Name: Entwicklung, Erweiterung und In vivo Monitoring von humanen NK Zellen aus humanen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) und und induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: Erfahren Sie die Entwicklung und Expansion humaner NK-Zellen aus hES- und iPS-Zellen mittels definiertem Zytokin-Protokoll. Diese feeder-freie Methode ermöglicht funktionelle Assays und In-vivo-Monitoring für Immuntherapieforschung.

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Die Autoren bedanken sich bei Melinda Hexum zur Initiierung der Spin EB Protokoll danken in unserem Labor. Wir möchten an die anderen Mitglieder des Labors, darunter Laura E. Bendzick, Michael Lepley und Zhenya Ni für ihre technische Unterstützung bei dieser Arbeit danken. Die Autoren möchte auch Brad Taylor bei Caliper Life Sciences danken für seine kompetente technische Beratung.

<ol><li>Keller, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+differentiation+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">In vitro differentiation of embryonic stem cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 7, 862-869 (1995).</li>
<li>Kaufman, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+colony-forming+cells+derived+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic colony-forming cells derived from human embryonic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 98, 10716-10721 (2001).</li>
<li>Kaufman, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+clinical+therapies+using+hematopoietic+cells+derived+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Toward clinical therapies using hematopoietic cells derived from human pluripotent stem cells.</a> Blood. 114, 3513-3523 (2009).</li>
<li>Ng, E. S., Davis, R., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+describing+the+use+of+a+recombinant+protein-based%2C+animal+product-free+medium+%28APEL%29+for+human+embryonic+stem+cell+differentiation+as+spin+embryoid+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A protocol describing the use of a recombinant protein-based, animal product-free medium (APEL) for human embryonic stem cell differentiation as spin embryoid bodies.</a> Nature Protocols. 3, 768-776 (2008).</li>
<li>Ng, E. S., Davis, R. P., Azzola, L., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forced+aggregation+of+defined+numbers+of+human+embryonic+stem+cells+into+embryoid+bodies+fosters+robust%2C+reproducible+hematopoietic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Forced aggregation of defined numbers of human embryonic stem cells into embryoid bodies fosters robust, reproducible hematopoietic differentiation.</a> Blood. 106, 1601-1603 (2005).</li>
<li>Vodyanik, M. A., Bork, J. A., Thomson, J. A., Slukvin, I. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cell-derived+CD34%2B+cells%3A+efficient+production+in+the+coculture+with+OP9+stromal+cells+and+analysis+of+lymphohematopoietic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cell-derived CD34+ cells: efficient production in the coculture with OP9 stromal cells and analysis of lymphohematopoietic potential.</a> Blood. 105, 617-626 (2005).</li>
<li>Woll, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cells+differentiate+into+a+homogeneous+population+of+natural+killer+cells+with+potent+in+vivo+antitumor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cells differentiate into a homogeneous population of natural killer cells with potent in vivo antitumor activity.</a> Blood. 113, 6094-6101 (2009).</li>
<li>Woll, P. S., Martin, C. H., Miller, J. S., Kaufman, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cell-derived+NK+cells+acquire+functional+receptors+and+cytolytic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cell-derived NK cells acquire functional receptors and cytolytic activity.</a> Journal of Immunology. 175, 5095-5103 (2005).</li>
<li>Ni, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Pluripotent+Stem+Cells+Produce+Natural+Killer+Cells+That+Mediate+Anti-HIV-1+Activity+by+Utilizing+Diverse+Cellular+Mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Human Pluripotent Stem Cells Produce Natural Killer Cells That Mediate Anti-HIV-1 Activity by Utilizing Diverse Cellular Mechanisms.</a> Journal of Virology. 85, 43-50 (2011).</li>
<li>Ng, E. S., Davis, R. P., Hatzistavrou, T., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+as+spin+embryoid+bodies+and+a+description+of+the+hematopoietic+blast+colony+forming+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Stem+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human embryonic stem cells as spin embryoid bodies and a description of the hematopoietic blast colony forming assay.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. Chapter 1, Unit 1D.3(2008).</li>
<li>Denman, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-Bound+IL-21+Promotes+Sustained+Ex+Vivo+Proliferation+of+Human+Natural+Killer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Membrane-Bound IL-21 Promotes Sustained Ex Vivo Proliferation of Human Natural Killer Cells.</a> PLoS ONE. 7, e30264(2012).</li>
<li>Somanchi, S. S., Senyukov, V. V., Denman, C. J., Lee, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion%2C+Purification%2C+and+Functional+Assessment+of+Human+Peripheral+Blood+NK+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells.</a> J. Vis. Exp. (48), e2540(2011).</li>
<li>Tian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescent+imaging+demonstrates+that+transplanted+human+embryonic+stem+cell-derived+CD34%2B+cells+preferentially+develop+into+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Bioluminescent imaging demonstrates that transplanted human embryonic stem cell-derived CD34+ cells preferentially develop into endothelial cells.</a> Stem Cells. 27, 2675-2685 (2009).</li>
<li>Wilber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+stable+transgene+expression+in+human+embryonic+stem+cells+using+transposon-mediated+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Efficient and stable transgene expression in human embryonic stem cells using transposon-mediated gene transfer.</a> Stem Cells. 25, 2919-2927 (2007).</li>
<li>Shcherbo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-infrared+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Near-infrared fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 7, 827-829 (2010).</li>
<li>Nguyen, V. T., Morange, M., Bensaude, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Firefly+luciferase+luminescence+assays+using+scintillation+counters+for+quantitation+in+transfected+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Firefly luciferase luminescence assays using scintillation counters for quantitation in transfected mammalian cells.</a> Analytical Biochemistry. 171, 404-408 (1988).</li>
<li>Sadikot, R. T., Blackwell, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+American+Thoracic+Society%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence Imaging.</a> Proceedings of the American Thoracic Society. 2, 537-540 (2005).</li>
<li>Santos, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+in+vivo+imaging+of+T+cells+using+a+membrane-bound+Gaussia+princeps+luciferase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Sensitive in vivo imaging of T cells using a membrane-bound Gaussia princeps luciferase.</a> Nature Medicine. 15, 338-344 (2009).</li>
<li>Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+Proteins+and+Their+Applications+in+Imaging+Living+Cells+and+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Fluorescent Proteins and Their Applications in Imaging Living Cells and Tissues.</a> Physiological Reviews. 90, 1103-1163 (2010).</li>
<li>Knorr, D. A., Bock, A., Brentjens, R. J., Kaufman, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+Human+Embryonic+Stem+Cell-Derived+Lymphocytes+to+Study+In+Vivo+Trafficking+and+Immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Engineered Human Embryonic Stem Cell-Derived Lymphocytes to Study In Vivo Trafficking and Immunotherapy.</a> Stem Cells Dev. 28, 28(2013).</li>
<li>Germain, R. N., Robey, E. A., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Decade+of+Imaging+Cellular+Motility+and+Interaction+Dynamics+in+the+Immune+System%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A Decade of Imaging Cellular Motility and Interaction Dynamics in the Immune System.</a> Science. 336, 1676-1681 (2012).</li>
</ol>

Diese Arbeit wurde vom NIH / NHLBI R01-HL77923 (DSK) und NIH MSTP Zuschuss T32 GM008244 (DAK), Stem Cell Biology Ausbildungsförderung T32 (DAK) (T32HD060536), Undergraduate Research Opportunities Program (UROP) Grant, University of Minnesota unterstützt (AMB), der Leukemia Research Fund der University of Minnesota Cancer Center, und der William L und Blanche Hughes Foundation.

hESCs sind eine ideale Plattform, um verschiedene Zelltypen zu studieren und halten bemerkenswerte Potenzial für die klinische Übersetzung. Wir verwenden eine definierte, Spin EB Ansatz hESC / iPSCs auf hämatopoetischen Vorläuferzellen zu differenzieren. Der Spin EB Ansatz konsistente Ableitung von hämatopoetischen Vorläuferzellen und Differenzierung auf NK-Zellen ergab, doch, Variation existiert noch in Differenzierung Effizienz in Zelllinien und müssen für die Erzeugung von anderen hämatopoetischen Zelllinien geändert...

Menschliche embryonale Stammzellen (hES) und induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) sind undifferenzierte, pluripotente Zellen, die sich unbegrenzt Selbsterneuerung und Differenzierung multi-Linie. hESCs wurden erfolgreich in reifen und funktionale Untergruppen von jedem Keimblatt, einschließlich Zellen des blutbildenden Systems 1-3 unterschieden. Natürliche Killerzellen (NK)-Zellen sind Lymphozyten des angeborenen Immunsystems, von HES durch Bildung von embryoid bodies (EBs) 4,5 oder Co-Kultur mit Zelllinien 1,2,6-8 Stromazellen abgeleitet werden. NK-Zellen besitzen anti-virale und anti-Tumor-Fähigkeiten und das Potential haben, sich gegen ein breites Spektrum von Tumoren wirksam, da sie keiner vorherigen Antigen-Stimulation zu ihren Effektorfunktionen durchzuführen. Somit sind hESC abgeleiteten NK-Zellen eine attraktive Quelle von Zellen für die Immuntherapie. Zusätzlich stellt die Ableitung von NK-Zellen aus HES ein genetisch zugänglich, um den normalen Entwicklung zu studieren &lt;em&gt; in vitro. Weil sie eine genetisch manipulierbaren System bereitzustellen, kann hESC abgeleiteten NK Zellen experimentell modifiziert werden, um Fluoreszenz-und Biolumineszenz Reporter exprimieren einen optimalen Modell NK-Zell-Effektorfunktionen in vitro und in vivo zu studieren. hESC abgeleiteten NK-Zellen besitzen Wirkung gegen eine Reihe von Zielen, einschließlich HIV 9, Leukämie (K562) und andere Krebsarten 7,8. Jedoch ist die Fähigkeit, effizient ableiten genug NK Zellen, zur Behandlung von Patienten vor ein erhebliches Hindernis für die klinische Übersetzung und zu einem geringeren Grad, eine Beschränkung für umfangreiche präklinischen in vivo-Untersuchungen der NK-Zell-Entwicklung und Anti-Krebs-Funktionen. Hier verwenden wir ein Spin EB Ansatz zur Ableitung von hämatopoetischen Vorläuferzellen aus hESCs 4,5,10. Nach 11 Tage der Spin EBs sind NK-Zell-Kultur mit oder ohne Feeder für 28 Tage übertragen. Nach 4 Wochen in NK Zellkulturmedium, NK-Zellen transferred zu Co-Kultur mit K562-Zellen modifiziert werden, um membrangebundene Interleukin 21 (IL-21), die als künstliche Antigen präsentierende Zellen (aAPCs) dienen auszudrücken. Anpassung ein Protokoll für den Ausbau der peripheren Blut NK-Zellen mit diesen künstlichen APCs 11,12, sind wir in der Lage zu expandieren NK-Zellen 2-Protokolle unter Beibehaltung einer reifen Phänotyp und zytotoxische Fähigkeiten. Dieser Prozess der Entwicklung und Expansion bietet ausreichend hESC abgeleiteten NK-Zellen für umfangreiche in vivo Charakterisierung. Für in-vivo-Studien, können wir nicht-invasiv überwacht langfristig Transplantation und die Kinetik der injizierten Glühwürmchenluciferase sind Ausdruck (Fluc +), hESC abgeleiteten NK-Zellen mit Biolumineszenz-Bildgebung. Darüber hinaus sind wir in der Lage, NK-Zell-Interaktionen mit Tumorzellen mit einem Dual, Biolumineszenz oder Fluoreszenz-Imaging-Schema folgen. Eine frühere Studie von unserer Gruppe verwendet Biolumineszenz-Bildgebung in einem Anti-Tumor-Modell bis zur Tumorprogression und cle folgenarance von Fluc + K562-Zellen in vivo 7. Nun, von Engineering bis hESCs unsere ausdrückliche Glühwürmchenluciferase 13,14 können wir die biologische Verteilung und Handel von NK Zellen K562 Tumorzellen, die das kürzlich charakterisierten fluoreszierendes Protein exprimieren turboFP650 15 folgen. Wir haben dieses duale System Reporter ausgewählt, um gleichzeitig folgen die beiden Zellpopulationen in vivo (Abbildung 1). Die meisten Dual Imaging Modelle haben Dual-Luciferase-Systeme, aber diese Systeme technisch eine Herausforderung aufgrund der Lieferbedingungen von Coelenterazin, das Substrat für die Expression der meisten Renilla Luciferase Reporter und Gaussia 16-18 erforderlich. Fluorescent Reporter haben eine einfache Überwachung von vielen Zelllinien und Konstrukte in vitro erlaubt, hat aber nur begrenzten Erfolg hatten in-vivo-Bildgebung aufgrund der Überlappung zwischen Gewebe und Fell Autofluoreszenz und Emissionsspektren von vielen commonly verwendet fluoreszierenden Reporter einschließlich GFP, DsRed und tdTomato 15,19. Diese Sorge hat die Entwicklung der weit rot fluoreszierende Proteine, die für eine bessere Gewebe Penetranz und höhere spezifische Signal im Vergleich zu 15,19 Hintergrund erlauben gefördert. TurboFP650, das fluoreszierende Protein in diesem System gezeigt, ist weit-Rot verschoben und überwindet viele der Probleme, mit bildgebenden fluoreszierenden Proteinen in lebenden Tieren. Dieses Verfahren für die Entwicklung und den Ausbau von NK-Zellen hESCs abgeleitet hat uns erlaubt, weiter zu charakterisieren hESC abgeleiteten NK-Zellen in vitro und in vivo, die erforderlich sind, um besser zu verstehen, NK-Zell-Funktion und klinisch wichtig, aktuelle NK-Zell-Therapien Adoptiveltern zu verbessern. Es ist auch offen für die Ableitung und Erweiterung iPSC abgeleiteten NK-Zellen. Das duale Fluoreszenz und Biolumineszenz-Imaging-System ist breit anwendbar auf andere Systeme als die Anti-Tumor-Modell, das wir hier gezeigt haben.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Materialien&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Medien&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;BPEL-Medien zur Erzeugung von Spin-EB&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Iscove’s modifiziertes Dulbecco-Medium (IMDM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3022801</td><td></td></tr><tr><td>F-12 Nährstoffmischung mit Glutamax I</td><td>Invitrogen</td><td>31765035</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3311</td><td>Kommerziell erhältliches BSA kann für ES-Zellen zytotoxisch sein. Die Deionisierung der Lösung kann das Potenzial für Zytotoxizität verringern.</td></tr><tr><td>Poly(vinylalkohol)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8136</td><td></td></tr><tr><td>Linolsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L1012</td><td></td></tr><tr><td>Linolensäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2376</td><td></td></tr><tr><td>Synthechol 500X-Lösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5442</td><td></td></tr><tr><td>α-Monothioglycerol (α-MTG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5442</td><td></td></tr><tr><td>Proteinfreies Hybridom-Mix II</td><td>Invitrogen</td><td>12040077</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbinsäure-2-phosphat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8960</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax I</td><td>Invitrogen</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Insulin, Transferrin, Selen 100X-Lösung (ITS)</td><td>Invitrogen</td><td>41400-045</td><td></td></tr><tr><td>Pen-Strep</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;NK-Differenzierungsmedien&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Dulbecco’s modifiziertes Eagle-Medium (DMEM)</td><td>Invitrogen</td><td>11965-118</td><td></td></tr><tr><td>F-12-Medium</td><td>Invitrogen</td><td>CX30315</td><td></td></tr><tr><td>15 % humanes AB-Serum</td><td>Valley Biomed</td><td>HP1022HI</td><td></td></tr><tr><td>5 ng/ml Natriumselenit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>50 µM Ethanolamin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9508</td><td></td></tr><tr><td>20 ng/ml Ascorbinsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8960</td><td></td></tr><tr><td>25 µM 2-Mercap&amp;#8211;thiol (BME)</td><td>Gibco</td><td>21985</td><td></td></tr><tr><td>2 mM L-Glutamin</td><td>Gibco</td><td>CX30310</td><td></td></tr><tr><td>1 % Pen-Strep</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Zytokine&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">(alle Zytokine frisch aus eingefrorenen Aliquots verwendet)</td></tr><tr><td>SCF</td><td>PeproTech, Inc.</td><td>300-07</td><td>40 ng/ml in BPEL-Medien; 20 ng/ml in NK-Medien. Wie im Elefanty-Protokoll beschrieben und wie wir anhand einer minderwertigen BMP4-Lot feststellten, können zwischen Zytokin-Lots Unterschiede hinsichtlich der hämatopoetischen Differenzierung bestehen. Besonders beim Kauf von Zytokinen in Großmengen sollte eine Probe des Lots vor dem Kauf getestet werden. Direkter Vergleich mit dem alten Lot empfohlen.</td></tr><tr><td>rhBMP-4</td><td>R &amp;amp; D Systems</td><td>314-BP</td><td>20 ng/ml in BPEL-Medien</td></tr><tr><td>rhVEGF</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>293-VE</td><td>20 ng/ml in BPEL-Medien</td></tr><tr><td>IL-2</td><td>PeproTech, Inc.</td><td>200-02</td><td>1 × 10&lt;sup&gt;5&lt;/sup&gt; U/ml nach NK-Zell-Injektion Mäusen verabreicht; 50 U/ml im NK-Zell-Expansionsprotokoll verwendet</td></tr><tr><td>IL-15</td><td>PeproTech, Inc.</td><td>200-15</td><td>10 ng/ml nach NK-Zell-Injektion Mäusen verabreicht (nur die ersten 7 Tage)</td></tr><tr><td>IL-3</td><td>PeproTech, Inc.</td><td>200-03</td><td>5 ng/ml in NK-Medien</td></tr><tr><td>IL-7</td><td>PeproTech, Inc.</td><td>200-07</td><td>20 ng/ml in NK-Medien</td></tr><tr><td>Flt-3-Ligand</td><td>PeproTech, Inc.</td><td>300-19</td><td>10 ng/ml in NK-Medien</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;&lt;em&gt;In-vivo&lt;/em&gt;-Bildgebung&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>D-Luciferin-Natriumsalz</td><td>Gold BioTechnology</td><td>Lucna-500</td><td></td></tr><tr><td>TurboFP650-Plasmid</td><td>Evrogen, Moskau, Russland</td><td>FP731</td><td>In ein auf dem Sleeping-Beauty-Transposon basierendes Plasmid unter Kontrolle des mCAGs-Promotors kloniert. Die Zellen wurden anschließend mittels FACS nach TurboFP650-Expression sortiert. Zellen und Plasmide können aus unserem Labor bezogen werden.</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Geräte&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>IVIS Spectrum Imaging System</td><td>Caliper Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Zellen&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Künstliche antigenpräsentierende Zellen mit membrangebundenem IL-21</td><td><a href="http://www.jove.com/video/2540/expansion-purification-functional-assessment-human-peripheral-blood" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> MD Anderson, Houston, TX</a></td><td></td><td>Kontakt: Dean A. Lee. &lt;a href="http://www.jove.com/video/2540/expansion-purification-functional-assessment-human-peripheral-blood" target="_blank"&gt;http://www.jove.com/video/2540/expansion-purification-functional-assessment-human-peripheral-blood&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>hESCs mit Feuerflieluciferase-Expression</td><td>University of Minnesota, Minneapolis, MN</td><td></td><td>Kontakt: Dan S. Kaufman. H9-Zellen, modifiziert mittels eines auf dem Sleeping-Beauty-Transposon basierenden Verfahrens (Referenzen 13 und 14). Die Expression der Feuerflieluciferase wird durch den mCAGGS-Promotor gesteuert. Hinter dem Feuerflieluciferase-Gen befindet sich ein IRES-Element am 5'-Ende eines GFP:Zeocin-Fusionskonstrukts.</td></tr><tr><td>TurboFP650-exprimierende K562-Zellen</td><td>University of Minnesota, Minneapolis, MN</td><td></td><td>Kontakt: Dan S. Kaufman. Beschreibung im Abschnitt zu den Plasmidkommentaren</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class="jove_content"&gt;&lt;strong&gt;Materialtabelle.&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

entwicklung, erweiterung und<em&gt; in vivo</em&gt; monitoring von humanen nk zellen aus humanen embryonalen stammzellen (hes-zellen) und und induzierten pluripotenten stammzellen (ips-zellen)

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

Wir präsentieren eine Methode zur Ableitung natürlichen Killerzellen (NK-Zellen) aus undifferenzierten hES und iPS mit einem Feeder-freien Ansatz. Diese Methode ergibt sich ein hohes Maß an NK-Zellen nach 4 Wochen Kultur und weitere 2-log Expansion mit künstlichen Antigen-präsentierenden Zellen zu unterziehen. hESC-und iPS-abgeleiteten NK-Zellen in diesem System entwickelt haben eine reife Phänotyp und Funktion. Die Produktion einer großen Anzahl von NK-Zellen genetisch veränderbar gilt sowohl für grundlegende mechanistische sowie Anti-Tumor-Studien. Expression der Firefly-Luciferase in hES-Zellen abgeleiteten NK ermöglicht eine nicht-invasive Ansatz zur NK-Zell-Transplantation, Verteilung und Funktion folgen. Wir beschreiben auch ein Dual-Bildgebungsverfahren, das eine getrennte Überwachung von zwei verschiedenen Zellpopulationen zu deutlicher charakterisieren ihre Wechselwirkungen in vivo ermöglicht. Diese Art der Ableitung, Expansion und zwei in-vivo-Bildgebung eine zuverlässige Methode zur Herstellung von NK-Zellen und deren ausgewertetation, die zur aktuellen NK-Zell-Therapien Adoptiveltern zu verbessern.

Die Erzeugung von hämatopoetischen Vorläuferzellen mit dem Spin EB Ansatz ermöglicht eine optimale NK-Zell-Entwicklung von hES und iPS-Zellen. Wie in 2 gezeigt, enthält Tag 11 Spin EBs hohe Anteile an Vorläuferzellen CD34 exprimieren, CD45, CD43, CD31 und. Hohe Konzentrationen von CD34 und CD45 ermöglicht die direkte Übertragung auf NK Bedingungen, ohne dass für die Sortierung oder die Unterstützung Stromazellen. Wenn es nicht optimal Spin EB Differenzierung, wird empfohlen, dass Stromazellen wie EL08-1...

Dieses Protokoll beschreibt die Entwicklung, Expansion und in-vivo-Bildgebung von NK-Zellen aus hES-und iPS-Zellen abgeleitet.

Entwicklung, Erweiterung und<em&gt; In vivo</em&gt; Monitoring von humanen NK Zellen aus humanen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) und und induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, menschliche natürliche Killerzellen oder NK-Zellen aus verschwommenen, potenten Stammzellen zu erzeugen. Dies wird erreicht, indem zunächst hämatopoetische Vorläuferzellen erzeugt werden. Im zweiten Schritt werden die hämatopoetischen Vorläuferzellen durch den Einsatz definierter Zytokine zu NK-Zellen differenziert.Als nächstes können NK-Zellen in einer Vielzahl von funktionellen Assays getestet werden. Im letzten Schritt wird die duale Bildgebung verwendet, um die Fähigkeit von NK-Zellen zu überwachen, Tumorziele in vivo abzutöten. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber traditionellen bestehenden Methoden wie der Stromazell-vermittelten Differenzierung oder der regulären EB-Bildung besteht darin, dass das spinale B-System einen vollständig definierten feederfreien Ansatz für die großflächige Expansion von Vorläuferzellen bietet, die zu natürlichen Killerzellen differenziert werden können.Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Behandlung von chronischen Virusinfektionen sowie von Krebs, da sich NK-Zellen als wichtige Effektorzellen bei beiden Krankheiten erwiesen haben. Zur Vorbereitung der Embryokörper- oder EB-

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Die Fähigkeit von humanen embryonalen Stammzellen sich selbst zu erneuern und zu differenzieren sich in alle Zelltypen des Körpers lässt vermuten, dass sie großes Versprechen für medizinische Anwendungen und als Recherche-Tool für die Bewältigung grundlegender Fragen in Entwicklung und Krankheit zu halten. Hier bieten wir Ihnen einen kurzen Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Gewinnung menschlicher embryonaler Stammzellen aus Embryonen, die durch immunosurgical Isolierung der inneren...

Gewinnung menschlicher embryonaler Stammzellen durch Immunosurgery

Mit dem wachsenden Interesse an Stammzelltherapien, sind molekulare Bildgebungsverfahren ideal für die Überwachung Stammzellen Verhalten nach der Transplantation. Luciferase Reporter Gene nicht-invasive, repetitive Beurteilung der das Überleben der Zelle, den Standort und Verbreitung in vivo ermöglicht. Dieses Video wird gezeigt, wie man hESC Proliferation in einer lebenden Maus zu verfolgen.

In vitro und in vivo Biolumineszenz Reporter Gene Imaging von humanen embryonalen Stammzellen

Hier beschreiben wir eine Methode, um effizient zu erweitern und zu reinigen eine große Anzahl von menschlichen NK-Zellen und beurteilen ihre Funktion.

Expansion, Reinigung und Functional Assessment of Human peripheren Blut NK-Zellen

Die Qualität von embryonalen Maus-Fibroblasten (MEFs) durch die rechte Mausstamm wie CF-1 bestimmt. Pluripotenz-unterstützende MEFs und konditionierte Medien (CM) aus diesen gewonnenen Erkenntnisse sollten den optimalen Konzentrationen von Activin A, Gremlin und TGFß1 für die Activin / Nodal und FGF Signalwege erforderlich, um kooperativ zu halten Selbsterneuerung und Pluripotenz enthalten.

Vorbereitung von embryonalen Maus-Fibroblasten-Zellen zum Kultivieren von humanen embryonalen und induzierten pluripotenten Stammzellen

Hier zeigen wir, ein einfaches und effektives Protokoll für die Herstellung von menschlichen IPSCs 3-4 ml peripheres Blut unter Verwendung eines einzigen lentiviralen Vektors Umprogrammierung. Reprogrammierung von leicht verfügbaren Blutkörperchen verspricht die Nutzung von iPS-Technologie, indem sie Zugang zu einem breiteren Forschungsgemeinschaft beschleunigen.

Generation of Human induzierten pluripotenten Stammzellen aus dem peripheren Blut mit dem STEMCCA Lentivirusvektor

Hier präsentieren wir Kulturprotokolle für humane pluripotente Stammzellen (hPSC), die auf dem Wachstum von dissoziierten Einzelzellen basieren. Diese neue Methode, bei der Rho-assoziierte Kinase-Inhibitoren oder die Laminin-Isoform 521 (LN-521) verwendet werden, eignet sich für die Herstellung großer Mengen homogener hPSCs, die genetische Manipulation und die Wirkstoffforschung.

Alternative Kulturen für menschlichen pluripotenten Stammzellen Produktion, Wartung und Genetic Analysis

Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Erzeugung von menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen aus dem peripheren Blut mit Hilfe eines Episoms basierend Neuprogrammierung Strategie und Histon-Deacetylase-Inhibitoren.

Effiziente iPS Zellgeneration aus Blut Mit Episomen und HDAC-Inhibitoren

Die Protokolle beschreiben zwei In-vitro-Testsysteme Entwicklungstoxizität (UKK und UKN1) auf der Grundlage humaner embryonaler Stammzellen und Transkriptom-Studien. Die Testsysteme voraussagen menschlichen Entwicklungstoxizität Gefahren und kann dazu beitragen, Tierversuche, die Kosten und die Zeit für die Stoffsicherheitstests zu reduzieren.

Menschliche pluripotente Stammzelle Basierend Entwicklungstoxizität Assays für chemische Sicherheit Screening und Systembiologie Datengenerierung

Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen bietet faszinierende Perspektiven für die Ableitung von autologen Transplantaten. Allerdings Progression durch einem pluripotenten Zustand und mühsame Wieder Differenzierung noch behindert klinischen Übersetzung. Hier beschreiben wir die Ableitung der erwachsenen menschlichen Fibroblasten und deren direkte Umsetzung in induzierten neuronalen Vorläuferzellen und die nachfolgende Differenzierung in neuronale Abstammungen.

Ableitung von Adult menschlichen Fibroblasten und deren direkte Umwandlung in Erweiterbar neuronalen Vorläuferzellen

Das vorliegende Protokoll zeigt, wie CD3−/CD45+CD56+-Zellen mit leichter Zytotoxizität von humanen Stammzellen mit expandiertem Potenzial (hEPSCs) sowohl unter 3D- als auch unter 2D-Kulturbedingungen unterschieden werden können. Dies ermöglicht eine routinemäßige phänotypische Validierung, ohne die komplexe Mikroumgebung zu zerstören.

Generierung natürlicher Killerzellen aus humanen Stammzellen mit erweitertem Potenzial

Hier stellen wir eine Methode zur Differenzierung und Erweiterung von humanen iPSC-abgeleiteten chimären Antigenrezeptoren (CAR)-exprimierenden natürlichen Killerzellen mit verbesserter Abtötung gegen verschiedene Malignome vor. Dieses Protokoll demonstriert die Differenzierung und Expansion von für natürliche Killer (NK) optimierten iPSC-abgeleiteten CAR-NK-Zellen und die Messung der Antitumoraktivität gegen verschiedene Tumorzelllinien.

Fortschritte bei humanen induzierten pluripotenten Stammzellen, die von chimären Antigenrezeptoren abgeleitet werden und natürliche Killerzellen exprimieren

Erfahren Sie die Entwicklung und Expansion humaner NK-Zellen aus hES- und iPS-Zellen mittels definiertem Zytokin-Protokoll. Diese feeder-freie Methode ermöglicht funktionelle Assays und In-vivo-Monitoring für Immuntherapieforschung.

Entwicklung, Erweiterung und In vivo Monitoring von humanen NK Zellen aus humanen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) und und induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) (Video) | JoVE Journal

Entwicklung, Erweiterung und

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