Zelle Co-Kultur Strukturierung mit wässrigen Zwei-Phasen-Systeme

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Zellen in vollständig wässrigen Umgebungen direkt zu strukturieren. Dies wird erreicht, indem zunächst langkettige Polymere, wie Polyethylenglykol und Dextrin, in getrennten Röhrchen gelöst werden, die Zellkulturmedium enthalten. Der zweite Schritt besteht darin, Zellen mit der gewünschten Aussaatdichte in einer oder beiden Polymerlösungen zu trypsanisieren, zu ernten, zu pelletieren und zu resuspendieren.

Anschließend werden die Polymerlösungen auf eine Zellkulturschale abgegeben. Die Inkompatibilität der beiden Polymere ermöglicht eine räumliche Strukturierung der beiden vollständig wässrigen Flüssigkeiten. Zellen können entweder in einer Polymerlösung oder in beiden Polymerlösungen enthalten sein, um eine Vielzahl von Mustern zu erzeugen.

Der letzte Schritt besteht darin, die Polymerlösungen zu entfernen, sobald die Zellen vier Stunden oder länger anhaften konnten, und sie durch Kulturmedium zu ersetzen. Letztendlich kann die Hellfeld- oder Fluoreszenzmikroskopie verwendet werden, um die Zellmusterung zu bestätigen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie dem Mikrokontaktdruck besteht darin, dass die Zellen in einer vollständig wässrigen Umgebung mit einfachen Werkzeugen wie Mikrorohrmustern strukturiert werden.

Diese Methode kann für das Tissue Engineering verwendet werden, um die Zellmigration zu beurteilen und die perikrine und autokrine Signalübertragung von Zelle zu Zelle zu untersuchen, was zeigt, dass die Verfahren von einem Abraham, einem Studenten, und Joshua White, einem Doktoranden aus dem Takayama-Labor, durchgeführt werden. Beginnen Sie damit, die beiden verschiedenen Polymere in dem spezifischen Medium aufzulösen, das in Ihren Experimenten verwendet wird. In diesem Beispiel haben Polyethylenglykol, auch bekannt als PEG, und Dextrin, auch bekannt als Dex, Molekulargewichte von 35 Kilodalton bzw. 500 Kilodalton.

Bereiten Sie 16 Zwei-Milliliter-Proben in konischen 15-Milliliter-Röhrchen mit jeweils unterschiedlichen Konzentrationen von PEG und Dex vor, ähnlich wie in der hier gezeigten Tabelle. Wiegen Sie dazu die entsprechenden Mengen an PEG und Dex gemäß der Tabelle ab und mischen Sie sie in das Medium, indem Sie sie vorsichtig schütteln, bis beide Polymere vollständig aufgelöst sind. Dies kann mehrere Stunden dauern, nachdem die Polymere vollständig aufgelöst sind.

Die Lösung sollte trüb sein. Bestätigen Sie die Phasentrennung, indem Sie die Proben fünf Minuten lang bei 1000 g zentrifugieren. Die dichtere untere Phase ist dex-reich.

Die Top-Phase wird Peg Rich sein. Geben Sie dann langsam 0,1 Milliliter zusätzliches Medium in die Röhrchen und wirbeln Sie die Proben 20 Sekunden lang. Zentrifugieren Sie die Proben dann erneut, um sie auf Phasentrennung zu prüfen.

Die Lösung ist klar, nachdem zusätzliche Mengen Medium hinzugefügt wurden, wiederholen Sie diesen Schritt, fügen Sie weitere 0,1 Milliliter Medium hinzu, mischen und zentrifugieren Sie die Proben, bis die Lösung klar wird und sich nicht mehr von der Phase trennt. Dies bedeutet, dass der Schwellenwert für den kritischen Punkt für dieses spezifische Gemisch erreicht wurde. Notieren Sie an dieser Stelle das Endgewicht jedes Rohrs.

Bestimmen Sie abschließend das prozentuale Gewicht pro Gewicht der beiden Polymere am Trennpunkt der Fläche. Plotten Sie die Bin-Knotenkurve, indem Sie die prozentuale Gewichtung pro Gewichtung auf der y-Achse und die prozentuale Gewichtung pro Gewichtung auf der X-Achse platzieren. Diese Kurve ist der Schwellenwert für die Flächentrennung von PEG und Dex in diesem Medium.

Um mit der Ausschlussmusterung von Zellen zu beginnen, bereiten Sie separate Lösungen von PEG und dex mit dem Doppelten ihrer kritischen Punktwerte vor, die durch die Bin-Knoten-Schwelle bestimmt werden. Für diese Experimente werden 5 % Gewicht pro Gewicht PEG und 12,8 % Gewicht pro Gewicht Decks mit 10 % FBS und 1 % Antibiotika zu DMEM hinzugefügt. Die Röhren werden auf eine Wippe gelegt, damit sie sich vollständig auflösen können.

Als nächstes ernten Sie die Zellen, die für die Ausschlussmusterung für dieses Experiment verwendet werden sollen, Helazellen bei 80 % Konfluenz werden drei Minuten lang mit 0,5 % Tripsin trypsinisiert. Nach der Ernte die Anzahl der Zellen mit einem Hämozytometer zählen, dann die Zellen pelletieren und resuspendieren Sie sie bei 375.000 Zellen pro Milliliter in Medium mit 5 % PEG. Diese Konzentration führt zu Proben, die bei Kultivierung am nächsten Tag konfluent werden.

Geben Sie anschließend mit einer Mikropipette 0,5 Mikroliter der 12,8%igen Decklösung auf eine trockene 96-Well-Platte, um die Strukturierung auszuschließen. Dex-Tröpfchen können für die spätere Verwendung unter sterilen Bedingungen trocknen gelassen werden. Geben Sie dann langsam 200 Mikroliter PEG Hela-Zellsuspension in die Vertiefung.

Um die D-Tröpfchen abzudecken, ist es wichtig, zuerst das D-Tröpfchen mit der PEG-Lösung zu bedecken, bevor die umliegenden Bereiche aufgefüllt werden, da dies verhindert, dass es das Tröpfchen stört, wenn es sich über die Vertiefung ausbreitet. Nachdem alle Vertiefungen sorgfältig strukturiert und ausgesät wurden, stellen Sie die Zellkulturplatte in einen befeuchteten Inkubator. Stellen Sie sicher, dass die Schale während der Handhabung nicht gekippt wird und dass sie auf ein ebenes Inkubatorregal gestellt wird, um eine Störung der Muster zu vermeiden, nachdem die Zellen 12 Stunden lang haften gelassen wurden.

Entfernen Sie die PEG-Lösung und waschen Sie sie dreimal mit 200 Mikrolitern Nährmedium, um alle Polymerreste zu entfernen. Fügen Sie dann 200 Mikroliter frisches Nährmedium hinzu und stellen Sie die Platte wieder in den Inkubator. Überwachen Sie die Kulturen regelmäßig, um die Zellproliferation und Migration in die Sperrzonen zu beobachten. Beginnen Sie mit der Strukturierung der Insel.

Bereiten Sie Lösungen mit 5 % Gewicht pro Gewicht PEG und 12,8 % Gewicht pro Gewicht in Zellkulturmedium vor. Ernten Sie auch die Hela-Zellen, die für die Inselmusterung verwendet werden sollen, und bestimmen Sie erneut die Gesamtzahl der verfügbaren Zellen mit einem Hämozytometer. Als nächstes Pellet und Reanimation.

Schleudern Sie die Zellen mit 5 Millionen Zellen pro Milliliter im Medium. Bei einem weiteren 12,8%-Dex kann eine höhere Konzentration von Zellen erforderlich sein, um die Konfluenz innerhalb von 24 Stunden zu erreichen, wenn die Zellen nicht so gut haften wie die Fersenzellen. Pipettieren Sie anschließend 200 Mikroliter PEG-Lösung in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte.

Geben Sie dann langsam einen 0,5-Mikroliter-Tropfen Deckzellensuspension in jede Vertiefung, die die PEG-Lösung enthält. Die Tröpfchen sinken auf den Boden und berühren die Kulturoberfläche. Schieben Sie die Platte dann vorsichtig in den Inkubator und achten Sie darauf, dass die Schale an keiner Stelle kippt, da dies die Muster nach 12 Stunden stören könnte.

Entfernen Sie die PEG-Lösung und waschen Sie sie dreimal mit 200 Mikrolitern Nährmedium. Fügen Sie dann 200 Mikroliter frisches Nährmedium hinzu und stellen Sie die Platte wieder in den Inkubator. Überwachen Sie die Kulturen regelmäßig, um die Zellproliferation und die Wanderung von den Inseln nach außen zu beobachten.

Beginnen Sie mit der Co-Kultur-Strukturierung, indem Sie Lösungen von 5 % Gewicht pro Gewicht PEG und 12,8 % Gewicht pro Gewicht in DMEM mit 10 % FPS und 1 % Antibiotika wachsen auch die beiden Zelltypen auf, die in der Ausschluss- und Inselmusterung verwendet werden sollen, so dass sie nahe der Konfluenz liegen. Gleichzeitig werden wir hier Hep G zwei C3 a Hepatozyteninseln mit NIH drei T drei Fibroblasten verwenden, die sie umgeben. Ernten Sie dann die beiden Zelltypen und zählen Sie sie getrennt mit einem Hämozytometer.

Diese beiden Zelltypen können mit Hilfe von Hellfeldmikroskopie-Pellets leicht unterschieden werden, wobei die beiden Hepatozyten Hep3 A für die Inselstrukturierung und die Reanimation in 12,8%-Decks verwendet werden. Pelletieren Sie dann die Fibroblasten für den Ausschluss, die Musterung und die Wiederbelebung in 5%PEG. Geben Sie anschließend 0,5 Mikroliter D-Zell-Suspension auf eine trockene 96-Well-Platte und bedecken Sie die Dex-Tröpfchen vorsichtig mit 200 Mikrolitern Peg-Zellsuspension.

Übertragen Sie die Platte dann nach 12 Stunden in einen Inkubator. Entfernen Sie das Medium und spülen Sie es dreimal mit 200 Mikrolitern Nährmedium aus. Fügen Sie dann 200 Mikroliter frisches Nährmedium hinzu und stellen Sie die Platte wieder in den Inkubator.

Schließlich kann die Albumin-Färbeintensität der Kokulturen überwacht werden, um die vorteilhaften Wirkungen der Fibroblasten-Cokultur zu beurteilen. Die Polymerkonzentrationen, die erforderlich sind, um eine Vielzahl von wässrigen Zweiphasensystemen zu bilden, werden hier durch die Bin-Knotenkurven bei Konzentrationen oberhalb der Bin-Knotenkurve beschrieben. Das System bildet zwei Phasen unterhalb der Bin-Knotenkurve aus.

Die Lösung ist ein transparentes einphasiges zweiphasiges System von mindestens zweimal. Die Konzentrationen der auf der binalen Kurve gefundenen Konzentrationen sind ausreichend für den Einsatz in den in diesem Video beschriebenen wässrigen Zweiphasensystemen. Das erste Beispiel für ihre Verwendung ist eine Ausschlussmusterung, bei der kleine Flächen ohne Zellen gelassen werden können.

Bei der Inselmusterung entsteht das genaue Gegenteil der Ausschlussstrukturierung, bei der kleine Bereiche mit Zellen platziert werden können. Die Kombination dieser beiden Verfahren kann genutzt werden, um eine einzigartige Co-Kultur zu bilden, bei der eine Zellinsel von einem anderen Zelltyp umgeben sein kann, wie hier gezeigt. Hela-Zellen, die mit Ausschlussmustern plattiert werden, vermehren sich und wandern, um die Lücke zu füllen.

mit der Zeit. Die Größe des Hohlraums kann überwacht werden, um wertvolle Einblicke in die Zellmigration und das Zellwachstum unter verschiedenen Bedingungen zu erhalten. Auf der anderen Seite kann die Inselmusterung verwendet werden, um das Zellwachstum zu messen.

Die Kombination von Insel- und Exklusionsmustern führt zu klar definierten Regionen der Kokultur. Hier sind Inseln von Hepatozyten zu sehen, die von Fibroblastenzellen umgeben sind. Es hat sich herausgestellt, dass diese Kolonien ihre Organisation mindestens vier Tage lang in Kultur beibehalten.

Mit diesem System können mehrere Zellinseln auf derselben Platte gezüchtet werden. Wenn sie nur als Inseln gezüchtet wurden, produzierten Hepatozyten etwas weniger Albumin als wenn sie in Co-Kultur mit Fibroblasten gezüchtet wurden. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, Polymerkonzentrationen mit der doppelten kritischen Konzentration zu verwenden, um zweiphasige Lösungen zu bilden.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein wässriges Zweiphasensystem formuliert und es zur Strukturierung von Zellen und zur Definition von Geometrien verwendet.