Name: Herstellung von Tumor-Antigen-beladenen reifen dendritischen Zellen für die Immuntherapie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Lernen Sie die Herstellung klinisch geprüfter dendritischer Zellen für die Tumorimmuntherapie. Diese Methode nutzt GM-CSF und IL-4 zur Differenzierung autologer Monozyten und ermöglicht effektive Krebsbehandlungen.

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Die Autoren bedanken sich bei Andres Salazar (Oncovir, Inc.) für das Geschenk des Poly-ICLC danken.

1. Isolation und Kryokonservierung von PBMCs 4 <ol><li> Aseptisch Spike einer der Access-Ports in der Leukapherese Tasche mit einem Plasma-Transfer-Set. Mit einem 60-ml-Spritze, übertragen Sie die Leukapherese von Patienten in eine sterile 500 ml-Flasche erhältlich. </li><li> Stellen Sie die Lautstärke des Leukapherese auf sein ursprüngliches Volumen mit Raumtemperatur RPMI 2x. Gründlich mischen. </li><li> Vorsichtig mischen die Flasche Ficoll-Paque PLUS. In 12 ml Ficoll-Paque PLUS in sterile 50 ml konischen Röhrchen. </li><li> Vorsichtig Schicht 30 ml des verdünnten Leukapherese Produkt zu jedem sterile 50 ml konischen Röhrchen mit Ficoll. Achten Sie darauf, die Schnittstelle zwischen dem Ficoll und Zellsuspension stören. </li><li> Schritte 1.3 und 1.4 bis alle leukapheresis überlagert worden ist. </li><li> Zentrifugieren Sie die 50 ml konischen Röhrchen bei 1.000 × g für 20 min bei Raumtemperatur ohne Bremse. </li><li> Sorgfältig ernten die trübe Schicht von PBMCs aus jedem Röhrchen und transfer neue sterile 50 ml Röhrchen. </li><li> In RPMI in jedes Röhrchen auf ein Endvolumen von 50 ml. Vorsichtig mischen durch Umdrehen. </li><li> Zentrifugieren Sie die Zellen bei 500 × g für 10 min bei 4 ° C mit Vollbremsung. </li><li> Entfernen Sie die Überstände aus jeder Röhre. Resuspendieren der Zellpellets aus jedem Röhrchen und fügen RPMI auf ein Gesamtvolumen von 50 ml. Vorsichtig mischen durch Umdrehen. </li><li> Zentrifugieren Sie die Zellen bei 500 × g für 6 min bei 4 ° C. </li><li> Entfernen Sie die Überstände aus jeder Röhre. Resuspendieren und bündeln die Zellsuspensionen in einem 50 ml konischen Röhrchen. </li><li> Bringen Sie die Lautstärke der gepoolten PBMCs bis zu 50 ml mit RPMI. Vorsichtig mischen durch Umdrehen. </li><li> Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 × g für 6 min bei 4 ° C. </li><li> Entfernen Sie den Überstand. Zellpellet in 50 ml RPMI. Vorsichtig mischen, um eine gleichmäßige Zellsuspension gewährleisten. </li><li> Zählen Sie die Anzahl von Zellen und die Lebensfähigkeit der Zellen zu bestimmen. Berechnen der Gesamtzahl lebensfähiger Zellen. </li><li> Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300× g für 6 min bei 4 ° C. Bereiten Sie die gefrierenden Medien. Freezing Medien besteht aus 10% Dimethylsulfoxid (DMSO; Miltenyi Biotec) in humanem AB-Serum (Tal Biomedical). </li><li> Entfernen Sie den Überstand. Resuspendieren der Zellen in einer Endkonzentration von 2 × 10 8 Zellen / ml in kaltem Einfriermedien. </li><li> Als 1 ml Aliquots in 1,8 ml Kryoröhrchen. </li><li> Übertragen Sie die Kryoröhrchen in den kontrollierten Rate Gefrierfach und beginnen das Einfrieren run, Programm 1. Am Ende des Laufs, übertragen Sie die eingefrorenen Kryoröhrchen sofort in die Gasphase des flüssigen Stickstoffs Gefrierschrank. </li></ol> 2. Tag 0: Differenzierung von dendritischen Zellen aus Monozyten <ol><li> 30 ml RPMI / 1% autologem Plasma in ein steriles 50 ml konischen Röhrchen. </li><li> Tau-Aliquots von gefrorenen PBMCs durch vorsichtiges Schütteln in 37 ° C warmes Wasserbad. Wenn vollständig aufgetaut und der Inhalt der Fläschchen in den sterilen 50 ml konischen Röhrchen. Gründlich mischen. </li><li> Zentrifugieren Sie die Zellen für 6 minbei 500 × g bei Raumtemperatur. Entfernen des Überstandes und Resuspendieren der pelletierten Zellen in einem kleinen Volumen RPMI / 1% autologes Plasma. Dann fügen Sie mehr RPMI / 1% autologem Plasma auf ein Gesamtvolumen von 50 ml. Gründlich mischen. </li><li> Zentrifugieren Sie die Zellen wieder für 6 min bei 500 × g bei Raumtemperatur. Saugen Sie den Überstand und das Pellet in 50 ml RPMI / 1% autologem Plasma. Gründlich mischen. </li><li> Zählen Sie die Anzahl von Zellen und die Lebensfähigkeit der Zellen zu bestimmen. Berechnen der Gesamtzahl lebensfähiger Zellen. </li><li> Platte 1,40 x 10 8 Zellen in 40 ml RPMI / 1% autologem Plasma auf 225 cm 2 EasYFlask. Wiederholen, bis alle Zellen überzogen worden. </li><li> Inkubieren der EasyFlasks flach auf die Seite für 1 - 2 Stunden bei 37 ° C in der Gewebekultur-Inkubator mit 5% CO 2, um die Monozyten zu dem Kolben zu halten. </li><li> Wenn die Inkubation abgeschlossen ist, entfernen Sie die EasYFlask aus dem Inkubator und waschen zweimal zur Entfernung des nicht-haftenden Zellen using 30 ml vorgewärmtem RPMI. </li><li> Nach dem zweiten Waschen, 40 ml RPMI / 1% autologem Plasma mit 400-1.000 IU / ml IL-4 und 100-1000 IU / ml GM-CSF 5-8. Aus diesem Protokoll werden wir mit 400 IU / ml IL-4 und 100 IU / ml GM-CSF. </li><li> Inkubieren der EasyFlasks für 2 Tage bei 37 ° C in der Gewebekultur-Inkubator mit 5% CO 2. </li></ol> 3. Tag 2: Fütterung von dendritischen Zellen mit IL-4 und GM-CSF <ol><li> 4 ml RPMI / 1% autologem Plasma mit 400-1.000 IU / ml IL-4 und 100-1000 IU / ml GM-CSF zu jedem EasYFlask. Mix durch Verwirbelung und rockt auf seiner Seite. </li><li> Inkubieren Sie die EasyFlasks für 3 weitere Tage (bis Tag 5) bei 37 ° C in der Gewebekultur-Inkubator mit 5% CO 2. </li></ol> 4. Tag 5: Ernten von unreifen dendritischen Zellen <ol><li> Ernten Sie die Kulturen durch kräftiges Schwenken der Kolben und durch Auf-und Abpipettieren nicht-haftend und lose anhaftenden Zellen resuspendieren. Übertragen Sie diegeernteten Zellen auf neue 50 ml konischen Röhrchen. </li><li> Zentrifugieren bei 500 × g für 6 min bei Raumtemperatur. Entfernen Sie die Überstände und Zellpellet in 50 ml RPMI / 1% autologem Plasma. Gründlich mischen. </li><li> Zählen Sie die Anzahl von Zellen und die Lebensfähigkeit der Zellen zu bestimmen. Berechnen der Gesamtzahl lebensfähiger Zellen. </li><li> Zentrifugieren bei 500 × g für 6 min bei Raumtemperatur. Platte 1-2 x 10 6 Zellen pro Vertiefung in 3 ml RPMI / 1% autologem Plasma mit 400 IU / ml IL-4 und 100 IU / ml GM-CSF in 6-Well-Gewebekulturplatten. </li><li> Die Inkubation bei 37 ° C in der Gewebekultur-Inkubator mit 5% CO 2 über Nacht. </li></ol> 5. Tag 6: Reifung und Antigen Laden von dendritischen Zellen <ol><li> In 10 ug / ml KLH bis 1/3 der Vertiefungen in den 6-well Kulturplatten. Swirl die Platten zu mischen. KLH wird nur 1/3 in die Vertiefungen gegeben, weil KLH ist nur für den ersten DC-Impfstoff verwendet. Nachfolgende DC Impfstoffe conTain nur die Tumor-Antigen-Peptide. </li><li> DCs stimuliert, um zu reifen mit verschiedenen Stimuli werden. Die häufigsten Reifung Reize, die in klinischen Studien verwendet wurde, ist ein Cocktail von Zytokinen (IL-1 β, TNF und IL-6) und Prostaglandin E2 (PGE 2) 9,10. In jüngerer Zeit haben die Verwendung von Toll-like Rezeptor (TLR)-Agonisten Beliebtheit 11,12 gewonnen. In diesem Protokoll, fügen 2 mg / ml Polyinosin-Polycytidylsäure-Poly-L-Lysin Carboxymethylcellulose (Poly-ICLC) in die Vertiefungen und gut mischen. Poly-ICLC ist klinischem Formulierung von Poly-IC, die mit Poly-L-Lysin *-und Carboxymethylcellulose (hergestellt von Oncovir, Inc.) stabilisiert wird. </li><li> In 100 ug / ml lange Peptid-Antigene (NY-ESO-1 und / oder Melan-A/MART-1) bezeichnet, um ihre Brunnen, jede Vertiefung, die nur eine einzelne Peptid an Cross-Wettbewerb 13 zu vermeiden. </li><li> Die Inkubation erfolgt bei 37 ° C in der Gewebekultur-Inkubator mit 5% CO &lt;sub&gt; 2 O / N. </li></ol> 6. Tag 7: Kryokonservierung von dendritischen Zellen <ol><li> Bereiten DC Freezing Lösung mit autologen Plasma und 10% DMSO. Zentrifugieren Sie die DC Freezing Lösung bei 2.000 × g für 20 min bei 4 ° C, um Partikel zu entfernen. Überstand in ein neues 15 ml beschriftet konischen Rohr. Lagerung bei 4 ° C bis zur Verwendung. </li><li> Wenn die Inkubation über Nacht beendet ist, Ernte und Pool alle Brunnen, die DCs mit den Peptiden in 50 ml konische Röhrchen gepulst. </li><li> Zentrifugieren bei 500 × g für 6 min. Entfernen Sie die Überstände. Zellpellet in 5 ml RPMI / 1% autologem Plasma. Bringen Sie das Gesamtvolumen auf 50 ml mit RPMI / 1% autologem Plasma. Gründlich mischen. </li><li> Zählen Sie die Anzahl von Zellen und die Lebensfähigkeit der Zellen zu bestimmen. Berechnen Gesamtzahl der lebensfähigen Zellen. </li><li> Zentrifugieren bei 500 × g für 6 min bei Raumtemp. Entfernen Sie die Überstände und resuspendieren jedes Pellet in 5 ml Sterile 0,9% NaCl, USP und Transfer zum neuen 15 ml konischen Röhrchen. Bringen Sie jede Zellsuspension auf 14 ml mit steriler 0,9% NaCl, USP. Cap und durch Umdrehen mischen. </li><li> Wiederholen Sie den vorhergehenden Schritt zweimal. Nach der letzten Zentrifugation entfernen Überstände, so nahe wie möglich an den Zellpellets, ohne die Pellets. </li><li> Resuspendieren der Zellpellets in DC Freezing-Lösung bei 4 - 20 x 10 6 Zellen / ml und 1 ml Aliquot jeder 1,8 ml CryoTube Fläschchen. </li><li> Verwenden Sie den kontrollierten Rate Gefrierschrank, Programm 1, zu frieren unten die Portionen von DC Impfstoffe und übertragen sofort in der Gasphase von flüssigem Stickstoff einen Gefrierschrank für die langfristige Lagerung. </li></ol> 7. Lot Veröffentlichung Testing <ol><li> Jede Charge von DC Impfstoff muss ausgewertet werden und erfüllen spezifische Menge Release Kriterien (Tabelle 1), bevor es für die Injektion in Patienten in der Studie, in der Regel 5 bis 6 Wochen nach der Herstellung von Impfstoffen veröffentlicht. </li><li> Lebensfähigkeit:Bewerten Lebensfähigkeit des DC-Impfstoff unter Verwendung einer automatisierten Zelle Zähler. Die minimale akzeptable Rentabilität Spezifikation ist&gt; 70%. </li><li> Identität: Bewerten Sie die Identität des reifen DCs (CD11c + CD14-CD83 +) mittels Durchflusszytometrie. Der Anteil der CD11c + Zellen sollte&gt; 50% sein. Der Anteil der CD11c + und CD14 +-Zellen sollte &lt;30% und der Anteil der CD11c +, CD14-, und CD83 +-Zellen, sollte&gt; 50%. </li><li> Sterilität: Testen der DC-Impfstoff für das Vorhandensein von aeroben und anaeroben Bakterien und Pilze durch direkte Kultur und Gramfärbungen. Bewerten auf die Anwesenheit von Mycoplasma über eine direkte Kultur und DNA Fluorochrom Färbungsanalyse mit Indikator-Zelllinie. Für diese Untersuchungen ist die minimale Spezifikation festgelegt, dass kein Wachstum von allen Kulturen beobachtet. </li><li> Endotoxin: Beurteilen Sie die Endotoxingehalts mit dem kinetischen QCL-kinetischen chromogenen LAL-Test und es muss &lt;50 EU / ml sein, um die minimalen Kriterien erfüllen. </li><li&gt; Funktion: Bewerten DC-Funktion in einer gemischten Lymphozyten-Reaktion durch Inkubation mit allogenen T-Zellen. Die Anwesenheit der Proliferation im Vergleich zu unstimulierten DCs wird berichtet (Abbildung 3). </li></ol>

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Die Autoren haben die finanzielle Unterstützung aus der folgenden erhalten: NIH (AI061684, AI071078, AI044628 und K08 AI084578 (Miller)), die Bill and Melinda Gates Foundation, Doris Duke Charitable Foundation, Cancer Research Institute, Alliance for Lupus Research und der Smaragd Foundation. Nina Bhardwaj ist ein Miterfinder von Patenten im Zusammenhang mit der Herstellung und Verwendung von dendritischen Zellen, die Immunität zu manipulieren. Die Autoren haben keine anderen relevanten Zugehörigkeiten oder finanzielle Beteiligung mit keiner Organisation oder Einrichtung mit einer finanziellen Beteiligung an oder finanzielle Konflikt mit dem Gegenstand oder Materialien im Manuskript abgesehen von denen offenbart diskutiert.

Phase-I-und-II-Studien von Monozyten-abgeleiteten DCs haben gezeigt, dass sie Immunreaktionen induzieren in Patienten jedoch klinische Erfolg wurde 1 beschränkt. Dies kann zum Teil auf den Mangel an Konsens darüber, wie die optimalen DCs für die Tumor-Immuntherapie Verwendung erzeugen. Obwohl es zahlreiche Möglichkeiten, um klinische Studien zu DCs zu erzeugen, unterscheiden sich diese Verfahren im Hinblick auf die Verwendung von Zytokinen, die Monozyten, Stimuli, um die Reifung zu induzieren, und die Methode...

<table><tbody><tr><td>RPMI-1640 Medium mit L-Glutamin</td><td>BioWhittaker</td><td>12-702F</td><td></td></tr><tr><td>1M HEPES gepufferte Kochsalzlösung</td><td>BioWhittaker</td><td>17-737E</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>BioWhittaker</td><td>17-516F</td><td></td></tr><tr><td>Humanalbumin, 25% ige Lösung USP</td><td>Aventis Behring</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Hypaque PREMIUM</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5442-03</td><td></td></tr><tr><td>Humanes AB-Serum</td><td>Valley Biomedical</td><td>HP1022</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Kochsalzlösung USP</td><td>Hospira</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CryoMACS DMSO </td><td>Miltenyi Biotec</td><td>170-076-303</td><td></td></tr><tr><td>Leukin GM-CSF, 0,5 mg/ml</td><td>Berlex</td><td>A02266</td><td></td></tr><tr><td>MACS GMP IL-4</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>170-076-101</td><td></td></tr><tr><td>Hiltonol, Poly-ICLC, 2 mg/ml</td><td>Oncovir</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>VACMUNE KLH</td><td>Biosyn</td><td></td><td></td></tr><tr><td>225 sq cm EasyFlasks</td><td>Nalgene Nunc</td><td>159934</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 6-Well-Gewebekulturplatten</td><td>Becton Dickinson</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>1,8 ml CryoTube Fläschchen</td><td>Nalgene Nunc</td><td>377267</td><td></td></tr><tr><td>Tiefkühlschrank</td><td>Thermo</td><td>CryoMed</td><td></td></tr></tbody></table>

herstellung von tumor-antigen-beladenen reifen dendritischen zellen für die immuntherapie

Preparation of Tumor Antigen-loaded Mature Dendritic Cells for Immunotherapy

Obwohl klinische Studien festgestellt haben, dass Antigen-beladenen DC Impfstoffe sicher und viel versprechende Therapie für Tumore 1 sind, bleibt ihre klinische Wirksamkeit festgelegt werden. Das nachfolgend beschriebene Verfahren, hergestellt gemäß Good Manufacturing-Verfahren (GMP)-Richtlinien, ist eine Optimierung der häufigste ex vivo Herstellungsverfahren zur Erzeugung einer großen Anzahl von DCs für klinische Studien 2. Unsere Methode nutzt die synthetischen TLR-Agonisten Polyinosin 3-Polycytidylsäure-Poly-L-Lysin Carboxymethylcellulose (Poly-ICLC), um die DCs zu stimulieren. Unsere früheren Studie festgestellt, dass Poly-ICLC die stärkste einzelne Reifung Stimulus für den menschlichen DCs ist, wie durch eine Hochregulation von CD83 und CD86, Induktion von Interleukin-12 (IL-12), Tumor-Nekrose-Faktor (TNF), Interferon-gamma-induzierten beurteilt Protein 10 (IP-10), interleukmin 1 (IL-1) und Typ-I-Interferonen (IFN) und minimal Interleukin 10 (IL-10) Produktion. </p&gt; DCs sind aus gefrorenem peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) von Leukapherese erhalten differenziert. PBMCs durch Ficollgradientenzentrifugation isoliert und in Aliquots eingefroren. Am Tag 1 werden PBMCs aufgetaut und überzogen auf Gewebekulturflaschen für Monozyten, die auf der Kunststoffoberfläche nach 1-2 h Inkubation bei 37 ° C in der Gewebekulturinkubator haften wählen. Nach der Inkubation werden die Lymphozyten durch Waschen entfernt und die anhaftenden Monozyten werden für 5 Tage in Gegenwart von Interleukin-4 (IL-4) und Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF) zu unreifen DC differenzieren kultiviert. Am Tag 6 werden unreife DCs mit Keyhole-Limpet-Hämocyanin (KLH)-Protein, das als eine Kontrolle für die Qualität der Impfstoff dient und die Immunogenität der Impfstoff 3 steigern gepulst. Die DCs stimuliert werden, um zu reifen, beladen mit Peptid-Antigene, und über Nacht inkubiert. Am 7. Tag wurden die Zellen gewaschen und in 1 ml eingefroren Aliquots, welche4 - 20 x 10 6 Zellen mit einer kontrollierten Rate Gefrierschrank. Lot Release-Tests für die Chargen von DCs durchgeführt und müssen Mindestanforderungen erfüllen, bevor sie in die Patienten injiziert werden.

Zwischen 10 - 20% Ausgangsmaterial PBMCs differenzieren in DCs am Ende der Kulturperiode. Reife DCs sind CD11c +, CD14-, CD83 +, CD40 + und CCR7 + (Abbildung 1). Sie exprimieren hohe Mengen von MHC-Klasse-I und-II-Molekülen und den kostimulatorischen Moleküle CD80 und CD86. Poly-ICLC auch unteren Ebenen der PDL-1 induziert zu anderen TLR-Agonisten 14 verglichen. Darüber hinaus führen diese Poly-IC-gereiften DCs sezernieren große Mengen an IL-12 (Abbildung 2 und 15,16)</s...

Das am häufigsten verwendete Verfahren zum Erzeugen einer großen Anzahl von autologen dendritischen Zellen (DCs) zur Verwendung bei Tumor-Immuntherapie beschrieben. Das Verfahren nutzt IL-4 und GM-CSF zu DCs aus Monozyten differenzieren. Die unreifen DCs sind, um zu reifen und dann mit Antigenen beladen stimuliert, bevor sie zurück in den Patienten injiziert werden.

Herstellung von Tumor-Antigen-beladenen reifen dendritischen Zellen für die Immuntherapie

While clinical studies have established that antigen-loaded DC vaccines are safe and promising therapy for tumors 1, their clinical efficacy remains to be ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Herstellung von klinisch verwendbaren dendritischen Zellen für die Immuntherapie zu demonstrieren. Dies wird erreicht, indem zunächst periphere mononukleäre Blutzellen, die aus einer Leukozytapherese isoliert wurden, eingefroren werden. Im zweiten Schritt werden die gefrorenen Aliquote von PBMC aufgetaut und die Monozyten in Gegenwart von G-M-C-S-F und IL-4 über fünf Tage hinweg zu dendritischen Zellen differenziert.Anschließend werden die dendritischen Zellen geerntet, mit Peptiden beladen und über Nacht mit dem TLR-3-Agonisten Poly-ICLC reifegemacht. Im letzten Schritt werden die reifen dendritischen Zellen geerntet und in Aliquots eingefroren. Diese gefrorenen Aliquots reifer dendritischer Zellen können aufgetaut, in Spritzen überführt und im Rahmen der Immuntherapie wieder in die Patienten injiziert werden.Die Durchführung des Verfahrens wird von Merited Sedia und Farra Hassan übernommen, beides wissenschaftliche Techniker in meinem Labor. Beginnen Sie mit einem Plasmatransfersatz, indem Sie aseptisch einen der Zugangshäfen in der Leukozytenapherese-Tasche anspritzen. Übertragen Sie anschließend mithilfe einer 60-Milliliter-Spritze die Leukozytenapherese in eine sterile 500-Milliliter-Flasche. Verdünnen Sie dann die Leukozytenapherese mit RPMI-Zellkulturmedium bei Raumtemperatur auf das Doppelte des ursprünglichen Volumens und mischen Sie gründlich. Nach dem vorsichtigen Mischen einer Fialpack-Lösung geben Sie 12 Milliliter dieser Lösung in sterile 50-Milliliter-Konizentrifalen. Schichten Sie dann vorsichtig jeweils 30 Milliliter des verdünnten Leukozytenaphereseprodukts in jede Fialpack-Zentrifuge auf. Stören Sie die Grenzfläche zwischen der FI-Kalibrierung und der Zellsuspension nicht. Zentrifugieren Sie die Röhrchen 20 Minuten bei 1000 ×g und Raumtemperatur ohne Bremse. Sammeln Sie anschließend vorsichtig die trübe PBMC-Schicht aus jedem Röhrchen und überführen Sie sie in neue sterile 50-Milliliter-Röhrchen. Fügen Sie anschließend RPMI zu jedem Röhrchen hinzu, um ein Endvolumen von 50 Milliliter zu erreichen, und mischen Sie die Zellsuspensionen vorsichtig durch Umstülpen. Nachdem die Zellen 10 Minuten bei 500 G und 4 Grad Celsius zentrifugiert wurden, entfernen Sie die Überstände von jedem Röhrchen und resuspendieren die Zellpellets aus jedem Röhrchen in RPMI, um ein Endvolumen von 50 Milliliter zu erreichen. Nach dem vorsichtigen Mischen der Röhrchen durch Umstülpen bestimmen Sie die Anzahl und die Vitalität der Zellen.Zentrifugieren Sie anschließend die Zellen und resuspendieren Sie das Pellet in frisch zubereitetem Gefriermittel mit einer Endkonzentration von zwei mal 10 hoch 8 Zellen pro Milliliter. Geben Sie je ein Milliliter der Zellsuspension in 1,8-Milliliter-Cryoröhrchen. Überführen Sie danach die Cryoröhrchen in einen geführten Gefrierschrank und beginnen Sie den Gefriervorgang. Am Ende des Vorgangs bringen Sie die gefrorenen Cryoröhrchen unverzüglich in die Dampfphase eines flüssigen Stickstoffgefrierschranks.Am nächsten Tag tauen Sie die Aliquots der gefrorenen pBMCs durch vorsichtiges Schütteln in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad auf. Sobald sie vollständig aufgetaut sind, überführen Sie den Inhalt der Vials in sterile konische 50-Milliliter-Röhrchen, die 30 Milliliter RPMI und autologes Plasma enthalten, und zentrifugieren. Resuspendieren Sie das Zellpellet vorsichtig in einem geringen Volumen RPMI ergänzt mit autologem Plasma.Anschließend weitere RPMI ergänzen und autologes Plasma hinzufügen, um ein Endvolumen von 50 Milliliter zu erreichen. Nach gründlichem Mischen der Suspensionen 1,4 × 10⁸ Zellen in 40 Milliliter RPMI plus autologes Plasma auf einen 225 cm² großen Easy-Flask pipettieren. Den Easy-Flask flach auf die Seite liegend für ein bis zwei Stunden bei 37 °C im Gewebekultur-Inkubator mit 5 % CO₂ inkubieren, um den Monocyten die Adhäsion an den Flaschenboden zu ermöglichen. Nach Beendigung der Inkubation den Easy-Flask zweimal mit jeweils 30 Milliliter vorgewärmtem RPMI waschen, um die nicht-adhärenten Zellen zu entfernen.Nach der zweiten Wäsche 40 Milliliter RPMI zuzüglich autologem Plasma mit IL-4 und G-M-CS-F zu den Zellen geben und anschließend den EASI-Flasche zwei Tage bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid inkubieren. Fünf Tage später die Flaschen kräftig schwenken und mehrmals auf- und abpipettieren, um die Zellen erneut in Suspension zu bringen. Die nicht- und locker adhärenten Zellen werden als geerntete Zellen in neue 50-Milliliter-Konizentrischen Röhrchen überführt.Nach dem Zentrifugieren der Zellen suspendieren wir die Zellpellets in 50 Milliliter RPMI ergänzt mit autologem Plasma. Nach dem Mischen und erneuten Waschen der Zellsuspensionen geben wir ein- bis zweimal 10 hoch 6 Zellen pro Vertiefung in drei Milliliter RPMI mit autologem Plasma, IL-4 und G-M-CSF in 6-Loch-Gewebekulturplatten. Anschließend inkubieren wir die Platten über Nacht bei 37 Grad Celsius in einem Gewebekultur-Inkubator mit 5 % Kohlendioxid. Am nächsten Tag geben wir 10 Mikrogramm pro Milliliter KLH zu einem Drittel der Vertiefungen in den 6-Loch-Kulturplatten hinzu und mischen die Platten durch Schwenken.Fügen Sie dann zwei Mikrogramm pro Milliliter Poly ICLC zu den Vertiefungen hinzu und mischen Sie gründlich. Als Nächstes geben Sie 100 Mikrogramm pro Milliliter lange Peptidantigene in die jeweils vorgesehenen Vertiefungen, wobei jede Vertiefung nur ein einzelnes Peptid erhält, um Kreuzkonkurrenz zu vermeiden. Inkubieren Sie die Platten anschließend über Nacht bei 37 Grad Celsius in einem Gewebekultur-Inkubator mit 5 % Kohlendioxid am siebten Tag, ernten Sie die Zellen und vereinen Sie alle Vertiefungen, die dendritische Zellen enthalten.Am sechsten Tag mit den Peptiden in neue 50-Milliliter-Konikalflaschen pulsieren. Nach dem Zentrifugieren der Zellen resuspendieren Sie die aspirierten Zellpellets in fünf Milliliter RPMI plus autologes Plasma und füllen dann das Gesamtvolumen mit RPMI plus autologes Plasma auf 50 Milliliter auf, wobei die Zellsuspensionen gründlich gemischt werden. Nach der Berechnung der Gesamtzahl an vitalen Zellen zentrifugieren Sie die Röhrchen, resuspendieren jedes Pellet in fünf Milliliter sterilem Natriumchlorid und waschen jede Zellsuspension anschließend noch zweimal in 14 Milliliter sterilem Natriumchlorid.Nach jeder Waschung mischen Sie die Röhrchen nach der zweiten Waschung. Resuspendieren Sie die Zellpellets in einer dendritischen Zell-Frierslösung bei vier- bis zwanzigtausend Zellen pro Milliliter und portionieren Sie jeweils ein Milliliter der Zellsuspension in 1,8-Milliliter-Kryoröhrchen. Schließlich gefrieren Sie die Aliquots der dendritischen Zellimpfstoffe mit Hilfe eines kontrollierten-Rate-Gefriegers ein und überführen Sie die Aliquots unverzüglich in die Dampfphase eines flüssigen Stickstoffgefrierschranks zur Langzeitlagerung.Zwischen 10 und 20 % der ursprünglichen pBMCs differenzieren am Ende der Kulturphase in dendritische Zellen. Die Reifung der dendritischen Zellen als Antwort auf Poly ICLC, dargestellt durch die fett gedruckten Linien, wurde anhand der Expression von CD83, CD40 und CCR7 evaluiert und mit nicht stimulierten dendritischen Zellen, dargestellt durch die grauen Flächen, verglichen. Wie diese Balkendiagramme zeigen, sekretieren in diesem Experiment aus drei gesunden Spendern stammende, durch Poly IIC gereifte DCs große Mengen an IL-6, IL-8, IL-12 und TNF-α. Diese durch Poly ICLC gereiften Zellen induzieren zudem eine allogene Proliferation von T-Zellen, nachgewiesen durch CFSE-Expression, sowie die Produktion von Interferon-γ nach ihrer Differenzierung.Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der Immunologie den Weg, dendritische Zellen für die Immuntherapie bei Krebs und Infektionskrankheiten zu nutzen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Dieses Video zeigt das Verfahren zur Unterscheidung myeloide dendritische Zellen aus dem Knochenmark der Maus. Isolierung von Maus Schienbein und Oberschenkelknochen, und die Verarbeitung von Knochenmark nachgewiesen. Bilder zeigen Zellmorphologie vor und nach der Differenzierung und Figurengruppen Zellphänotyp und IL-12 Produktion nach der Reifung mit CpG gezeigt.

Kultur myeloide dendritische Zellen aus dem Knochenmark Vorstufen

Antigen-Präsentation in sekundären lymphatischen Organen durch dendritische Zellen ist entscheidend für die Einleitung des T-Zell-vermittelten adaptive Immunantwort. Hier zeigen wir die Kultur von Knochenmark abgeleiteten dendritischen Zellen, Aktivierung und Etikettierung für die 2-Photonen-Imaging.

Generierung von Knochenmark murinen dendritischen Zellen für den Einsatz in 2-Photonen-Imaging

Bewertet in syngeneimmunen immunkompetenten Wirten zeigte der Krebsstammzell-Impfstoff (CSC) eine signifikant höhere Antitumorimmunität als herkömmliche DC-Impfstoffe, die mit heterogenen Massentumorzellen gepulst wurden.

Generierung eines neuartigen Dendritisch-Zell-Impfstoffs mit Melanom- und Plattenkrebs-Stammzellen

Unreife dendritische Zellen können selektiv in tolerogene oder reife dendritische Zellen differenziert werden, um das Gleichgewicht zwischen Immunität und Toleranz zu regulieren. Diese Arbeit stellt eine Möglichkeit vor, aus unreifen Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen (moDCs) in vitro tolerogene und reife moDCs zu generieren, die sich in metabolischen Phänotypen unterscheiden.

Die Erzeugung von Unreife, Ältere und Tolerogene Dendritischen Zellen mit unterschiedlichen Metabolic Phänotypen

Monocyte abgeleitet DC (MoDC) spürt geringe Mengen an Gefahr-assoziierter Moleküle und sind daher leicht grundiert. Wir bieten ein detailliertes Protokoll für die Isolierung von MoDC aus Blut und Tumoren und ihre Aktivierung mit Immunkomplexen wobei wichtige Vorsichtsmaßnahmen, die berücksichtigt werden sollten, um ihre vorzeitige Aktivierung zu vermeiden.

Isolierung-Protokoll der Maus Monocyte-abgeleitete Dendritische Zellen und ihre anschließende In-vitro- Aktivierung mit Tumor Immunkomplexe

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zu entwickeln und tolerogene dendritischen Zellen (TolDCs) zu charakterisieren und deren immuntherapeutischen nutzen zu bewerten.

Entwicklung und Charakterisierung von dendritischen Zellen murinen Tolerogene

Die Tranmmunisierung (TI) Gerät oder Platte und verwandte Protokolle wurden entwickelt, um die wichtigsten Merkmale der extrakorporalen Photochemotherapie (ECP) zu replizieren, in einem experimentellen Umfeld, die die Produktion von physiologisch aktivierten, tausenfähigen dendritischen Zellen (DCs) für die Krebs-Immuntherapie.

Neuartiges Protokoll zur Generierung physiologischer immunogener Dendritischer Zellen

Hier stellen wir eine wirtschaftliche und effiziente Methode vor, um hochreine dendritische Knochenmarkzellen aus Mäusen nach 7-tägiger Kultur mit 10 ng/mL GM-CSF/IL-4 zu isolieren und zu erzeugen.

Wirtschaftliches und effizientes Protokoll zur Isolierung und Kultivierung von aus Knochenmark gewonnenen dendritischen Zellen aus Mäusen

Das Protokoll stellt ein Krebsimmuntherapiemodell mit zellbasierter Tumorimpfung mit Flt3L-exprimierendem B16-F10-Melanom vor. Dieses Protokoll demonstriert die Verfahren, einschließlich der Vorbereitung kultivierter Tumorzellen, der Tumorimplantation, der Zellbestrahlung, der Messung des Tumorwachstums, der Isolierung intratumoraler Immunzellen und der Durchflusszytometrieanalyse.

Experimentelles Melanom-Immuntherapiemodell mit Tumorimpfung mit einem hämatopoetischen Zytokin

Ein einzigartiges, umfassendes Protokoll zur Generierung von de-sialylierten humanen monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen (mo-DCs) aus isolierten mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) unter Verwendung einer Sialidase-Behandlung wird vorgestellt. Des Weiteren werden Methoden zur Beurteilung der phänotypischen und funktionellen Charakterisierung von mo-DCs beschrieben und evaluiert, wie die Behandlung mit Sialidase das Reifungsniveau von mo-DCs verbessert.

Generierung von Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen mit unterschiedlichen sialylierten Phänotypen

Dieses Protokoll beschreibt die in vivo Reprogrammierung von Krebszellen der Maus in dendritisch-ähnliche Zellen vom Typ 1 innerhalb der Tumormikroumgebung durch erzwungene Expression der Transkriptionsfaktoren PU.1, IRF8 und BATF3.

Steuerbare in vivo Reprogrammierung von Tumorzellen zu konventionellen dendritischen zellähnlichen Zellen vom Typ 1

Lernen Sie die Herstellung klinisch geprüfter dendritischer Zellen für die Tumorimmuntherapie. Diese Methode nutzt GM-CSF und IL-4 zur Differenzierung autologer Monozyten und ermöglicht effektive Krebsbehandlungen.

Herstellung von Tumor-Antigen-beladenen reifen dendritischen Zellen für die Immuntherapie

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