Die Citrobacter rodentium Mouse Model: Studieren Erreger und Wirt Beiträge zur Infectious Colitis

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Kolitis durch Infektion von Mäusen mit dem gramnegativ spiegelnden Erreger Citrobacter Nagetier zu induzieren, was die Untersuchung von Erreger- und Wirtsinteraktionen im Magen-Darm-Trakt ermöglicht. Dies wird erreicht, indem zuerst geimpft wird, eine Kultur der Null-Erlösung über Nacht. Im zweiten Schritt werden Mäuse durch orale Sonde mit dem Overnight-Inokulum infiziert.

Am siebten Tag nach der Infektion werden im letzten Schritt der Blinddarm und der luminale Inhalt entnommen. Das Gewebe wird plattiert, die Bakterienkolonien werden gezählt und die Gewebe werden für die interessierenden Wirtsproteine immungefärbt. Letztendlich können die Erregerlast, die Barrierefunktion, histologische Schädigungen und Veränderungen der Wirtsantwort durch Immunhistochemie beurteilt werden.

Obwohl diese Methode ein robustes Modell der infektiösen Kolitis bietet, das die Untersuchung von Interaktionen zwischen Wirtserregern und Immunantworten ermöglicht, kann sie auch angepasst werden, um die Auswirkungen einer bakteriellen Infektion auf das Darmkrebsrisiko zu untersuchen. Im Allgemeinen würden die Individuen, die neu in dieser Methode sind, natürlich mit der bakteriellen Infektion der Mäuse kämpfen, mit oder mit oder Gage. Beginnen Sie mit der Verwendung einer sterilen Impfschlaufe, um eine lebensfähige C-Einlösung aus einem gefrorenen Glycerinvorrat auf eine LB-Galvanplatte zu ziehen.

Nach der Inkubation über Nacht bei 37 Grad Celsius verwenden Sie eine Impfschlaufe, um die Kolonien von der LB-Platte auf drei Milliliter sterile LB-Brühe zu übertragen. Als nächstes inkubieren Sie die ERO Dunum-Kultur aerob in einem Tisch-Inkubationsschüttler bei 200 U/min über Nacht bei 37 Grad Celsius. Am nächsten Morgen sollte die geimpfte lb Brühe trüb erscheinen.

Rühren Sie die Kultur vorsichtig um, um die Bakterienzellkultur gleichmäßig zu verteilen, und füllen Sie dann eine Ein-Milliliter-Spritze mit Brühe und befestigen Sie sie an einer Magensondennadel. Wählen Sie eine Maus für die Sonde, indem Sie die lose Haut über Hals und Rücken mit der Oberhand und den Fingern fest greifen. Ziehen Sie dann den Kopf des Tieres mit einem Zeigefinger zurück, um den Kopf des Tieres ruhigzustellen und die Speiseröhre für das Einsetzen zu begradigen.

Halten Sie die Maus in einer aufrechten Position und richten Sie die Zwiebelspitze der Magensondennadel an der Seite des Mauls des Tieres entlang und über seine Zunge. Führen Sie die Nadel vorsichtig am Gaumen des Tieres entlang und schieben Sie die Nadel in die Speiseröhre. Zum Schluss injizieren Sie mit der Spritze langsam 100 Mikroliter des bakteriellen Inokulums und entfernen Sie dann vorsichtig die Sondennadel.

Überwachen Sie die Atemfrequenz und das Verhalten der Maus nach der Rückgabe des Käfigs am Tag des Assays, reinigen Sie die Maus wie gerade demonstriert und versorgen Sie das Tier dann mit 150 Mikrolitern frisch zubereitetem Fitzy Dextrin. Entnehmen Sie zu diesem Zeitpunkt, vier Stunden nach der Sonde, das Futter aus dem Käfig und dann die Sedierung des Tieres. Verwenden Sie eine Herzpunktion, um so viel Blut wie möglich von dem anästhesierten Tier zu sammeln.

Geben Sie das Blut in eine Endkonzentration von 3 % Säurecitrat-Dextrose in ein Mikrozentrifugenröhrchen, um die Gerinnung zu verhindern. Als nächstes schleudern Sie die Blutproben 12 Minuten lang bei 1000 Käse und vier Grad Celsius herunter. Sammeln Sie dann das Serum und dutieren Sie es auf eins bis 10 und eins bis 100 in PBS bei 100 Mikrolitern jeder Probe.

Bei diesen beiden Verdünnungen auf eine 96-Well-Platte in doppelter Ausführung. Um die Standardkurve vorzubereiten, verdünnen Sie 100 Mikroliter Proben der ursprünglichen 80 Milligramm pro Milliliter. Fitz Dextrin wurde verwendet, um die Mäuse in PBS in dunklen Mikrozentrifugenröhrchen zu reinigen.

Geben Sie dann die Standardproben in dreifacher Ausfertigung auf eine 96-Well-Platte. Verwenden Sie dann ein Fluorimeter, um die Fluoreszenz jeder Probe zu quantifizieren und die FXI-Dextrinkonzentration mit aseptischer Technik zu bestimmen. Beginnen Sie diesen Schritt, indem Sie einen Milliliter steriles PBS und eine Autoklav-Metallperle zu einem runden Boden von zwei Milliliter-Zentrifugenröhrchen hinzufügen. Wiegen Sie dann jedes Röhrchen.

Nachdem Sie das Seum und den Doppelpunkt von der Maus entfernt haben, trennen Sie das Seum vom Doppelpunkt und schneiden Sie sie in Längsrichtung auf. Sammeln Sie den luminalen Inhalt mit einer Pinzette und geben Sie den Inhalt in ein Röhrchen PBS. Waschen Sie das Folge- und Dickdarmgewebe mit sterilem PBS, bevor Sie es in separate Röhrchen geben.

Wiegen Sie nun die Röhrchen mit dem Gewebe und homogenisieren Sie die Proben mit einem Rührbesen für sechs Minuten. Bei 30 Hertz geben Sie 180 Mikroliter steriles PBS pro Vertiefung auf eine 96-Well-Platte. Geben Sie dann 20 Mikroliter jeder homogenisierten Probe in die erste Vertiefung in jeder Reihe und mischen Sie sie gut.

Verdünnen Sie die Proben seriell, indem Sie 20 Mikroliter aus jeder vorherigen Vertiefung hinzufügen, um eine Verdünnung von 10 auf minus eins in der ersten Vertiefung auf 10 auf minus sechs zu erhalten. Platten dann 10 Mikroliter jeder Verdünnung aus jeder Probe in dreifacher Ausfertigung auf eine LB-Platte mit quadratischem Boden und einem Gitter nach einer Inkubation über Nacht bei 37 Grad Celsius. Zählen Sie die koloniebildenden Einheiten auf einer Platte.

Mittelwerten Sie die Triplikate für jede Probe und notieren Sie dann die Verdünnung, mit der jede Probe gezählt wurde. Multiplizieren Sie die durchschnittliche KBE mit 50 und mit dem Verdünnungsfaktor, bei dem die Probe gezählt wurde, so dass sich KBE pro Milliliter ergibt. Zum Schluss dividieren Sie durch das Gewebegewicht, um die KBE pro Gramm nach Übernacht, Formalisierung und Fixierung des zuvor eingesparten 0,5 Zentimeter dicken Dickdarm- und Secum-Schnitts zu bestimmen.

Am nächsten Morgen waschen Sie das Gewebe mit 70%igem Ethanol und legen Sie es in eine Kassette, um es an eine Histologieeinrichtung zu senden, wo es in Paraffin eingebettet und mit Hämatin und Eosin gefärbt wird, um das Gewebe zu entschärfen. Legen Sie die Objektträger in einen Coplan-Färbebehälter für 10 Minuten in ein 65 Grad heißes Wasserbad. Legen Sie nun die Objektträger für vier Wäschen von zwei Minuten in Xylol.

Rehydrieren Sie die Objektträger jeweils mit zwei fünfminütigen Waschgängen und 100 % Ethanol, gefolgt von einer fünfminütigen Wäsche in jeder der folgenden Behandlungen: 95 % Ethanol, 75 % Ethanol und destilliertes Wasser. Legen Sie die gewaschenen Objektträger in ein Coplan-Glas mit vorwarmem Natriumcitratpuffer und stellen Sie das Glas dann für 30 Minuten in einen Dampfgarer, nachdem Sie das Glas weitere 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen haben, waschen Sie die Objektträger dreimal fünf Minuten lang mit PBS Zied.

Wenn die Objektträger trocken sind, markieren Sie den Bereich um das Gewebe herum mit einem Pap-Stift. Blockieren Sie dann das Gewebe mit Blockierungspuffer in einer immunfärbenden Feuchtigkeitskammer bei Raumtemperatur. Nach einer Stunde gießen Sie den Blockierungspuffer ab und inkubieren das Gewebe in 50 bis 100 Mikrolitern Primärantikörper bei vier Grad Celsius über Nacht.

Waschen Sie das Taschentuch nach der Inkubationszeit dreimal fünf Minuten lang mit PBS Azi. Dann inkubieren Sie die Objektträger in 50 bis 100 Mikrolitern des Sekundärantikörpers nach einer Stunde im Dunkeln bei Raumtemperatur, waschen Sie die Objektträger dreimal fünf Minuten lang mit destilliertem Wasser. Zum Schluss dehydrieren Sie das Gewebe, bedecken Sie die Objektträger mit dpi, einem verlängerten Goldeinbettmedium, und tragen Sie dann ein Deckglas auf, auf dem Sie die Objektträger unter einem Fluoreszenzmikroskop betrachten.

Diese erste Abbildung zeigt Fitz-Dextrin, das im Serum von C 57 schwarzen sechs Mäusen gemessen wurde, sowie von Toll-like-Rezeptor-zu-Knockout-Mäusen, bei denen zuvor festgestellt wurde, dass sie während der Infektion in Gegenwart einer intakten Darmepithelbarriere eine beeinträchtigte Integrität der Epithelbarriere aufwiesen. ZI-Dextrin ist durch diese Schicht hindurch schlecht durchlässig. Daher deuten erhöhte Spiegel von Fitz-Dextrin im Serum auf eine Beeinträchtigung der Integrität der Darmepithelbarriere während der Infektion hin, so dass dieses Molekül als Kontrollserumspiegel bei nicht infizierten Mäusen durchsickern kann.

Auch eine Sonde mit Fitz-Dextrin wird vorgestellt. Assent ist ein luminaler Krankheitserreger, der sich eng an Darmepithelzellen anheften kann. Die bakterielle Belastung im luminalen Inhalt, im Folge- und im Dickdarmgewebe kann am siebten Tag liegen. Nach der Infektion.

Es wurde festgestellt, dass die bakterielle Belastung im Dickdarm einen Spitzenwert von etwa 10 bis neun KBE pro Gramm erreicht. Der größte Teil der Pathologie, die während einer C DUM-Infektion bei C 57 PL sechs Mäusen beobachtet wurde, tritt makroskopisch in den distalen zwei Zentimetern des Dickdarms am siebten Tag nach der Infektion auf. Eine Verdickung der Dickdarmschleimhaut sowie eine Verkürzung und Länge des Dickdarms ist bei einer Infektion normal zu beobachten.

C 57 PL sechs Mäuse leiden nur an mäßigen Entzündungen und Pathologien, die histologisch durch Immunzellinfiltration, Verlängerung der Dickdarmkrypten und Koitzelldepletion gekennzeichnet sind. Um die Reaktionen des Wirts während der Infektion ohne Erlösung weiter zu charakterisieren, kann die Immunfluoreszenzfärbung verwendet werden, um Veränderungen in den interessierenden Proteinen, wie z. B. den Markern der Proliferation, oder bei der Untersuchung von Aspekten der bakteriellen Reaktion, wie z. B. ihrer Lokalisation im infizierten Gewebe, zu untersuchen. Ein Beispiel für diese Färbetechnik, die Untersuchung des Wirtsproteins KI 67, eines Marker für die Zellproliferation, der in Rot erscheint, und des Null-De-Proteinrisses, der in Grün erscheint, um die bakterielle Lokalisation am Tag 12 nach der Infektion zu untersuchen, ist in dieser Abbildung dargestellt.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in wenigen Minuten durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, dass die Messtechnik ordnungsgemäß durchgeführt wird, um sicherzustellen, dass die Mäuse infiziert sind und dass die Gesundheit des Tieres während des gesamten Verlaufs der Infektion überwacht wird. In den letzten 10 bis 15 Jahren hat sich das Citrobacter-Nagetiermodell zum Goldstandard für die Untersuchung der Anhaftung von bakteriellen Krankheitserregern wie epec im Teufel entwickelt.

Darüber hinaus ist es zu einem anerkannten Modell für die Untersuchung der Immunantworten der Schleimhaut auf Bakterien geworden, wie z. B. die Entwicklung von TH-17-Antworten im Darm.