Herstellung von Tumor-Antigen-beladenen reifen dendritischen Zellen für die Immuntherapie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Vorbereitung von dendritischen Zellen in klinischer Qualität für die Immuntherapie zu demonstrieren. Dies wird erreicht, indem zunächst mononukleäre Zellen aus dem peripheren Blut eingefroren werden, die aus der Leukapherese isoliert wurden. Im zweiten Schritt werden die gefrorenen Aliquots von pbmc aufgetaut und die Monozyten in Gegenwart von G-M-C-S-F und IL vier für fünf Tage in dendritische Zellen differenziert.

Als nächstes werden die dendritischen Zellen geerntet, mit Peptiden gepulst und über Nacht mit dem TLR-Drei-Agonisten Poly ICLC gereift. Im letzten Schritt werden die reifen dendritischen Zellen geerntet und in Aliquots eingefroren. Diese gefrorenen Aliquots reifer dendritischer Zellen können aufgetaut, in Spritzen überführt und den Patienten im Rahmen ihrer Immuntherapie wieder injiziert werden.

Die Demonstration des Verfahrens wird von Sedia und Farra Hassan, beides Forschungstechniker in meinem Labor, verdient. Mit einem Plasmatransfer-Set beginnen Sie mit dem aseptischen Aufspießen einer der Zugangsöffnungen im Leukapheresebeutel. Anschließend wird die Leukapherese mit einer 60-Milliliter-Spritze in eine sterile 500-Milliliter-Flasche umgefüllt. Stellen Sie dann bei Raumtemperatur RPMI das Volumen der Leukapherese auf das Doppelte seines ursprünglichen Volumens ein und mischen Sie gründlich, nachdem Sie eine Flasche Fial-Packung vorsichtig gemischt haben, fügen Sie 12 Milliliter der Lösung in sterile konische 50-Milliliter-Röhrchen hinzu und schichten Sie dann vorsichtig 30 Milliliter des verdünnten Leukaphereseprodukts in jedes Röhrchen mit Fial.

Achten Sie darauf, die Schnittstelle zwischen dem FI-Aufruf und der Zellensuspension nicht zu stören. Zentrifugieren Sie die Röhrchen 20 Minuten lang bei 1000 GS und Raumtemperatur ohne Pause. Ernten Sie dann vorsichtig die trübe Schicht von pbmc aus jedem Röhrchen und überführen Sie sie in neue sterile 50-Milliliter-Röhrchen.

Geben Sie anschließend RPMI zu jedem Röhrchen bis zu einem Endvolumen von 50 Millilitern und mischen Sie die Zellsuspensionen dann vorsichtig durch Inversion. Nachdem Sie die Zellen 10 Minuten lang bei 500 g und vier Grad Celsius heruntergeschleudert haben, entfernen Sie die Überstände aus jedem Röhrchen und resuspendieren Sie die Zellpellets aus jedem Röhrchen in RPMI auf ein Endvolumen von 50 Millilitern. Nachdem Sie die Röhrchen vorsichtig durch Inversion gemischt haben, bestimmen Sie die Anzahl und Lebensfähigkeit der Zellen.

Als nächstes zentrifugieren Sie die Zellen und resuspendieren das Pellet in frisch vorbereiteten Gefriermedien bei einer Endkonzentration von zweimal 10 auf die acht Zellen pro Milliliter. Übertragen Sie einen Milliliter Eloqua der Zelllösung in 1,8 Milliliter Kryo-Fläschchen. Übertragen Sie dann die Kryo-Fläschchen in einen Gefrierschrank mit kontrollierter Rate und beginnen Sie mit dem Gefrierlauf. Übertragen Sie die gefrorenen Kryo-Fläschchen am Ende des Laufs sofort in die Dampfphase eines Flüssigstickstoff-Gefrierschranks.

Am nächsten Tag werden die Aliquote der gefrorenen p BMCs in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad durch sanftes Rühren gehäuft. Nach dem vollständigen Auftauen wird der Inhalt der Durchstechflaschen in sterile konische 50-Milliliter-Röhrchen mit 30 Millilitern RPMI und autologer Plasmazentrifuge überführt. Die Zellen reanimieren das Zellpellet vorsichtig in einem kleinen Volumen RPMI plus autologem Plasma.

Geben Sie dann mehr RPMI plus autologen Plasma bis zu einem Endvolumen von 50 Millilitern hinzu. Nachdem Sie die Suspensionen gründlich gemischt haben, 1,4 mal 10 zu den acht Zellen in 40 Milliliter RPMI plus autologem Plasma auf einen 225 Zentimeter großen Easy-Kolben auffüllen, inkubieren Sie den Easy-Kolben ein bis zwei Stunden lang flach auf der Seite bei 37 Grad Celsius im Gewebekultur-Inkubator mit 5 % Kohlendioxid, damit die Monozyten nach Abschluss der Inkubation am Kolben haften können. Waschen Sie den einfachen Kolben zweimal mit 30 Millilitern RPMI aus der Vorkriegszeit, um die nicht anhaftenden Zellen zu entfernen.

Nach der zweiten Wäsche werden 40 Milliliter RPMI plus autologes Plasma mit IL vier und G-M-C-S-F in die Zellen gegeben und dann der EASI-Kolben zwei Tage lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid inkubiert. Fünf Tage später schwenken Sie die Kolben kräftig und pipettieren Sie auf und ab, um sie wieder zu suspendieren. Die nicht adhärenten und locker adhärenten Zellen überführen die geernteten Zellen in neue konische 50-Milliliter-Röhrchen.

Nach dem Schleudern der Zellen suspendieren wir die Zellpellets in 50 Millilitern RPMI plus autologem Plasma. Nach dem Mischen und Waschen der Zelle werden erneut ein- bis zweimal 10 der sechs Zellen pro Vertiefung in drei Millilitern RPMI plus autologem Plasma mit IL vier und G-M-C-S-F in sechs Millilitern Suspensionen plattiert. Well-Gewebekulturplatten inkubieren dann die Platten bei 37 Grad Celsius im Gewebekultur-Inkubator mit 5 % Kohlendioxid über Nacht am nächsten Tag bei 10 Mikrogramm pro Milliliter KLH zu einem Drittel der Wells in den sechs Well-Kulturplatten und mischen die Platten durch Schwenken.

Geben Sie dann zwei Mikrogramm pro Milliliter Poly ICLC in die Vertiefungen und mischen Sie gut. Fügen Sie als Nächstes 100 Mikrogramm pro Milliliter langer Peptidantigene in die dafür vorgesehenen Vertiefungen hinzu, wobei jede Vertiefung nur ein einzelnes Peptid erhält, um Kreuzkonkurrenz zu vermeiden. Dann inkubieren Sie die Platten über Nacht bei 37 Grad Celsius in einem Gewebekultur-Inkubator mit 5 % Kohlendioxid am siebten Tag, ernten und poolen Sie alle Vertiefungen mit dendritischen Zellen.

Am sechsten Tag wurden die Peptide in neue konische 50-Milliliter-Röhrchen gepulst. Nach dem Schleudern der Zellen und der Reanimation werden die aspirierten Zellpellets in fünf Millilitern RPMI plus autologem Plasma suspendiert, dann das Gesamtvolumen mit RPMI plus autologem Plasma auf 50 Milliliter gebracht und die Zellsuspensionen gründlich gemischt. Nach Berechnung der Gesamtzahl lebensfähiger Zellen zentrifugieren Sie die Röhrchen, reanisieren jedes Pellet in fünf Millilitern sterilem Natriumchlorid und waschen Sie dann jede Zellsuspension zwei weitere Male in 14 Millilitern sterilem Natriumchlorid.

Mischen Sie die Tuben nach jeder Wäsche nach der zweiten Wäsche. Resusieren Sie die Zellpellets in dendritischer Zellgefrierlösung bei vier- bis 20-mal 10 der sechs Zellen pro Milliliter und aliquotieren Sie einen Milliliter jeder Zellsuspension in 1,8-Milliliter-Kryoröhrchenfläschchen. Zum Schluss frieren Sie mit dem Gefrierschrank mit kontrollierter Rate die Aliquots von dendritischen Zellimpfstoffen ein und überführen Sie die Aliquote dann sofort in die Dampfphase eines Flüssigstickstoff-Gefrierschranks zur Langzeitlagerung.

Zwischen 10 und 20 % der anfänglichen p BMCs differenzieren sich am Ende der Kulturperiode zu dendritischen Zellen. Die Reifung der dendritischen Zellen als Reaktion auf Poly-ICLC, dargestellt durch die fetten Linien, wurde auf der Grundlage der Expression von CD 83, CD 40 und CCR 7 bewertet, und verglichen mit nicht stimulierten dendritischen Zellen, die durch die Grautöne dargestellt werden, wie in diesen Balkendiagrammen gezeigt, Poly-IIC reifte dcs in diesem Experiment, unterschieden von drei gesunden Spendern, die große Mengen an IL sechs IL acht IL 12 sezernieren. und TNF alpha. Diese Poly-ICLC-gereiften Zellen induzieren auch eine allogene T-Zell-Proliferation, wie die CFSE-Expression zeigt, sowie die Interferon-Gamma-Produktion nach seiner Entwicklung.

Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der Immunologie den Weg, die Verwendung von dendritischen Zellen für die Immuntherapie bei Krebs und Infektionskrankheiten zu erforschen.