Verbessertes Protokoll für Laser Mikrodissektion Of Human Pankreasinseln Von chirurgischen Proben

Hallo, mein Name ist Dorte vom Thea Hands Institute an der Technischen Universität, Reen Laser. Die Mikrodissektion ist eine Technik, die es ermöglicht, aus sehr kleinen Mengen des Muttertumors eine spezielle Zellpopulation zu gewinnen. Die präparierten Zellen können für transkriptomische und proteomische Studien, DNA-Bewertungen oder Chromosomenanalysen verwendet werden.

Hier stellen wir unser Protokoll für die Gewinnung humaner Pankreas-Metazellen aus chirurgischen Proben zur Verfügung, die für transkriptomische Studien verwendet werden sollen. Schneiden Sie das Bauchspeicheldrüsengewebe in kleine Stücke. Legen Sie ein Stück in die Mitte einer Kryoform und bedecken Sie es mit gekühlter Einbettmasse

Das Taschentuch sofort einfrieren Mit zwei Materialien Bhutan gekühlt und bei minus 80 Grad Celsius lagern. Etikettieren Sie 40 Klebeobjektträger und kühlen Sie sie in der Christed Chamber vor. Fixieren Sie das gefrorene Gewebe mit dem OCT-Compound auf dem Probenhalter, nachdem Sie den Kryoblock getrimmt haben.

Schneiden Sie 40 10 Mikrometer dicke Abschnitte. Übertragen Sie einen Abschnitt auf einen Objektträger, indem Sie die Rückseite des Objektträgers mit dem Finger berühren, um nur die Position zu erwärmen, an der der Schnitt darauf platziert werden kann. Probieren Sie die Abschnitte zwei bis drei Minuten in den Kryos tot aus und lagern Sie sie anschließend bei minus 80 Grad Celsius, bereiten Sie die Ation-Reagenzien vor und kühlen Sie alle Flüssigkeiten außer Seline auf Eis. Dadurch wird die intrinsische Autofluoreszenz von Haustierzellen vor der Mikrodissektion erhöht.

Jedes Mal werden vier Abschnitte herabgestuft. Behandeln Sie zwei Abschnitte gleichzeitig. Fixieren Sie sie zuerst 30 Sekunden lang in 70%igem Ethanol.

Waschen Sie dann die Abschnitte mit fünf bis sechs schnellen Dips. Im Folgenden in DPC-behandeltem Wasser. Dehydrieren Sie das Gewebe eine Minute lang in 100%igem Ethanol und wiederholen Sie diesen Schritt, inkubieren Sie die Objektträger vier Minuten lang in seline.

Beginnen Sie in der Zwischenzeit mit der Dehydrierung eines weiteren Abschnittspaares. Zum Schluss trocknen Sie die Objektträger drei bis fünf Minuten lang im Dunkeln an der Luft. Schützen Sie das Gewebe vor Feuchtigkeit und die Autofluoreszenz vor Bleichen, indem Sie die beiden Objektträger Rücken an Rücken in eine Folie legen. Wrap 50 ml Tube Reinigen Sie vor dem Schnitt das Mikroskop mit RNAs und klemmen Sie die Klebekappe in den robo Mover.

Setzen Sie die Folie in die Bühne ein und schieben Sie die Kappe eng über den Abschnitt, ohne sie zu berühren. Lokalisieren Sie die Ösen, indem Sie die autofluoreszierenden besseren Zellbereiche identifizieren. Die intrinsische Autofluoreszenz menschlicher besserer Zellen erscheint im Aufbau gelb, während die Pankreasgänge eine hellgrüne Autofluoreszenz aufweisen.

Wählen Sie mit dem Freihand-Auswahlwerkzeug die besseren Zellbereiche aus und zerlegen Sie sie durch Starten des Lasers. Präparieren Sie die Ösen von vier degradierten Kryo-Abschnitten innerhalb von 40 bis 60 Minuten in eine Klebekappe. Falls gewünscht, überprüfen Sie das erfasste Gewebe, indem Sie die Kappe an den Kontrollpunkt des Mikroskops bewegen.

Entfernen Sie die Kappe aus dem Robo Mover und spritzen Sie sie. 10 Mikroliter Extraktionspuffer in den Deckel der Kappe zur Zellaufschluss. Inkubieren Sie die Kappe kopfüber bei 42 Grad Celsius für 30 Minuten.

Schleudern Sie das Lysat herunter, markieren Sie das Röhrchen und lagern Sie es bei minus 80 Grad Celsius, bis die RNA-Extraktion erfolgen kann. Führen Sie den Ation-Laser, die Mikrodissektion und die Lyse mit allen 40 Kryo-Dissektionen durch. Vereinen Sie anschließend die 10 Lysate und fahren Sie mit der RNA-Isolierung mit dem UR PU RNA-Isolationskit fort, indem Sie dem mitgelieferten Protokoll folgen, um 11 Mikroliter RNA zu erhalten.

Im Allgemeinen fanden wir keinen direkten Zusammenhang zwischen der Menge des Mikrodisektgewebes und der RNA-Ausbeute. Unterschiede im Zeitintervall zwischen der Entnahme durch die Chirurgen und dem Einfrieren der Pankreasprobe nach ihrer Untersuchung durch den Pathologen könnten zum Teil für die theriale Qualität und Quantität der zurückgewonnenen RNA verantwortlich sein. Weitere Schlüsselfaktoren, die zu berücksichtigen sind, sind die Laserenergie, die für die Mikrodissektion mit der niedrigeren Energie und der höheren RNA-Integrität angewendet wird, sowie der Laserfokus und der Abstand der Punkte des Laserdruckschneiders. Zusätzlich kann die RNA-Menge optimiert werden, indem der Abstand zwischen der Klebekappe und der so gering wie möglich gehalten wird.

Vermeiden Sie den Verlust von mikropräpariertem Gewebe während des Aufnahmeprozesses, sofern das Laser-Mikrodissektionsmikroskop verfügbar ist. Dieses Verfahren könnte an allen Forschungseinrichtungen implementiert werden, die partielle Pankreat-Ektomien durchführen, wodurch der Zugang zu menschlichem Augenlidmaterial sowohl von Nicht-Diabetikern als auch von Diabetikern verbessert wird.