eine erfolgreiche Aufnahme von fluoreszierenden Farbstoffen durch Neuronen zu dämpfen. Für intrinsische Signal Abbildungsoptik nur 2% Agarose ist erforderlich, da die Kombination von 2% Agarose und dem Deckglas für die nötige Stabilität. Hier wird kein Deckglas des Farbstoff-Ladeschritt so 3% Agarose verwendet wirdnotwendig. Nach Erstarren der Agarose, legen Sie eine 40x-Objektiv (0,8 NA, 3,3 mm WD) und neu füllen den Raum mit ACSF. </li><li> Wechseln Sie von Hellfeld-, zwei-Photonen-Leser und suchen Sie die Pipettenspitze. Verwendung der diagonalen Achse des Mikromanipulators, die Pipette zu bewegen, bis ihre Spitze erreicht die gewünschte Tiefe in der Rinde (Abbildung 3H). Gelegentliche Druck Auswerfen puffs der Farbstoffmischung (ein paar psi, wobei jeder Impuls 0,1 sec) verhindern helfen Pipettenspitze verstopfen. Da Uhr OGB-1 nur sichtbar beim Betreten Zellen, ist der rote Farbstoff Alexa entscheidend für die Visualisierung der Pipettenspitze in der Hirnrinde. </li><li> Vor dem Versuch, Neuronen in kortikalen Schicht 2/3 mit der vollen Dosis von Farbstoff zu laden, erneute Fokussierung des Ziels auf der kortikalen Oberfläche, um die Tiefe der Pipettenspitze zu bestätigen und sicherzustellen, dass die Spitze an der Zielposition ist, basierend auf dem Layout Oberfläche der Blutgefäße. Wenn die Pipette in Layer 2/3, sollten kleine puffs der Farbstoffmischung leuchten dieextrazellulären Raum und zeigen eine dichte Montage von runden Zellkörper als dunkle Schatten. </li><li> Zum Laden neuronale Zellkörper in einer Sphäre des Cortex 300-600 Mikrometer Durchmesser, injizieren die Farbstoffmischung in den extrazellulären Raum mit 30-90 Pulsen, wobei jeder Impuls 1,0 sec, 2-10 psi. Die Impulse der Druck sollte nicht so stark sein, dass das Gewebe bewegt. Nach der Injektion abgeschlossen ist, warten Sie ein paar Minuten, dann entfernen Sie die Pipette und objektiv. Warten Sie 1 Stunde, damit der OGB-01.00 vollständig aufgewickelt werden von Neuronen. </li><li> Entfernen Sie die Agarose für den Farbstoff Be-und spülen Sie die Aufnahme Kammer. Setzen Sie einen kleinen Tropfen von 2-3% Agarose auf der Oberfläche und schnell platzieren ein Deckglas über die Kraniotomie. Da die Fluoreszenzfarbstoffe lichtempfindlich sind, vermeiden Überbelichtung des Kortex Hellfeld-oder epi-fluoreszierendes Licht. Legen Sie eine hohe NA (1,0) 20x-Objektiv in das Objektiv Halter und re-Zentrum der markierten kortikalen Bereich unter dem Objektiv mit der xy. Schirmen die Kraniotomie aus Extraneous Lichtquellen, zB visuellen Stimulus Display, unter Verwendung mehrerer Schichten aus Blackout Material. </li></ol> 4. Single-cell Elektroporation von Fluoreszenzfarbstoffen <ol><li> Für die Untersuchung dendritische Morphologie, bereiten eine Lösung von 100 uM Alexa Fluor 594 (1:20 Verdünnung in ACSF von 2 mM Alexa Fluor 594 Aktien). Für die funktionelle Bildgebung von Dendriten eine OGB Salz kann 16,17 verwendet werden. </li><li> Ziehen Sie einen Langkegel Pipette mit einer Spitze Größe von 1 um und laden Sie 5 ul Farbstoff in die Pipette. Alle weiteren Schritte des Targeting eine funktionelle Domäne sind identisch mit dem Bulkbeladung Methode (Figuren 1-3). Um die Pipettenspitze benachbart zu einem neuronalen Zellkörper Membran positionieren, überwachen die Erhöhung Elektrodenimpedanz und Druck Sprühstöße von Farbstoff auf den extrazellulären Raum zu beleuchten und sehen Zellkörper als Schatten während Zwei-Photonen-Bildgebung. </li><li> Wenn die Pipettenspitze neben einem neuronalen Zellkörper Membran ist, verwenden Sie die Axoporator 800A anzuwenden1-3 Impulsen (-8 bis -10 V, 10 ms Puls). Die sofortige Füllung des Neurons mit Farbstoff ist leicht sichtbar mit zwei-Photonen-Mikroskopie. Nehmen Sie die Pipette und sammeln hochauflösende Bilder von Dendriten und Axone in vivo. </li></ol>

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</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Wir präsentieren eine Methode, um die Etikettierung von neuronalen Zellkörper (oder Dendriten und Axone) in vorgegebenen funktionalen Mikrodomänen des Neokortex Ziel. Zusammenführen intrinsische Signal optischen Bildgebung mit Zweiphotonenmikroskopie bietet die Möglichkeit, zu bestimmen, welche Zellen Synapsen und tragen zur Mikro-Domäne von irgendeinem der funktionellen Karte, ob neuronalen Selektivität korreliert mit der Position des Neurons in einem funktionellen Karte, und die neuronale Schaltungskomponenten dass Ve...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz / Material </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Ein. Life Support / Experiment prep </td></tr><tr><td> Isofluran </td><td> Webster Vet </td><td> NDC 57319-474-05 </td><td></td></tr><tr><td> Isofluran Verdampfer </td><td> Midmark </td><td> VIP 3000 </td><td></td></tr><tr><td> Feedback geregelten Heizdecke </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 50-7079F </td><td></td></tr><tr><td> EKG-Monitor </td><td> Digicare Biomedical </td><td> LifeWindow Lite </td><td></td></tr><tr><td> EEG-Verstärker </td><td> AM-Systems </td><td> 1800 </td><td></td></tr><tr><td> EEG Monitor </td&gt; <td> Hewlett Packard </td><td> 78304A </td><td></td></tr><tr><td> Endexspiratorischen CO 2-Monitor </td><td> Respironics </td><td> Novametrix Capnoguard 1265 </td><td> Optimieren Belüftung </td></tr><tr><td> Hartmetallbohrer Grate zum Bohren Knochen </td><td> Henry Schein </td><td> feine (0,5 mm Spitze) und grob (1,25 mm Spitze) </td><td></td></tr><tr><td> Zement für Kopfplatte / Kammermusik </td><td> Dentsply </td><td> 675571, 675572 </td><td></td></tr><tr><td> Black Powder Tempera Farbe </td><td> Sargent Art Inc. </td><td> 22-7185 </td><td> In den Zement zu lichtabschirmende verbessern und Reflexionen </td></tr><tr><td> Agarose - Typ III-A </td><td> Sigma </td><td> A9793 </td><td> Zur Minimierung Pulsationen während intrinsische Signal und Zwei-Photonen-Imaging </td></tr><tr><td> Deckglas: 5 oder 8 mm Durchmesser, 0,17 mm Dicke </td><td> World Precision InInstrumente </td><td> 502040, 502041 </td><td> Zur Minimierung Pulsationen während der Bildgebung kann die Deckglas nach Bedarf geschnitten werden </td></tr><tr><td> Brudon Küretten </td><td> George Tiemann </td><td> 105-715-0, 105-715-3 </td><td> Reinigung Kopfoberfläche </td></tr><tr><td> Knochenwachs </td><td> Ethicon </td><td> W31G </td><td> Schnell Blutungen stoppen </td></tr><tr><td> Wattestäbchen </td><td> Electron Microscopy Sciences </td><td> 72308-05 </td><td> Saubere und trockene Knochenoberfläche </td></tr><tr><td> Dumont # 5CO Forceps </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11295-20 </td><td> Schnappen einzelnen Schichten der Dura oder pia </td></tr><tr><td> Vannas Federschere </td><td> Fine Science Tools </td><td> 15000-03 </td><td> Cut dura </td></tr><tr><td> Gelfoam </td><td> Pfizer </td><td> 09-0396-05 </td><td> Um Blutungen auf der Dura zu stoppen </td></tr><tr><td> Absorption spears</td><td> Fine Science Tools </td><td> 18105-01 </td><td> Ultra-schnelle und fusselfreien Aufsaugen von CSF </td></tr><tr><td> Blackout Material </td><td> Thorlabs </td><td> BK5 </td><td> Schild Kraniotomie </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 2. Farbstoffzubereitung / Einspritzung </td></tr><tr><td> Dimethylsulfoxid (DMSO) </td><td> Sigma </td><td> D2650 </td><td></td></tr><tr><td> Pluronic </td><td> Sigma </td><td> P2443 </td><td></td></tr><tr><td> Oregon Green 488 BAPTA-01.00 </td><td> Invitrogen </td><td> O6807 </td><td> Calcium-Indikator </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 594 </td><td> Invitrogen </td><td> A10438 </td><td></td></tr><tr><td> Centrifugal Filter (0,45 um Porengröße) </td><td> Millipore </td><td> UFC30HV00 </td><td> Um Verunreinigungen vor der Injektion zu entfernen </td></tr><tr><td> Glaspipette puller </td><td> Sutter Instruments </td><td> P97 </td><td></td></tr><tr><td> Borosilikatglas Fäden verbundene Kapillare (1,5 mm Außendurchmesser) </td><td> World Precision Instruments </td><td> 1B150F-4 </td><td> Dye Auswerfen Pipette </td></tr><tr><td> Microloader </td><td> Eppendorf </td><td> 5242 956 003 </td><td> Zum Be-Farbstoff in Pipette </td></tr><tr><td> Micromanipulator </td><td> Sutter Instruments </td><td> MP-285 </td><td> Um Pipettenposition </td></tr><tr><td> Pressure Impulsregler </td><td> Parker Hannifin </td><td> PicoSpritzer III </td><td> Für Einspritzung des Farbstoffes </td></tr><tr><td> Einzelzell-Elektroporators </td><td> Molecular Devices </td><td> Axoporator 800A </td><td> Zur Elektroporation des Farbstoffs </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 3. Intrinsic imaGing </td></tr><tr><td> 4x Objective (0,13 NA, 17 mm WD) </td><td> Olymp </td><td> UPLFLN4X </td><td></td></tr><tr><td> Intrinsic Hardware / Software </td><td> Optical Imaging Inc. </td><td> Imager 3001 / VDAQ </td><td> VDAQ Software ist für episodische Bildgebung </td></tr><tr><td> CCD-Kamera </td><td> Adimec </td><td> Adimec-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Lichtquelle Stromversorgung </td><td> KEPCO </td><td> ATE 15-15M </td><td></td></tr><tr><td> Lichtquelle </td><td> Optical Imaging Inc. </td><td> HAL 100 </td><td> Lichtstärke an der kortikalen Oberfläche beträgt 3-5 mW </td></tr><tr><td> Grün-Filter (für vaskuläre Bild) </td><td> Optical Imaging Inc. </td><td> λ = 546 nm (Bandpass 30 nm) </td><td> Für Referenzbild der Oberfläche Gefäßsystem </td></tr><tr><td> Red Filter (für eigensichere Signal) </td><td> Optische Imaging Inc. </td><td> λ = 630 nm (Bandpass 30 nm) </td><td> Um intrinsische Signale zu sammeln </td></tr><tr><td> Wärmeschutzfilter </td><td> Optical Imaging Inc. </td><td> KG-1 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 4. Zwei-Photonen-rig / Imaging </td></tr><tr><td> Zwei-Photonen-Mikroskop und Software </td><td> Prairie Technologies </td><td></td><td> Siehe Shen et al. 2012 für Lichtweg, Filter und Laserleistung </td></tr><tr><td> Ti: Saphir-Laser </td><td> Spectra-Physics </td><td> Mai Tai XF </td><td></td></tr><tr><td> 20x (0,5 NA, 3,5 mm WD) </td><td> Olymp </td><td> UMPLFLN20X </td><td> 0,5 NA Ziel ist nur zum Ausrichten Pipette über die Kraniotomie verwendet (nicht für Zwei-Photonen-Imaging) </td></tr><tr><td> 20x (1,0 NA, 2,0 mm WD) </td><td> Olymp </td><td> XLUMPLFLN20X </td><td></td></tr><tr><td> 40x (0,8 NA; 3,3 mm WD) </td><td> Olymp </td><td> LUMPLFLN40X/IR </td><td></td></tr><tr><td> Lufttisch </td><td> Newport </td><td> ST-200 </td><td> Trennt Vorbereitung von externen Vibrationen </td></tr><tr><td> xy </td><td> Mike Machine Co. (Attleboro, MA) </td><td></td><td> Versuchsperson und Sutter Mikromanipulator auf xy Bühne platziert </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> Rezepte </td></tr><tr><td> Künstliche Cerebrospinalflüssigkeit </td><td> NaCl (135 mM), KCl (5,4 mM), MgCl 2 (1,0 mM), CaCl 2 (1,8 mM), HEPES (5 mM), pH 7,4 </td></tr><tr><td> Pipette Lösung 14 </td><td> NaCl (150 mM), KCl (2,5 mM), HEPES (10 mM), pH 7,4 </td></tr></tbody>
			</table>
			</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gezielte labeling von neuronen in einem bestimmten functional micro-domäne des neocortex durch kombination intrinsic signal-und zwei-photonen-imaging

Targeted Labeling of Neurons in a Specific Functional Micro-domain of the Neocortex by Combining Intrinsic Signal and Two-photon Imaging

In der primären Sehrinde des Nicht-Nagetier Säugetieren, sind Neurone nach ihrer Präferenz für Stimulus-Features wie Ausrichtung 1-4, Richtung 5-7, okuläre Dominanz 8,9 und binokulare Disparität 9 gruppierten. Orientierungsselektivität ist das am besten untersuchte und eine kontinuierliche Funktion der Karte mit einem quasi-periodischen Layout für bevorzugte Orientierung vorhanden ist über den gesamten primären Sehrinde 10,11. Die Integration der synaptischen, Mobilfunk-und Netzwerk-Beiträge, die Stimulus-selektive Reaktionen in diesen funktionellen Karten führen erfordert die Hybridisierung von bildgebenden Verfahren, die sub-micron überspannen bis Millimeter räumlichen Skalen. Bei herkömmlichen intrinsische Signal optische Bildgebung kann die gesamte Anordnung der Funktionskarten über die gesamte Oberfläche des visuellen Kortex 12 bestimmt werden. Die Entwicklung der in vivo Zwei-Photonen-Mikroskopie mit Calcium-sensitiven Farbstoffen ermöglicht es, die SYNAPT bestimmenIC-Eingang ankommen einzelnen dendritischen Dornen 13 oder Rekord-Aktivität gleichzeitig aus Hunderten von einzelnen neuronalen Zellkörper 6,14. Folglich Kombinieren intrinsische Signal Bilderzeugung mit der Sub-Mikrometer Ortsauflösung Zweiphotonenmikroskopie bietet die Möglichkeit, genau festzustellen, welcher dendritischen Zellen Segmente und an das Mikro-Domäne von irgendeinem der funktionellen Karte in der Großhirnrinde beitragen. Hier zeigen wir, eine hohe Ausbeute-Verfahren zum schnellen Gewinnung eines kortikalen Orientierungskarte und die eine spezifische Mikro-Domäne in diesem funktionellen Karte zur Markierung mit Fluoreszenzfarbstoffen Neuronen in einem nicht-Nagetier-Säuger. Mit dem gleichen Mikroskop für Zwei-Photonen-Bildgebung verwendet, wir erzeugen zunächst eine Orientierung Karte mit intrinsische Signal optische Bildgebung. Dann werden wir zeigen, wie man ein Mikro-Domain von Interesse mit einer Mikropipette mit Farbstoff entweder Label geladen gezielt eine Population von neuronalen Zellkörper oder Etikett eines einzelnen Neurons, dass Dendriten, Stacheln und Axone sichtbar sindvivo. Unsere Verbesserungen gegenüber bisherigen Methoden ermöglichen eine Untersuchung der neuronalen Struktur-Funktions-Beziehungen mit sub-zellulärer Auflösung im Rahmen des Neokortex funktionalen Architekturen.

Um die Genauigkeit der Farbstoff Markierungsverfahren veranschaulichen, gezielte wir den kleinsten Mikro-Domäne von irgendeinem bekannten funktionellen Karte im nicht-Nagetier Neocortex. Dünn ganzen Orientierungsplan in der primären Sehrinde unterbrochen sind Singularitäten. Diese treten an Stellen, wo alle bevorzugten Orientierungen konvergieren, so dass in Falschfarben Karten der bevorzugten Orientierung, die Regionen um die Singularität aussehen &quot;Windräder&quot; (2A-B). Ein Windrad pro Kraniotom...

Es wird ein Verfahren zur Markierung von Neuronen mit Fluoreszenzfarbstoffen in vorbestimmten funktionellen Mikrodomänen des Neokortex beschrieben. Zuerst wird intrinsische Signal Abbildungsoptik verwendet werden, um eine funktionelle Karte zu erhalten. Dann Zweiphotonenmikroskopie wird Etiketts und Bild Neuronen innerhalb eines Mikro-Domäne von der Karte verwendet.

Gezielte Labeling von Neuronen in einem bestimmten Functional Micro-Domäne des Neocortex durch Kombination Intrinsic Signal-und Zwei-Photonen-Imaging

In the primary visual cortex of non-rodent mammals, neurons are clustered according to their preference for stimulus features such as orientation1-4, ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Mikrodomänen in einer funktionellen Karte präzise anzuvisieren, um die Struktur und Funktion von Neuronen mit hoher Auflösung zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst eine intrinsische Signalbildgebung über einen großen Bereich des Kortex durchgeführt wird, um eine Karte des interessierenden Stimulusmerkmals zu erhalten. Der zweite Schritt besteht darin, die genaue Position in der Karte zu bestimmen, die für die hochauflösende Photonenbildgebung angestrebt werden soll.Nach sorgfältiger Positionierung der mit Fluoreszenzfarbstoff beladenen Pipette werden die Neuronen mit dem Fluoreszenzmarker markiert. Schließlich werden hochauflösende bis photonenreiche Bilder von neuronalen Reaktionen oder Strukturen gesammelt. Letztendlich kann eine intrinsische Signalmerkmalskarte verwendet werden, um eine Region von Interesse zu finden, wie z. B. eine Orientierungswindrad-Singularität, die dann für die Untersuchung mit Einzelneuronenauflösung anvisiert werden kann.Der Hauptvorteil dieses Protokolls besteht darin, dass man den Kortex mit demselben Mikroskopaufbau und nur wenigen schnellen Anpassungen am System auf verschiedenen räumliche

targeted-labeling-neurons-specific-functional-micro-domain-neocortex

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Um zu verstehen, Netzwerk-Dynamik Mikroschaltungen in den Neocortex, ist es wichtig, gleichzeitig aufzeichnen die Aktivität einer großen Anzahl von Neuronen. In-vivo Zwei-Photonen-Kalzium-Imaging ist die einzige Methode, dass man, um die Aktivität eines dichten neuronalen Population mit Single-Cell-Auflösung aufzeichnen können.

In Vivo 2-Photon Calcium Imaging in Layer 2 / 3 der Mäuse

Dieses Papier stellt einen Ansatz der Kombination von Laser-Scanning-Photostimulation mit Ganzkeim Aufnahmen in transgenen Mäusen, die GFP in begrenzten hemmende Neuronen Populationen. Die Technik ermöglicht die umfassende Abbildung und quantitative Analyse der lokalen synaptischen Schaltungen des spezifischen inhibitorischen kortikalen Neuronen.

Mapping hemmende neuronale Schaltungen durch Laser Scanning Photostimulation

Retrograden Transport von Fluoreszenzfarbstoff markiert eine Subpopulation von Neuronen auf anatomische Projektion basiert. Beschriftet Axone kann visuell ausgerichtet...

Retrograde Fluoreszenzmarkierung Ermöglicht Gezielte Extracellular Einzel-Einheit Aufnahme von identifizierten Neuronen<em&gt; In vivo</em

Experience-abhängigen molekularen Veränderungen in Nervenzellen sind essentiell für die Fähigkeit des Gehirns, in Reaktion auf Verhaltensstörungen Herausforderungen anzupassen.

In Vivo Zwei-Photonen-Imaging Of Experience-abhängigen molekularen Veränderungen in kortikalen Neuronen

Zeitraffer-Bildgebung am lebenden Tier liefert wertvolle Informationen über die strukturelle Reorganisation im intakten Gehirn. Hier stellen wir ein verdünntes Schädelpräparat vor, das die transkranielle Bildgebung von fluoreszenzmarkierten synaptischen Strukturen in der lebenden Mausrinde mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie ermöglicht.

Zwei-Photonen-<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging von dendritischen Dornen in der Maus Cortex Mit einem ausgedünnten Schädel Vorbereitung

Wir beschreiben die Kombination von Brenn UV-induzierten Photoaktivierung von neuro-Wirkstoffe mit Ganzzell Patch-Clamp-und Multi-Photonen-Imaging von intrazellulären Natrium-Transienten in Dendriten und Dornen von Neuronen im Hippocampus bei akuten Gewebeschnitten von Mausgehirn.

Multi-Photonen-Intrazelluläre Sodium Imaging Kombination mit UV-vermittelten Brenn Uncaging von Glutamat in CA1 Pyramidenzellen

Dieses Video zeigt das Kraniotomieverfahren, das die chronische Bildgebung von Neuronen im retrosplenialen Kortex der Maus mittels in vivo Zwei-Photonen-Mikroskopie in der transgenen Thy1-GFP-Linie ermöglicht. Dieser Ansatz wird mit der Injektion von mCherry-exprimierenden Adeno-assoziierten Viren in den dorsalen Hippocampus kombiniert. Diese Techniken ermöglichen eine langfristige Überwachung der erfahrungsabhängigen strukturellen Plastizität bei RSC.

Die gleichzeitige Zwei-Photonen<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging der synaptischen Eingänge und Postsynaptische Targets in der Maus retrosplenialen Cortex

Wir präsentieren Ihnen eine Methode, die Kombination von ganzen Zelle Patch-Clamp-Aufnahmen und zwei-Photon imaging um Ca2 + Transienten im neuronalen Dendriten in akuten Hirnschnitten zu erfassen.

Zwei-Photonen-Kalzium Imaging in neuronalen Dendriten in Hirnschnitten

Hier beschreiben wir eine Vorgehensweise für Gewebe, clearing, fluoreszierende Kennzeichnung und umfangreiche Darstellung der Maus Hirngewebe, die dadurch ermöglicht die Visualisierung der dreidimensionalen Organisation der Zelltypen der Großhirnrinde.

Groß angelegte dreidimensionale Bildgebung der zelluläre Organisation in der Maus Neocortex

In Kombination mit einer Kopfplatte und einem optischen Design, das sowohl mit Einzel- als auch mit Zwei-Photonen-Mikroskopen kompatibel ist, bietet die Mikroprismenlinse einen erheblichen Vorteil bei der Messung neuronaler Reaktionen in einer vertikalen Säule unter verschiedenen Bedingungen, einschließlich gut kontrollierter Experimente in kopffesten Zuständen oder natürlicher Verhaltensaufgaben bei frei beweglichen Tieren.

Langzeitbildgebung identifizierter neuronaler Populationen mit Mikroprismen bei frei beweglichen und kopffixierten Tieren

Dieses Protokoll bietet eine umfassende Beschreibung einer Methode zur gleichzeitigen Aufzeichnung von Kalziumsignalen von Neuronen und Astrozyten über mehrere gedächtnisbezogene Hirnregionen hinweg und demonstriert deren Anwendung während eines Lern- und Gedächtnisverhaltensparadigmas.

Eine zweifarbige Faserphotometriemethode zur Aufzeichnung der Aktivität von Astrozytenneuronen über mehrere Gehirnregionen während des Lern- und Gedächtnisverhaltens

Erfahren Sie die präzise Markierung von Neuronen in funktionellen Mikrodomänen des Neocortex durch Kombination von intrinsischer Signalbildgebung und Zwei-Photonen-Mikroskopie. Diese Methode ermöglicht hochaufgelöste Studien neuronaler Strukturen.

Gezielte Labeling von Neuronen in einem bestimmten Functional Micro-Domäne des Neocortex durch Kombination Intrinsic Signal-und Zwei-Photonen-Imaging (Video) | JoVE Journal

Gezielte Labeling von Neuronen in einem bestimmten Functional Micro-Domäne des Neocortex durch Kombination Intrinsic Signal-und Zwei-Photonen-Imaging

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