Der Einsatz von Reverse Phase Protein Arrays (RPPA) an Protein Expression Variation innerhalb der einzelnen Renal Cell Cancers erkunden

Ziel dieses Verfahrens ist es, die Variation der proteomischen Expression bei Nierenzellkrebs mit Hilfe von Reverse-Phase-Protein-Arrays (RPPA) zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst heterogene Bereiche einzelner Tumoren kartiert und ausgewählt werden. Der zweite Schritt besteht darin, Proteine aus den Proben zu extrahieren.

Als nächstes werden die Proteine normalisiert und auf RPPA-Objektträger gedruckt. Der letzte Schritt besteht darin, die Objektträger mit Antikörpern gegen interessante Proteine zu analysieren. Letztendlich wird RPPA verwendet, um die differentielle Variation der proteomischen Expression in zwei Behandlungsgruppen von Nierenzellkrebs zu zeigen.

Diese Methode kann helfen, einige der wichtigsten Fragen auf dem Gebiet des Nierenzellkrebses zu beantworten. Dafür besteht eine große Proteinheterogenität. Die Implikationen für diese Technik sind, dass sie sich positiv auf die Behandlung von Patienten mit Nierenzellkrebs auswirken kann, die mit zielgerichteten Therapien behandelt werden.

Dies liegt daran, dass wir sowohl die Heterogenität vor als auch nach der Behandlung in Gewebeproben untersuchen und so hoffentlich neue medikamentöse Ziele für Patienten identifizieren können, die eine erworbene Resistenz gegen diese Behandlungen entwickeln. Die Leiterin des Forschungslabors, Helen Caldwell, wird den Kryostaten und das H-Knie-Verfahren vorführen, während die Forschungstechnikerin unserer Gruppe, Jo Nanda, die Proteinextraktionstechnik vorführen wird. Den OP-PPA-Druck wird unser Kollege aus St.Andrews, Peter Mullen, vorführen.

Um diesen Vorgang zu starten, nehmen Sie Tumore aus dem minus 80 Grad Celsius heißen Gefrierschrank und bewahren Sie sie auf Trockeneis auf. Unterteilen Sie Tumoren in Abschnitte von etwa einem Zentimeter Würfel. Ordnen Sie die ursprüngliche Position jedes Tumorabschnitts relativ zueinander zu und beschriften Sie sie mit einem eindeutigen Namen.

Die Proben werden in OCT beschichtet und in einem Kryostaten von minus 22 Grad Celsius geschnitten, nachdem die Proben gefärbt wurden. Analysieren Sie die Schnellschnitte mit der Färbemethode für Hämat-, Toin- und DSN-Zähler durch Mikroskopie. Stellen Sie sicher, dass es sich bei den Schnitten um einen lebensfähigen Tumor des klarzelligen Nierenzellkarzinoms handelt, und stufen Sie sie als hochgradig, niedriggradig oder gemischt niedrig- und hochgradig ein.

Wählen Sie bis zu vier Proben aus jeder morphologisch unterschiedlichen Region innerhalb jedes Tumors für die Proteinextraktion aus, die als nächstes zur Extraktion von Proteinen aus Tumorproben demonstriert wird. Legen Sie 50 bis 75 Milligramm Taschentücher. Schneiden Sie aus einem CT in zwei Milliliter-Röhrchen.

Fügen Sie 990 Mikroliter Lysepuffer hinzu, ergänzt mit einem Protein in und Phosphatase- und Proteasehemmern. Geben Sie eine einzelne fünf Millimeter schwere Stahlkugel in jedes Röhrchen und homogenisieren Sie sie fünf Minuten lang bei 50 Hertz. Mit einem Gewebelaser.

Überprüfen Sie den Homogenisierungsgrad und homogenisieren Sie dann weitere fünf Minuten lang. Übertragen Sie die homogenisierte Probe mit einer Pipette in ein neues Zwei-Milliliter-Röhrchen, lassen Sie die Stahlkugel hinter 10 Mikrolitern Triton X 100 zu jeder Probe und zentrifugieren Sie sie dann 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius bei 13.000 Mal G. Die S-Überstände werden in frische Mikrozentrifugenröhrchen überführt und die Proteinkonzentration mit dem BCA-Assay bestimmt.

Normalisierte Proteinkonzentrationen auf ein Milligramm pro Milliliter vor unserem PPA-Druck. Von jeder Probe wird eine Reihe von fünf zweifachen Verdünnungen vorgenommen. Einer der zeitaufwändigsten Aspekte dieses Verfahrens besteht darin, Hunderte von Verdünnungen erfolgreich zu machen, indem vor dem Drucken von Objektträgern eine doppelte Überprüfung durchgeführt wird.

Ein Microgrid-Zwei-Roboter-Spotter wird dann verwendet, um Proteinlysate auf mit Nitrozellulose beschichteten Glasobjektträgern zu erkennen. Jede Probe wird in dreifacher Ausfertigung gefleckt, was zu insgesamt 15 Flecken pro Probe führt. Die Objektträger, die in diesem Experiment verwendet wurden, enthielten zwei Pads, auf denen die Proben aufgetümmelt wurden.

Jedes Pad wurde mit identischen Proben gesichtet, in diesem Fall 100 Proben. Zu den weiteren verfügbaren Formaten gehören eine Folie mit acht und 16 Pads. Je höher die Anzahl der Pads, desto geringer ist die Anzahl der Samples, die sich auf jedem Pad befinden können.

Um das Verfahren für den Proteinnachweis zu beginnen, werden Sie einen Feuchtobjektträger, einen überschüssigen Blockierungspuffer und eine Stunde lang bei Raumtemperatur bei Raumtemperatur inkubieren, 800 Mikroliter Primärantikörper in Blockierungspuffer in den gewünschten Konzentrationen vorbereiten und auf Eis legen. Nach der einstündigen Inkubation. Im Blockierungspuffer werden die Objektträger entweder in den Einzelrahmen-Chipclip oder in den Schnellrahmen-Objektträgerhalter mit vier Basen montiert, so dass eine dichte Abdichtung zwischen dem Objektträger und der Inkubationskammer gebildet wird.

Entfernen Sie den Restpuffer aus den Wells und geben Sie 600 Mikroliter Primärantikörper in die entsprechenden Wells. Legen Sie die Objektträger und die Kammer in eine verschlossene Nassbox und inkubieren Sie sie am nächsten Morgen über Nacht bei vier Grad Celsius auf einer Schaukelplattform. Entnehmen Sie die Objektträger aus dem Kühlraum.

Entfernen Sie vorsichtig die primären Antikörper von jedem. Nun, fügen Sie 600 Mikrofreisetzungen von 0,1 % PBS zwischen 20 oder PBST hinzu und waschen Sie die Objektträger auf einer Schaukelplattform bei Raumtemperatur fünf Minuten lang. Ersetzen Sie auf diese Weise das PBST durch frisches PBST.

Waschen Sie die Objektträger insgesamt dreimal. Entfernen Sie den Puffer aus den Vertiefungen und geben Sie 600 Mikroliter fluoreszenzmarkierte Sekundärantikörper in der entsprechenden Verdünnung in die jeweiligen Vertiefungen. Inkubieren Sie mit Sekundärantikörpern bei Raumtemperatur für 45 Minuten unter leichtem Schütteln, es ist wichtig, die Membran bis zum Zeitpunkt des Scannens vor Licht zu schützen.

Entfernen Sie nach 45 Minuten die Sekundärantikörper aus den Vertiefungen und waschen Sie sie dreimal kurz in 600 Mikrolitern PBST bei Raumtemperatur. Nehmen Sie die Objektträger aus der Transportbox, geben Sie sie in einen geeigneten Behälter und waschen Sie überschüssiges PBST 15 Minuten lang. So bleibt die Membran im Dunkeln.

Entfernen Sie PBST und waschen Sie die Membran 15 Minuten lang bei Raumtemperatur mit PBS, um die Reste von Tween 20 wieder zu entfernen und die Membran im Dunkeln zu halten. Probieren Sie die schnellen Folien 10 Minuten lang in einem 50 Grad Celsius heißen Ofen. Zum Schluss scannen Sie die Objektträger als 680 Nanometer und/oder 800 Nanometer, abhängig von den verwendeten Sekundärantikörpern.

Achten Sie darauf, die Objektträger bis zum Scannen im Dunkeln aufzubewahren. Speichern Sie Bilder als T-Dateien. Ein Beispiel für einen gescannten RPPA-Objektträger ist in dieser Abbildung zu sehen, wobei sowohl 680- als auch 800-Nanometer-Kanäle dargestellt sind.

Durch die Trennung der Bilder nach Wellenlänge kann jedes Pad auf dem RPPA-Objektträger analysiert und die individuelle Proteinexpression bestimmt werden, wie hier gezeigt. Die Expression einzelner Proteine in den Proben ist einzigartig, wobei Gelsoin im Vergleich zu cmic, das eine viel geringere Proteinexpression aufweist, aber immer noch universell über alle getesteten Proben exprimiert wird, ein hohes Maß an Expression über den Objektträger aufweist. Im Gegensatz dazu zeigte CD 10 eine variable Expression, wobei bestimmte Samples ein hohes Maß an Expression ergaben, während andere Samples nur eine geringe oder gar keine Expression nachweisbar hatten.

Schließlich konnte p JK zwei keine nachweisbare Proteinexpression über dem Hintergrundniveau erzeugen. Die nächste Abbildung unterstreicht das Fehlen einer Kreuzreaktivität zwischen Sekundärantikörpern und Primärantikörpern einer anderen Spezies. Das Bild unten links zeigt den Nachweis der Proteinexpression mit Sekundärantikörpern, die bei der richtigen Wellenlänge von 680 Nanometern gescannt wurden.

dem Bild rechts, das bei der falschen Wellenlänge von 800 Nanometern gescannt wurde, ist die Proteinexpression nicht zu erkennen. Ein Beispiel für die Superkurve, die für die vergleichende Analyse aller Proben auf dem RPPA-Objektträger verwendet wird, ist hier dargestellt. Die grünen Punkte stellen akzeptable Punkte dar und rote Punkte stellen Ausreißer dar, die auf vordefinierten Grenzwerten in der Analysesoftware basieren.

Die Superkurve wird verwendet, um relative proteinbasierte Expressionsdaten zu erzeugen. Diese Abbildung zeigt die Expressionsniveaus eines repräsentativen Proteins mlh eins über drei RPPA-Objektträger und zeigt, wie RPPA Unterschiede zwischen behandelten und unbehandelten Proben erkennen kann. Jede Probe entspricht hier einer Tumorsubregion.

Die nächste Abbildung zeigt die differentielle Proteinexpression für mlh eins, nachdem die Proben auf der Grundlage der Behandlung gruppiert wurden. In der Vorbehandlungsgruppe wurde eine höhere MLH-Eins-Expression gefunden, wenn die intratumorale Varianz in der MLH-Eins-Expression zwischen Vor- und Nachbehandlungsproben berechnet wird. Nach der Gruppierung der Proben nach der Behandlung wurde eine höhere Varianz bei den Proben nach der Behandlung beobachtet.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie PPA für die Untersuchung der Proteinheterogenität verwenden können.