Generierung eines neuartigen Dendritisch-Zell-Impfstoffs mit Melanom- und Plattenkrebs-Stammzellen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Anti-Tumor-Immunität eines auf Krebsstammzellen oder CSC basierenden dendritischen Zell- oder DC-Impfstoffs in einem immunkompetenten Wirt zu bewerten. Dies wird erreicht, indem zunächst alor-positive Aldehyddehydrogenase oder A LDH hohe CSCs aus heterogenen Tumorzellen isoliert werden. Im zweiten Schritt werden die CSC-DCs isoliert und anschließend mit Lysat für den Impfstoff präsentiert.

Anschließend wird der CSC-Lysat-Puls-DC- oder TP-DC-Impfstoff normalen syngenenen immunkompetenten Wirtsorganismen verabreicht. Im letzten Schritt wird dann die schützende Anti-Tumor-Wirksamkeit des C-S-C-T-P-D-C-Impfstoffs bewertet. Abschließend kann ein ELISA durchgeführt werden, um die durch den C-S-C-T-P-D-C-Impfstoff induzierte Anti-CSC-Immunität der Wirt-T-Zellen und -Antikörper zu untersuchen.

Dieses Projekt vereint zwei der spannendsten Bereiche der Krebsforschung: den Bereich der Krebsstammzellen und den Bereich der Tumor-Immuntherapie. Unser Labor gehörte zu den ersten, die Krebsstammzellen in soliden Tumoren entdeckten. Dies sind die Keime des Krebses, die sein Wachstum sowie die Metastasierung antreiben.

Was Sie heute sehen werden, ist ein neuer Ansatz, der Immuntherapie nutzt, um gezielt diese Krebsstammzellen anzusteuern. Wir verwenden einen bestimmten Marker namens Aldehyddehydrogenase, der mittels des Alde-fluoro-Assays nachgewiesen werden kann. Sie werden die Ärzte Lin Liu und Huon Tau gemeinsam mit Dr. Chow Lee arbeiten sehen.

Wir hoffen, dass wir durch die gezielte Bekämpfung dieser Krebsstammzellen die Behandlungsergebnisse für Patienten mit vielen Arten von Krebserkrankungen verbessern können. Suspendieren Sie zunächst die Tumorzellen der Wahl in Alor-Assay-Puffer mit einer Konzentration von einer mal 10 hoch 6 Zellen pro Milliliter. Übertragen Sie danach bis auf drei Milliliter alle Tumorzellen auf die jeweiligen Probenröhrchen und beschriften Sie vier 12 mal 75 Millimeter große Polystyrol-Kontrollröhrchen wie folgt: unbehandelt, Alor, ALOR plus DEAB und 7-AAD. Geben Sie je ein Milliliter der Zellsuspension in die unbehandelten und 7-AAD-Röhrchen sowie zwei Milliliter in das Aldefluor-Röhrchen.

Fügen Sie dann fünf µL DEAB in die ALOR-plus-DEAB-Röhrchen hinzu. Stellen Sie die Röhrchen auf Eis und geben Sie anschließend 10 µL aktiviertes ALOR-Substrat in das ALOR-Röhrchen. Übertragen Sie unverzüglich 1 mL der Substratlösung in das ALOR-plus-DEAB-Röhrchen und geben Sie danach 2 µL aktiviertes ALOR-Substrat pro 1 Million Zellen in jedes der Probenröhrchen.

Alle Röhrchen 30 Minuten lang in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius inkubieren und anschließend fünf µL Seven AAD zum Seven-AAD-Röhrchen sowie einen µL Seven AAD pro eine Million Zellen jedem Probenröhrchen hinzufügen. Diese Röhrchen 10 Minuten lang bei vier Grad Celsius lagern. Alle Röhrchen fünf Minuten lang bei 250 × g bei Raumtemperatur zentrifugieren und die Pellets in AldeFluor-Assay-Puffer zur fluoreszenzaktivierten Zellsortierung resuspendieren.

Um die Sortiertore einzustellen, verwenden Sie die Aldefluor-plus-DEAB-Zellen als Negativkontrolle und die mit 7-AAD gefärbten Zellen als Kontrolle der Vitalität. Basierend auf diesen Kontrollen definieren Sie ein Tor zur Unterscheidung der Alor-positiven ALDH-, D5-hoch- und SCC-7-Zellen. Verwenden Sie dieses anschließend, um die Probenzellen in Alor-positive ALDH-, D5-hoch- und SCC-7-Subpopulationen zu sortieren.

Um die dendritischen Zellen zu erzeugen, isolieren Sie zunächst die Femur- und Tibiaknochen von einer C57BL/6- und einer C3H-Maus. Sterilisieren Sie die Knochen für eine Minute bei Raumtemperatur in 75 % Ethanol und waschen Sie sie anschließend in HBSS. Schneiden Sie danach die Enden der Knochen ab und spülen Sie mit einer 10-Milliliter-Spritze, die mit einer 21-Gauge-Nadel ausgestattet ist, das Knochenmark in eine Petrischale aus. Aspirieren und dosieren Sie die Zellen mehrmals, um eine Einzelzell-Suspension herzustellen, und zentrifugieren Sie anschließend die Zellen.

Das Pellet in fünf Milliliter Puffer zur Lyse roter Blutkörperchen für eine Minute im 37 °C warmen Wasserbad inkubieren. Nach der Zellzählung das Volumen auf 1 × 10⁶ Zellen pro Milliliter in Kulturmedium, ergänzt durch G-M-C-S-F und IL-4, einstellen. Anschließend die Zellen bei 37 °C und 5 % CO₂ kultivieren und nach drei Tagen das Medium sowie die Zytokine erneuern.

Am fünften Tag die unreifen dendritischen Zellen gewinnen. Nach dem Zentrifugieren die Zellen in fünf Milliliter Kulturmedium resuspendieren und die Zellsuspension langsam auf frisch zubereitetes Isolationsmedium schichten. Nach erneutem Zentrifugieren die DCs an der Grenzschicht zwischen Kulturmedium und Isolationsmedium sammeln.

Danach die Zellen zählen, das Volumen auf eine Konzentration von einer mal 10 hoch sechs Zellen pro Milliliter in Kulturmedium einstellen, ergänzt mit G-M-C-S-F und IL-4. Erstellen Sie nun die Tumorlysate, indem Sie die sortierten Zellen viermal schnellen Einfrier- und Auftauzyklen aussetzen, gefolgt von einer Zentrifugation zur Sammlung des membranständigen Anteils der Lysate. Pulsieren Sie anschließend die DCs mit dem Lysat aus den sortierten autologen A-LDH-hoch-Zellen. Zur Herstellung der CSC-TPCs.

Zur Vorbereitung des H-T-P-D-C-Impfstoffs injizieren Sie 1 × 10⁶ der mit unsortiertem heterogenem Tumorzelllysat beladenen Zellen suspendiert in 100 µL PBS einmal subkutan in die linke Flanke jedes Mauses. Nach der Impfung verabreichen Sie intravenös 1 × 10⁵ heterogene D5-Tumorzellen in 100 µL PBS, um die C57BL/6-Empfängermäuse zu provozieren. Für das SCC7-Modell impfen Sie die C3H-Empfängermäuse subkutan mit 1 × 10⁶ unsortierten SCC7-Tumorzellen in 100 µL PBS auf der gegenüberliegenden Seite des DC-Impfstoffs.

Erstellen Sie eine Einzelzell-Suspension aus den Milzen der empfänglichen C3H-Mäuse. Aktivieren Sie anschließend die Milz-T- und B-Zellen mit immobilisierten anti-CD3- und anti-CD28-Monoklonalen Antikörpern im Kulturmedium, das mit dem entsprechenden Stimulus ergänzt ist. Nach vier Tagen sammeln Sie die Überstände und beschichten ELISA-Platten über Nacht bei vier Grad Celsius mit Antikörpern gegen Interferon-gamma, GM-CSF oder IgG. Blocken Sie am nächsten Tag die Platten zur Vermeidung unspezifischer Bindung, geben Sie die Standards und die gerade gesammelten Überstände hinzu und inkubieren Sie die Platten nach dem Waschen bei Raumtemperatur. Fügen Sie danach eine HRP-Erkennungsantikörperlösung eine Stunde lang hinzu und geben Sie anschließend das TMB-Substrat dazu.

Miss abschließend die Extinktion innerhalb von 30 Minuten nach Beendigung der Reaktion bei 450 Nanometern mit einem ELISA-Plattenlesegerät. Alor wurde als Marker zur Isolierung von Stammzellen bei mehreren malignen Erkrankungen verwendet, einschließlich der beiden tumorstammzellreichen Populationen D fünf und SCC sieben, wie spezifisch in diesen Punktdiagrammen gezeigt. Alor-positive Zellen stellen jeweils etwa 0,5 % und 5,2 % der kultivierten Tumorzelllinien D fünf und SCC sieben dar. Frisch gewonnene Tumorzellen wurden ebenfalls untersucht und enthielten jeweils 2,5 % und 4,2 % alor-positiver Zellen aus in vivo etablierten D-fünf- und SCC-sieben-Tumoren.

Tumorzellen, die mit einem spezifischen A-LDH-Inhibitor D-E-A-B-A behandelt wurden, dienten als negativer Kontrollansatz. Die Immunogenität von Krebsstammzellen wurde durch die Untersuchung der schützenden Anti-Tumor-Immunität bewertet, die durch CSC-TPCs unter Verwendung des gerade demonstrierten Impfmodells induziert wurde. Wie in dieser Tabelle dargestellt, entwickelten Mäuse, die mit den H-TPCs behandelt wurden, weniger Lungenmetastasen als Mäuse, die allein mit PBS behandelt wurden.

Wichtig ist, dass Mäuse, die mit CSCT-PCs behandelt wurden, noch weniger Lungenmetastasen aufwiesen als Tiere, die mit H-T-P-D-C oder PBS allein behandelt wurden. Im SCC-sieben-Modell wurden normale C3-H-Tiere wie gerade beschrieben im Vergleich zur Kontrollgruppe geimpft. H-TPCs induzierten eine moderate Anti-Tumor-Immunität, während CSC-TPCs eine signifikante Hemmung des Tumorwachstums hervorriefen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass CSCs möglicherweise als wirksamere Antigenquelle zur Beladung von Dendritischen Zellen (DCs) genutzt werden können als herkömmliche, nicht sortierte Tumorzellen, um eine schützende Immunität gegen die Herausforderung durch Tumorzellen zu induzieren.

Um die Mechanismen, die der beobachteten, durch CSC induzierten schützenden Anti-Tumor-Immunität zugrunde liegen, weiter zu verstehen, wurden Zellen aus DC-geimpften Tieren aktiviert und ihre Zytokinproduktion mittels ELISA gemessen. Wie gerade gezeigt wurde, war die Zytokinproduktion signifikant höher in den Zellen, die aus Tieren gewonnen wurden, die mit D5-CSC-TPCs oder SCCC7-CSC-PCs geimpft worden waren, im Vergleich zu jenen, die aus Tieren stammten, die mit D5-HTPCs oder SCC7-HTCs geimpft worden waren. Heute haben Sie gelernt, wie man den Alor-Assay zur Isolierung von Krebsstammzellen verwendet.

Diese Krebsstammzellen können anschließend zur Entwicklung von Immuntherapien unter Verwendung von dendritischen Zellen genutzt werden. Wir hoffen, dass diese Immuntherapien, entweder allein oder in Kombination mit bestehenden Therapien, die Prognose für Patienten mit vielen Krebsarten verbessern werden.