Name: Generierung eines neuartigen Dendritisch-Zell-Impfstoffs mit Melanom- und Plattenkrebs-Stammzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-06T14:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 43 s
Description: Erfahren Sie die Herstellung eines dendritischen Zell-Impfstoffs mit Melanom- und Plattenkrebs-Stammzellen zur Induktion antitumoraler Immunität. Diese Methode zeigt eine deutlich stärkere Immunantwort als herkömmliche Impfstoffe.

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Diese Arbeit wurde vom Will and Jeanne Caldwell Endowed Research Fund des University of Michigan Comprehensive Cancer Center und teilweise von NIH Grant CA82529 und der Gillson Longenbaugh Foundation unterstützt.

1. ALDEFLUOR Färbung
<ol><li>Zellprobenpräparation: Bereiten Sie die einzelzellige Suspension von Tumorzellen vor, entweder aus kultivierten Tumorzellen oder aus frisch geernteten Tumorproben. Zählen Sie die Zellen und passen Sie die Zellsuspension auf eine Konzentration von 1 x 106 Zellen/ml im ALDEFLUOR Assay Buffer an.</li>
	<li>Etikettieren Sie vier 12 mm x 75 mm Polystyrol-Reagenzgläser als Steuerröhrchen wie folgt: #1: Unstained, #2: ALDEFLUOR, #3: ALDEFLUOR plus DEAB und #4: 7AAD.</li>
	<li>Für diese Steuerröhrchen 1ml Zellsuspension in #1 und #4, aber 2 ml in Tube #2. Fügen Sie 5 l DEAB (ALDH-Hemmer) in die #3 und auf Eis zu halten. Dann 10 l aktiviertes ALDEFLUOR-Substrat in die #2 der Röhre geben, mischen und sofort 1 ml des Gemischs auf #3 übertragen.</li>
	<li>Zur gleichen Zeit fügen Sie den übrigen Zellen (Probenröhren) auch bei 1 x 106 Zellen/ml im ALDEFLUOR Assay Buffer ein aktiviertes ALDEFLUOR-Substrat pro Million Zellen hinzu.</li>
	<li>Inkubieren Sie sowohl die 4 Steuerröhrchen als auch die Probenröhrchen 30 min im 37 °C Wasserbad.</li>
	<li>Nach der Inkubation fügen Sie dem Probenröhrchen 5 l 7AAD #4 und 1 l 7AAD 1 x 106 Zellen in das Probenröhrchen. 10 min bei 4 °C inkubieren.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie alle Rohre für 5 min bei 250 x g und entfernen Sie Überstand.</li>
	<li>Resuspend-Zellen im ALDEFLUOR-Assaypuffer.</li>
	<li>Führen Sie eine Flusszytometrie-basierte Sortierung durch.</li>
	<li>Stellen Sie die Sortiertore mit ALDEFLUOR-gefärbten Zellen, die mit DEAB behandelt werden, als Negativkontrolle und der Propidiumjodid (PI) 7AAD- gebeizten Zellen zur Lebensfähigkeitskontrolle. Basierend auf diesen Steuerungen wurde ein Gate eingerichtet, umdie ALDEFLUOR+/ALDH-Hoch-, D5- und SCC7-Zellen zu unterscheiden. Diese Tore werden dann verwendet, um alle oben für die ALDEFLUOR+/ALDH-Hoch-D5- und SCC7-Zellen vorbereiteten Probenzellen zu sortieren.</li>
</ol>2. Präparation von KrebsStammzell-Lysat-Puls Dendritic Cell (CSC-TPDC) Impfstoff
<ol><li>Euthanisieren Sie Mäuse (syngene B6 bzw. C3H) mitCO2 und isolieren Sie Oberschenkelknochen und Tibiaknochen.</li>
	<li>Legen Sie die Knochen in 75% Ethanol für 1 min bei Raumtemperatur. Dann waschen Sie die Knochen mit HBSS.</li>
	<li>Kopf abschneiden und mit einer 21 G Nadel und einer 10 ml Spritze Zellen in eine Schale schieben.</li>
	<li>Die Zellen mit der Spritze ansaugen und blasen, um die einzellige Suspension herzustellen.</li>
	<li>Nach zentrifugieren in 1.500 U/min für 5 min, entsorgen Sie den Überstand. Dann 5 ml RBC Lysepuffer hinzufügen, um den RBC für 1 min im 37 °C Wasserbad zu lysieren.</li>
	<li>Zählen Sie die Zellzahl und passen Sie die Zellsuspension auf eine Konzentration von 1 Million Zellen/ml in einem vollständigen Medium (CM) an, das 10 ng/ml GM-CSF und 10 ng/ml IL-4 enthält.</li>
	<li>Kultur die Zellen und kompensieren CM plus IL-4 und GM-CSF 3 Tage später.</li>
	<li>Am5. Tag die unreifen dendritischen Zellen (DCs) ernten und das DC-Isolationsmedium mit 4,2 ml Lösung C plus 1 ml OptiPrep Dichtegradientenmedium vorbereiten.</li>
	<li>Setzen Sie die Zellpellets in 5 ml CM auf. Fügen Sie die Zellsuspension langsam auf das Isolationsmedium ein. Zentrifuge bei 2.000 U/min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Sammeln Sie die DCs zwischen cmCM und Isolationsmedium. Zählen Sie die Zellzahl und passen Sie die Zellsuspension auf eine Konzentration von 1 Million Zellen/ml im Kulturmedium an, das 10 ng/ml GM-CSF und 10 ng/ml IL-4 enthält.</li>
	<li>Bereiten Sie Tumorlysate vor, indem SieALDH-hoch- oder unsortierte D5- oder SCC7-Zellen im Kulturmedium aussetzen und viermal schnellen Frost-Tau-Expositionen ausgesetzt werden, gefolgt von Spin bei 100 x g für 5 min, um den Membrananteil der Lysate zu sammeln.</li>
	<li>Zur Herstellung von CSC-TPDC, Puls DCs mit dem Lysat von autologen ALDHhohe Zellen. Zur Vorbereitung von H-TPDC werden Puls-DCs mit unsortiertem heterogenen Tumorzelllysat. Das Verhältnis von Gleichstrom zu Tumorzelllysat ist das gleiche.</li>
</ol>3. Impfung und Bewertung der Wirksamkeit
<ol><li>Impfen Normal-B6-Mäuse jeweils mit 2.500 D5 CSC-TPDC oder D5 H-TPDC Tumorzellen subkutan (s.c.). Impfen Normal C3H Tiere .c. mit 5.000 SCC7 CSC-TPDC oder SCC7 H-TPDC Tumorzellen, bzw.</li>
	<li>Fordern Sie nach der Impfung die B6-Mäuse mit den heterogenen D5-Tumorzellen an, d.h. Euthanisieren Sie die Mäuse 2 20 Tage später mitCO. Die Lunge ernten und Lungenmetastasen aufzählen.</li>
	<li>Im SCC7-Modell fordern Sie die C3H-Mäuse mit unsortierten SCC7-Tumorzellen s.c auf der gegenüberliegenden Seite des DC-Impfstoffs heraus. Überwachen Sie die Tumorgröße.</li>
	<li>Am Ende der Experimente euthanisieren die B6- und C3H-Mäuse mit CO2. An Tag 34 nach dem ersten Impfstoff, einschläfern Mäuse mitCO2, und zur gleichen Zeit sammeln die Milz jeder Gruppe mit einem aseptischen Verfahren.</li>
	<li>Aktivieren Sie Milz-T- und/oder B-Zellen mit immobilisierten Anti-CD3 plus Anti-CD28 mAbs in CM, die hrIL-2 oder LPS plus Anti-CD40 (FGK45) mAb-Aszites enthalten.</li>
	<li>Sammeln Sie nach der Aktivierung Überstand und verwenden Sie den ELISA-Test.</li>
	<li>Für ELISA-Assay, Beschichtungsplatten mit Antikörpern für IFN, GM-CSF und IgG bei 4 °C O/N.</li>
	<li>Nach dem Auftragen des Sperrpuffers Proben und Standards hinzufügen und bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Waschen Sie die Platte und fügen Sie HRP-Erkennungsantikörper und TMB-Substrat für die Inkubation hinzu.</li>
	<li>Messen Sie die Absorption eines ELISA-Plattenlesers bei 450 nm innerhalb von 30 min nach Beendigung der Reaktion.</li>
</ol>

<ol><li>Shafee, N., Smith, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+contribute+to+cisplatin+resistance+in+Brca1%2Fp53-mediated+mouse+mammary+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells contribute to cisplatin resistance in Brca1/p53-mediated mouse mammary tumors.</a> Cancer Res. 68, 3243-3250 (2008).</li>
<li>Nandi, S., Ulasov, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-dose+radiation+enhances+survivin-mediated+virotherapy+against+malignant+glioma+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Low-dose radiation enhances survivin-mediated virotherapy against malignant glioma stem cells.</a> Cancer Res. 68, 5778-5784 (2008).</li>
<li>Dallas, N. A., Xia, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemoresistant+colorectal+cancer+cells%2C+the+cancer+stem+cell+phenotype%2C+and+increased+sensitivity+to+insulin-like+growth+factor-I+receptor+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Chemoresistant colorectal cancer cells, the cancer stem cell phenotype, and increased sensitivity to insulin-like growth factor-I receptor inhibition.</a> Cancer Res. 69, 1951-1957 (2009).</li>
<li>Yamauchi, K., Yang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+cancer+metastasis+by+cyclophosphamide+pretreatment+of+host+mice%3A+an+opposite+effect+of+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Induction of cancer metastasis by cyclophosphamide pretreatment of host mice: an opposite effect of chemotherapy.</a> Cancer Res. 68, 516-520 (2008).</li>
<li>Chang, A. E., Redman, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phase+I+trial+of+tumor+lysate-pulsed+dendritic+cells+in+the+treatment+of+advanced+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A phase I trial of tumor lysate-pulsed dendritic cells in the treatment of advanced cancer.</a> Clin. Cancer Res. 8, 1021-1032 (2002).</li>
<li>Ito, F., Li, Q., Shreiner, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-CD137+monoclonal+antibody+administration+augments+the+antitumor+efficacy+of+dendritic+cell-based+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Anti-CD137 monoclonal antibody administration augments the antitumor efficacy of dendritic cell-based vaccines.</a> Cancer Res. 64, 8411-8419 (2004).</li>
<li>Kirk, C. J., Hartigan-O'Connor, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell-dependent+antitumor+immunity+mediated+by+secondary+lymphoid+tissue+chemokine%3A+augmentation+of+dendritic+cell-based+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">T cell-dependent antitumor immunity mediated by secondary lymphoid tissue chemokine: augmentation of dendritic cell-based immunotherapy.</a> Cancer Res. 61, 2062-2070 (2001).</li>
<li>Ning, N., Pan, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cell+vaccination+confers+significant+antitumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cell vaccination confers significant antitumor immunity.</a> Cancer Res. 72, 1853-1864 (2012).</li>
<li>Ginestier, C., Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CXCR1+blockade+selectively+targets+human+breast+cancer+stem+cells+in+vitro+and+in+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">CXCR1 blockade selectively targets human breast cancer stem cells in vitro and in xenografts.</a> J. Clin. Invest. 120, 485-497 (2010).</li>
<li>Carpentino, J. E., Hynes, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aldehyde+dehydrogenase-expressing+colon+stem+cells+contribute+to+tumorigenesis+in+the+transition+from+colitis+to+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Aldehyde dehydrogenase-expressing colon stem cells contribute to tumorigenesis in the transition from colitis to cancer.</a> Cancer Res. 69, 8208-8215 (2009).</li>
<li>Charafe-Jauffret, E., Ginestier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+cancer+cell+lines+contain+functional+cancer+stem+cells+with+metastatic+capacity+and+a+distinct+molecular+signature%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Breast cancer cell lines contain functional cancer stem cells with metastatic capacity and a distinct molecular signature.</a> Cancer Res. 69, 1302-1313 (2009).</li>
</ol>

STEMCELL Technologies hat Open Access-Publikationsgebühren unterstützt.

Die immungeschwächten Wirte, wie Z. CCID-Mäuse, schließen immunologische Beurteilungen von CSCs aus, da es an adaptiver Immunität innerhalb der Hosts fehlt. In dieser Studie haben wir die Immunogenität von CSCs bei immunkompetenten Wirten untersucht, die Patienteneinstellungen genauer nachahmen könnten. Angereicherte CSCs sind immunogen und könnten eine wirksamere Tumorschutzimmunität hervorrufen, wenn ihre Lysate als Impfstoff auf DCs geladen werden, verglichen mit nicht ausgewählten Tumorzelllysat-pulsierten DCs.  Mechanistisch wurde der Schutz durch selektive Induktion von CSC-reaktiven Antikörpern und T-Zellen8 sowie durch die Herstellung von Typ-1-Zytokin, z. B. IFN und GM-CSF, gewährt.
Die meisten der aktuellen Immuntherapien, einschließlich dendritischer zellbasierter Impfstoffe und der Adoptiv-T-Zelltransfer, sind auf tumordifferenzierte Antigene ausgerichtet. CSCs, die diese differenzierten Antigene möglicherweise nicht ausdrücken, können daher diesen immunologischen Targetings entgehen. Im Gegensatz dazu kann ein CSC-Impfstoff, der speziell auf Krebsstammzellen abzielt, diese spezielle Population der Krebszellen zerstören und so die therapeutische Wirksamkeit des Impfstoffs verbessern, indem er Tumorrückfälle und Metastasen verhindert.
Sowohl in kultivierten Tumorzellen als auch in frisch geernteten Tumoren identifizierten wir die CSC-angereicherte Population durch Durchflusszytometrie auf Basis einer hohen Aldehyd-Dehydrogenase-Aktivität. SolcheALDH-Hochzellen könnten durch Durchflusssortierung isoliert werden, um als Antigenquelle verwendet zu werden, um DC zu pulsieren, um CSC-TPDCs zu erzeugen. VergleichmitALDH-Hochzellen, die aus kultivierten Tumorzellen im Vergleich zu frisch geernteten Tumoren isoliert wurden, zeigte kein signifikanter Unterschied in der Termität der Induktion der Anti-CSC-Immunität8. Diese Ergebnisse zeigten das Potenzial, CSCs zu verwenden, die entweder aus kultivierten Tumorzellen oder aus frisch geernteten Tumoren für die klinische Anwendung isoliert sind.
Um klinisch relevant zu sein, muss ein Impfstoff in einem therapeutischen Umfeld untersucht werden. Diese Experimente werden nun in unserem Labor durchgeführt.

Krebsstammzellen sind relativ resistent gegen konventionelle Chemo- und Strahlentherapie1,2. Auf der anderen Seite könnte diese Population von Zellen die Zellen sein, die für den Rückfall und das Fortschreiten von Krebs nach traditionellen Krebstherapien verantwortlich sind1-4. Aufgrund der fehlenden Expression differenzierter Tumorantigene auf Krebsstammzellen können Krebsstammzellen aktuellen immunologischen Therapien bei Krebs entfliehen, die meist darauf ausgelegt sind, die Antigene auf die differenzierten Tumorzellen zu zielen. Daher kann die Entwicklung neuer Strategien, die speziell auf die Krebsstammzellen abzielen und diese zerstören, Versprechen halten, die therapeutische Wirksamkeit der aktuellen Krebsbehandlung zu erhöhen. Zu diesem Zweck isolierten wir Krebsstammzellen (CSC) angereicherte Populationen aus zwei Tiertumoren (Melanom D5 und Plattenepithelkarzinom SCC7) und verwendeten sie als Antigenquelle, um Antigen-präsentierende Zellen (dendritische Zellen, DC) zur Vorbereitung des CSC-TPDC-Impfstoffs zu pulsieren. Anschließend werteten wir die durch den CSC-TPDC-Impfstoff induzierte Antitumorimmunität bei den syngenischen immunkompetenten Wirten, B6-Mäusen bzw. C3H-Mäusen. Die CSC-TPDC-induzierte Antitumor-Wirksamkeit wurde mit dem traditionellen DC-Impfstoff verglichen, der mit Lysat aus unsortierten heterogenen Tumorzellen (H-TPDC) gepulst wurde, der zuvor von unserer Gruppe5,6sowie von anderen Forschern7 sowohl in präklinischen Studien als auch in klinischen Studien verwendet wurde.

<table><tbody><tr><td>ALDHEFLOUR KIT</td><td>Stemcell Technologies</td><td>1700</td><td></td></tr><tr><td>Maus IL-4</td><td>Pepro Tech</td><td>214-14</td><td></td></tr><tr><td>Maus GM-CSF</td><td>Pepro Tech</td><td>315-03</td><td></td></tr><tr><td>Maus GM-CSF ELISA KIT</td><td>BD Biosciences</td><td>555167</td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep Density Gradient Medium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D1556</td><td></td></tr><tr><td>BD OptEIA TMB Substratreagenz Set</td><td>BD Biosciences</td><td>555214</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACS Aria Cell Sorter</td><td>BD Biosciences</td><td>336834</td><td></td></tr><tr><td>Kcjunior</td><td>Bio-Tek Instruments</td><td>176058</td><td></td></tr></tbody></table>

generierung eines neuartigen dendritisch-zell-impfstoffs mit melanom- und plattenkrebs-stammzellen

Generation of a Novel Dendritic-cell Vaccine Using Melanoma and Squamous Cancer Stem Cells

Wir identifizierten Krebsstammzell(CSC)-angereicherte Populationen von murinen Melanom D5 syngenen bis C57BL/6 Mäuse n. Chr. und dem Plattenepithelkarzinom SCC7 syngeneic zu C3H-Mäusen mit ALDEFLUOR/ALDH als Marker, und testeten ihre Immunogenität mit dem Zelllysat als Quelle von Antigenen, um dendritische Zellen (DCs) pulsieren zu lassen. DCs, die mitALDH-hohen CSC-Lysaten gepulst wurden, induzierten eine signifikant höhere schützende Antitumorimmunität als DCs, die mit den Lysaten unsortierter ganzer Tumorzelllysate in beiden Modellen und in einer Lungenmetastasierung und einer s.c gepulst wurden. Tumorwachstumseinstellung. Dieses Phänomen war auf CSC-Impfstoff-induzierte humorale sowie zelluläre Anti-CSC-Antworten zurückzuführen. Insbesondere Splenozyten, die vom Host isoliert wurden, der DemCSC-DC-Impfstoff ausgesetzt war, produzierten eine signifikant höhere Menge an IFN und GM-CSF als Splenozyten, die vom Wirt isoliert wurden, der einem unsortierten Tumorzelllysat-Geflossen-DC-Impfstoff unterzogen wurde. Diese Ergebnisse unterstützen die Bemühungen, einen autologen Therapeutischen Impfstoff auf CSC-Basis für den klinischen Einsatz in einem adjuvanten Umfeld zu entwickeln.

ALDEFLUOR/ALDH wurde als Einzelmarker verwendet, um Stammzellen in mehreren Malignitäten8-11zu isolieren. Wir identifizierten Krebsstammzell-angereicherte Populationen in zwei Tumormodellen D5 und SCC7, indem wir ALDEFLUOR als Marker verwendet. Wir haben ALDEFLUOR+ Zellen bei dem murinen Melanom B16-D5 und Demkmittelzellkrebs SCC7 nachgewiesen. Wir fanden heraus, dass ALDEFLUOR+-Zellen etwa 0,5 % bzw. 5,2 % zu kultivierten D5- bzw. SCC7-Tumorzelllinien beitragen (Abbildung 1). Frisch geerntete Tumorzellen aus etablierten Tumoren wurden analysiert, um die Existenz von ALDEFLUOR+-Zellen zu bestätigen. Wie auch in Abbildung 1dargestellt, gab es 2,5% bzw. 4,2% der ALDEFLUOR+-Zellen aus in vivo etablierten D5- und SCC7-Tumoren. Die Tumorigenität und die Selbsterneuerungskapazität dieser sortierten D5- und SCC7 ALDEFLUOR+/ALDH-Hochpopulationen wurden beim syngenischen immunkompetenten Wirt, den C57BL/6 und C3H-Mäusen bzw.8,untersucht.
Wir haben heterogenes unsortiertes Tumorzelllysat zu Puls-DCs (H-TPDC) sowohl in Tierstudien als auch in klinischen Studien5,6verwendet. Um die Immunogenität von CSCs zu untersuchen, isolierten wirALDH-hoch CSC und gepulste Gleichstrom mit dem Lysat der CSCs zu generiertem CSC-TPDC (Abbildung 2) und verwendeten H-TPDC als konventionelle Krebsimpfstoffkontrolle, um zu testen, ob CSC-TPDC eine positive Wirkung bei der Verhinderung von Tumorwachstum hat.
Wir haben die Immunogenität von CSCs untersucht, indem wir die durch CSC-TPDC induzierte schutzbeschützende Antitumorimmunität untersucht haben. Im D5-Modell wurden naive immunkompetente Mäuse s.c mit CSC-TPDC oder H-TPDC geimpft (bei gleichem Lysat: DC-Verhältnis). Kontrollgruppen erhielten Saline (PBS). Eine Woche nach dem letzten Impfstoff wurden die Mäuse mit unsortierten D5-Tumorzellen intravenös herausgefordert (i.v.), und die Lunge wurde 3 Wochen später geerntet, um Lungenmetastasen aufzuzählen. Wie in Tabelle 1dargestellt, entwickelten Mäuse, die mit dem H-TPDC behandelt wurden, im Vergleich zur PBS-Gruppe weniger Lungenmetastasen. Wichtig ist, dass Mäuse, die mit CSC-TPDC behandelt wurden, in beiden durchgeführten Experimenten deutlich weniger Lungenmetastasen hatten als die H-TPDC-Impfstoffgruppe. Im SCC7-Modell wurden normale C3H-Tiere s.c mit SCC7 CSC-TPDC bzw. H-TPDC auf der rechten Flanke geimpft, gefolgt von einer Herausforderung mit unsortierten SCC7-Tumorzellen s.c in die linke Flanke. Im Vergleich zur PBS-Gruppe induzierte H-TPDC eine bescheidene Anti-Tumor-Immunität gegen Tumorwachstum. Allerdings gab es eine signifikante Hemmung des Tumorwachstums bei Mäusen, die mit CSC-TPDC behandelt wurden, verglichen mit der Kontrollgruppe und der H-TPDC-Gruppe (p<0.05, Abbildung 3). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass CSCs als effektivere Antigenquelle verwendet werden könnten, um DCs zu laden als herkömmliche unsortierte Tumorzellen bei der Induktion einer schützenden Immunität gegen die Herausforderung von Tumorzellen.
Um die Mechanismen, die der beobachteten CSC-induzierten Schutzantitumor-Immunität zugrunde liegen, weiter zu verstehen, haben wir die Milz von den Tieren geerntet, die am Ende der Experimente DC-Impfungen unterzogen wurden. Die Milzzellen wurden dann durch Anti-CD3/CD28/IL-2 oder Anti-CD3/CD28/IL-2 + LPS/anti-CD40 aktiviert. Dann wurden die Kulturüberstände gesammelt, um den Ausdruck von Zytokinen und Antikörpern zu erkennen.  Deutlich höhere Produktionen von IFN und GM-CSF durch die Milzzellen der mit D5 CSC-TPDC oder SCC7 CSC-TPDC geimpften Tiere (Abbildung 4) gab es. Darüber hinaus gab es eine signifikant (p<0,05) höhere IgG-Produktion durch LPS/Anti-CD40 aktivierte Milzzellen, die von den mit D5 CSC-TPDC oder SCC7 CSC-TPDC geimpften Tieren gesammelt wurden, verglichen mit D5 H-TPDC oder SCC7 H-TPDC. Es wurde festgestellt, dass diese Antikörper an D5 bzw. SCC7 CSCs binden, und eine solche Bindung könnte in Gegenwart von Komplement8zur CSC-Lyse führen.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50561/50561fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50561/50561fig1.jpg"> Abbildung 1. ALDHFLUOR+/ALDHhohe Populationen wurden sowohl bei kultivierten als auch bei neu geernteten frisch geernteten murinen D5-Melanomen und SCC7-Plattenepitheltumoren nachgewiesen. Als Negativkontrolle wurden Tumorzellen verwendet, die mit 50 mmol/L DEAB, einem spezifischen ALDH-Hemmer, behandelt wurden.
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50561/50561fig1highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen.</a> 
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50561/50561fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50561/50561fig2.jpg"> Abbildung 2. Generierung von dendritischen zellbasierten Krebsstammzellen-Impfstoffen. Zur Herstellung von CSC-TPDC und H-TPDC wurden von Knochenmark abgeleitete dendritische Zellen mitALDH-hoch- bzw. unsortierten Tumorzelllysaten gepulst.
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50561/50561fig2highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen.</a> 
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50561/50561fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50561/50561fig3.jpg"> Abbildung 3. CSC-Lysat-gepulster DC-Impfstoff (CSC-TPDC) könnte eine wirksamere Schutz-Antitumor-Immunität in der s.c induzieren. SCC7 Tumormodell. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50561/50561fig3highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen.</a> 

<img alt="Figure 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50561/50561fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50561/50561fig4.jpg"> Abbildung 4. Stärkere systemische zelluläre Reaktionen bei immunkompetenten Wirten, die mit CSC-TPDC geimpftwurden.  Splenozyten wurden von den Tieren geerntet, die der H-TPDC- oder CSC-TPDC-Impfung unterzogen wurden, und wurden wie angegeben aktiviert. Die Kulturüberstandmittel wurden dann zur Zytokin-Erkennung mit ELISA gesammelt.
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50561/50561fig4highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen.</a>

Bewertet in syngeneimmunen immunkompetenten Wirten zeigte der Krebsstammzell-Impfstoff (CSC) eine signifikant höhere Antitumorimmunität als herkömmliche DC-Impfstoffe, die mit heterogenen Massentumorzellen gepulst wurden.

Generierung eines neuartigen Dendritisch-Zell-Impfstoffs mit Melanom- und Plattenkrebs-Stammzellen

We identified cancer stem cell (CSC)-enriched populations from murine melanoma D5 syngeneic to C57BL/6 mice and the squamous cancer SCC7 syngeneic to C3H ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Anti-Tumor-Immunität eines auf Krebsstammzellen oder CSC basierenden dendritischen Zell- oder DC-Impfstoffs in einem immunkompetenten Wirt zu bewerten. Dies wird erreicht, indem zunächst alor-positive Aldehyddehydrogenase oder A LDH hohe CSCs aus heterogenen Tumorzellen isoliert werden. Im zweiten Schritt werden die CSC-DCs isoliert und anschließend mit Lysat für den Impfstoff präsentiert.Anschließend wird der CSC-Lysat-Puls-DC- oder TP-DC-Impfstoff normalen syngenenen immunkompetenten Wirtsorganismen verabreicht. Im letzten Schritt wird dann die schützende Anti-Tumor-Wirksamkeit des C-S-C-T-P-D-C-Impfstoffs bewertet. Abschließend kann ein ELISA durchgeführt werden, um die durch den C-S-C-T-P-D-C-Impfstoff induzierte Anti-CSC-Immunität der Wirt-T-Zellen und -Antikörper zu untersuchen.Dieses Projekt vereint zwei der spannendsten Bereiche der Krebsforschung: den Bereich der Krebsstammzellen und den Bereich der Tumor-Immuntherapie. Unser Labor gehörte zu den ersten, die Krebsstammzellen in soliden Tumoren entdeckten. Dies sind die Keime des Krebses, die sein Wachstum sowie die Metastasierung antreiben.Was Sie heute sehen werden, ist ein neuer Ansatz, der Immuntherapie nutzt, um gezielt diese Krebsstammzellen anzusteuern. Wir verwenden einen bestimmten Marker namens Aldehyddehydrogenase, der mittels des Alde-fluoro-Assays nachgewiesen werden kann. Sie werden die Ärzte Lin Liu und Huon Tau gemeinsam mit Dr. Chow Lee arbeiten sehen.Wir hoffen, dass wir durch die gezielte Bekämpfung dieser Krebsstammzellen die Behandlungsergebnisse für Patienten mit vielen Arten von Krebserkrankungen verbessern können. Suspendieren Sie zunächst die Tumorzellen der Wahl in Alor-Assay-Puffer mit einer Konzentration von einer mal 10 hoch 6 Zellen pro Milliliter. Übertragen Sie danach bis auf drei Milliliter alle Tumorzellen auf die jeweiligen Probenröhrchen und beschriften Sie vier 12 mal 75 Millimeter große Polystyrol-Kontrollröhrchen wie folgt: unbehandelt, Alor, ALOR plus DEAB und 7-AAD. Geben Sie je ein Milliliter der Zellsuspension in die unbehandelten und 7-AAD-Röhrchen sowie zwei Milliliter in das Aldefluor-Röhrchen. Fügen Sie dann fünf µL DEAB in die ALOR-plus-DEAB-Röhrchen hinzu. Stellen Sie die Röhrchen auf Eis und geben Sie anschließend 10 µL aktiviertes ALOR-Substrat in das ALOR-Röhrchen. Übertragen Sie unverzüglich 1 mL der Substratlösung in das ALOR-plus-DEAB-Röhrchen und geben Sie danach 2 µL aktiviertes ALOR-Substrat pro 1 Million Zellen in jedes der Probenröhrchen.Alle Röhrchen 30 Minuten lang in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius inkubieren und anschließend fünf µL Seven AAD zum Seven-AAD-Röhrchen sowie einen µL Seven AAD pro eine Million Zellen jedem Probenröhrchen hinzufügen. Diese Röhrchen 10 Minuten lang bei vier Grad Celsius lagern. Alle Röhrchen fünf Minuten lang bei 250 × g bei Raumtemperatur zentrifugieren und die Pellets in AldeFluor-Assay-Puffer zur fluoreszenzaktivierten Zellsortierung resuspendieren.Um die Sortiertore einzustellen, verwenden Sie die Aldefluor-plus-DEAB-Zellen als Negativkontrolle und die mit 7-AAD gefärbten Zellen als Kontrolle der Vitalität. Basierend auf diesen Kontrollen definieren Sie ein Tor zur Unterscheidung der Alor-positiven ALDH-, D5-hoch- und SCC-7-Zellen. Verwenden Sie dieses anschließend, um die Probenzellen in Alor-positive ALDH-, D5-hoch- und SCC-7-Subpopulationen zu sortieren.Um die dendritischen Zellen zu erzeugen, isolieren Sie zunächst die Femur- und Tibiaknochen von einer C57BL/6- und einer C3H-Maus. Sterilisieren Sie die Knochen für eine Minute bei Raumtemperatur in 75 % Ethanol und waschen Sie sie anschließend in HBSS. Schneiden Sie danach die Enden der Knochen ab und spülen Sie mit einer 10-Milliliter-Spritze, die mit einer 21-Gauge-Nadel ausgestattet ist, das Knochenmark in eine Petrischale aus. Aspirieren und dosieren Sie die Zellen mehrmals, um eine Einzelzell-Suspension herzustellen, und zentrifugieren Sie anschließend die Zellen.Das Pellet in fünf Milliliter Puffer zur Lyse roter Blutkörperchen für eine Minute im 37 °C warmen Wasserbad inkubieren. Nach der Zellzählung das Volumen auf 1 × 10⁶ Zellen pro Milliliter in Kulturmedium, ergänzt durch G-M-C-S-F und IL-4, einstellen. Anschließend die Zellen bei 37 °C und 5 % CO₂ kultivieren und nach drei Tagen das Medium sowie die Zytokine erneuern.Am fünften Tag die unreifen dendritischen Zellen gewinnen. Nach dem Zentrifugieren die Zellen in fünf Milliliter Kulturmedium resuspendieren und die Zellsuspension langsam auf frisch zubereitetes Isolationsmedium schichten. Nach erneutem Zentrifugieren die DCs an der Grenzschicht zwischen Kulturmedium und Isolationsmedium sammeln.Danach die Zellen zählen, das Volumen auf eine Konzentration von einer mal 10 hoch sechs Zellen pro Milliliter in Kulturmedium einstellen, ergänzt mit G-M-C-S-F und IL-4. Erstellen Sie nun die Tumorlysate, indem Sie die sortierten Zellen viermal schnellen Einfrier- und Auftauzyklen aussetzen, gefolgt von einer Zentrifugation zur Sammlung des membranständigen Anteils der Lysate. Pulsieren Sie anschließend die DCs mit dem Lysat aus den sortierten autologen A-LDH-hoch-Zellen. Zur Herstellung der CSC-TPCs.Zur Vorbereitung des H-T-P-D-C-Impfstoffs injizieren Sie 1 × 10⁶ der mit unsortiertem heterogenem Tumorzelllysat beladenen Zellen suspendiert in 100 µL PBS einmal subkutan in die linke Flanke jedes Mauses. Nach der Impfung verabreichen Sie intravenös 1 × 10⁵ heterogene D5-Tumorzellen in 100 µL PBS, um die C57BL/6-Empfängermäuse zu provozieren. Für das SCC7-Modell impfen Sie die C3H-Empfängermäuse subkutan mit 1 × 10⁶ unsortierten SCC7-Tumorzellen in 100 µL PBS auf der gegenüberliegenden Seite des DC-Impfstoffs. Erstellen Sie eine Einzelzell-Suspension aus den Milzen der empfänglichen C3H-Mäuse. Aktivieren Sie anschließend die Milz-T- und B-Zellen mit immobilisierten anti-CD3- und anti-CD28-Monoklonalen Antikörpern im Kulturmedium, das mit dem entsprechenden Stimulus ergänzt ist. Nach vier Tagen sammeln Sie die Überstände und beschichten ELISA-Platten über Nacht bei vier Grad Celsius mit Antikörpern gegen Interferon-gamma, GM-CSF oder IgG. Blocken Sie am nächsten Tag die Platten zur Vermeidung unspezifischer Bindung, geben Sie die Standards und die gerade gesammelten Überstände hinzu und inkubieren Sie die Platten nach dem Waschen bei Raumtemperatur. Fügen Sie danach eine HRP-Erkennungsantikörperlösung eine Stunde lang hinzu und geben Sie anschließend das TMB-Substrat dazu.Miss abschließend die Extinktion innerhalb von 30 Minuten nach Beendigung der Reaktion bei 450 Nanometern mit einem ELISA-Plattenlesegerät. Alor wurde als Marker zur Isolierung von Stammzellen bei mehreren malignen Erkrankungen verwendet, einschließlich der beiden tumorstammzellreichen Populationen D fünf und SCC sieben, wie spezifisch in diesen Punktdiagrammen gezeigt. Alor-positive Zellen stellen jeweils etwa 0,5 % und 5,2 % der kultivierten Tumorzelllinien D fünf und SCC sieben dar. Frisch gewonnene Tumorzellen wurden ebenfalls untersucht und enthielten jeweils 2,5 % und 4,2 % alor-positiver Zellen aus in vivo etablierten D-fünf- und SCC-sieben-Tumoren.Tumorzellen, die mit einem spezifischen A-LDH-Inhibitor D-E-A-B-A behandelt wurden, dienten als negativer Kontrollansatz. Die Immunogenität von Krebsstammzellen wurde durch die Untersuchung der schützenden Anti-Tumor-Immunität bewertet, die durch CSC-TPCs unter Verwendung des gerade demonstrierten Impfmodells induziert wurde. Wie in dieser Tabelle dargestellt, entwickelten Mäuse, die mit den H-TPCs behandelt wurden, weniger Lungenmetastasen als Mäuse, die allein mit PBS behandelt wurden.Wichtig ist, dass Mäuse, die mit CSCT-PCs behandelt wurden, noch weniger Lungenmetastasen aufwiesen als Tiere, die mit H-T-P-D-C oder PBS allein behandelt wurden. Im SCC-sieben-Modell wurden normale C3-H-Tiere wie gerade beschrieben im Vergleich zur Kontrollgruppe geimpft. H-TPCs induzierten eine moderate Anti-Tumor-Immunität, während CSC-TPCs eine signifikante Hemmung des Tumorwachstums hervorriefen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass CSCs möglicherweise als wirksamere Antigenquelle zur Beladung von Dendritischen Zellen (DCs) genutzt werden können als herkömmliche, nicht sortierte Tumorzellen, um eine schützende Immunität gegen die Herausforderung durch Tumorzellen zu induzieren.Um die Mechanismen, die der beobachteten, durch CSC induzierten schützenden Anti-Tumor-Immunität zugrunde liegen, weiter zu verstehen, wurden Zellen aus DC-geimpften Tieren aktiviert und ihre Zytokinproduktion mittels ELISA gemessen. Wie gerade gezeigt wurde, war die Zytokinproduktion signifikant höher in den Zellen, die aus Tieren gewonnen wurden, die mit D5-CSC-TPCs oder SCCC7-CSC-PCs geimpft worden waren, im Vergleich zu jenen, die aus Tieren stammten, die mit D5-HTPCs oder SCC7-HTCs geimpft worden waren. Heute haben Sie gelernt, wie man den Alor-Assay zur Isolierung von Krebsstammzellen verwendet.Diese Krebsstammzellen können anschließend zur Entwicklung von Immuntherapien unter Verwendung von dendritischen Zellen genutzt werden. Wir hoffen, dass diese Immuntherapien, entweder allein oder in Kombination mit bestehenden Therapien, die Prognose für Patienten mit vielen Krebsarten verbessern werden.

generation-novel-dendritic-cell-vaccine-using-melanoma-squamous

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Dieses Video zeigt einen zellbasierten Tumorimpfassay. Eine Maus, der intradermal B16-F10-Melanomzellen zur Tumorbildung injiziert wurden, wird mit B16-F10-Zellen geimpft, die Flt3L-Zytokin in der Nähe des entwickelten Tumors sezernieren. Das aus dem Impfstoff sezernierte Flt3L fördert die Reifung und Proliferation von dendritischen Zellen, die dann Tumorantigene an T-Zellen in Lymphknoten abgeben und so eine gezielte Anti-Tumor-Immunantwort auslösen.

Tumorimplantation und Injektion eines Tumorimpfstoffs in einem Mausmodell

Das am häufigsten verwendete Verfahren zum Erzeugen einer großen Anzahl von autologen dendritischen Zellen (DCs) zur Verwendung bei Tumor-Immuntherapie beschrieben. Das Verfahren nutzt IL-4 und GM-CSF zu DCs aus Monozyten differenzieren. Die unreifen DCs sind, um zu reifen und dann mit Antigenen beladen stimuliert, bevor sie zurück in den Patienten injiziert werden.

Herstellung von Tumor-Antigen-beladenen reifen dendritischen Zellen für die Immuntherapie

Dieser Artikel beschreibt die Herstellung von frisch gewonnenen Melanomgewebe in primären Zellkulturen und wie Kontaminationen von Erythrozyten und Fibroblasten von den Tumorzellen zu entfernen. Schließlich beschreiben wir, wie...

Patienten abgeleitet Zellkultur und Isolierung von CD133<sup&gt; +</sup&gt; Mutmaßliche Cancer Stem Cells von Melanoma

Das Ziel dieses Protokolls ist es, das Protokoll für die Reprogrammierung von Melanomtumor-infiltrierenden Lymphozyten in induzierte pluripotente Stammzellen zu zeigen.

Die Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen aus menschlichen Melanom-Tumor-infiltrierenden Lymphozyten

Dieser Artikel beschreibt eine neuartige Methode zur Erzeugung von Tumorantigen-spezifischen induzierten pluripotenten Stammzellen-abgeleiteten thymischen Auswanderern (iTE) durch ein dreidimensionales (3D) thymische Kultursystem. iTE sind eine homogene Teilmenge von T-Zellen, die eng mit naiven T-Zellen verwandt sind und die Fähigkeit zur Proliferation, Gedächtnisbildung und Tumorunterdrückung haben.

Ein dreidimensionales thymisches Kultursystem zur Generierung von murine induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Tumor-Antigen-spezifischen thymischen Auswanderern

Die Tranmmunisierung (TI) Gerät oder Platte und verwandte Protokolle wurden entwickelt, um die wichtigsten Merkmale der extrakorporalen Photochemotherapie (ECP) zu replizieren, in einem experimentellen Umfeld, die die Produktion von physiologisch aktivierten, tausenfähigen dendritischen Zellen (DCs) für die Krebs-Immuntherapie.

Neuartiges Protokoll zur Generierung physiologischer immunogener Dendritischer Zellen

Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Erzeugung funktioneller Tumorantigen-spezifischer induzierter pluripotenter Stammzell-abgeleiteterCD8- + einzelner positiver T-Zellen mit OP9/DLL1-Kokultursystem.

Verwendung von humaninduzierten pluripotenten Stammzellen zur Erzeugung von Tumorantigen-spezifischen T-Zellen

Hier wird ein Protokoll zur wirksamen Unterdrückung der Hepatitis-B-Virus -Replikation (HBV) bei Mäusen unter Verwendung des Adoptivzelltransfers (ACT) von Stammzell-abgeleitetem viralem Antigen (Ag)-spezifischen T-Lymphozyten vorgestellt. Dieses Verfahren kann für eine mögliche ACT-basierte Immuntherapie der HBV-Infektion angepasst werden.

Stammzell-abgeleitete virale Ag-spezifische T-Lymphozyten unterdrücken HBV-Replikation bei Mäusen

Das Protokoll stellt ein Krebsimmuntherapiemodell mit zellbasierter Tumorimpfung mit Flt3L-exprimierendem B16-F10-Melanom vor. Dieses Protokoll demonstriert die Verfahren, einschließlich der Vorbereitung kultivierter Tumorzellen, der Tumorimplantation, der Zellbestrahlung, der Messung des Tumorwachstums, der Isolierung intratumoraler Immunzellen und der Durchflusszytometrieanalyse.

Experimentelles Melanom-Immuntherapiemodell mit Tumorimpfung mit einem hämatopoetischen Zytokin

Ein einzigartiges, umfassendes Protokoll zur Generierung von de-sialylierten humanen monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen (mo-DCs) aus isolierten mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) unter Verwendung einer Sialidase-Behandlung wird vorgestellt. Des Weiteren werden Methoden zur Beurteilung der phänotypischen und funktionellen Charakterisierung von mo-DCs beschrieben und evaluiert, wie die Behandlung mit Sialidase das Reifungsniveau von mo-DCs verbessert.

Generierung von Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen mit unterschiedlichen sialylierten Phänotypen

Dieses Protokoll beschreibt die in vivo Reprogrammierung von Krebszellen der Maus in dendritisch-ähnliche Zellen vom Typ 1 innerhalb der Tumormikroumgebung durch erzwungene Expression der Transkriptionsfaktoren PU.1, IRF8 und BATF3.

Steuerbare in vivo Reprogrammierung von Tumorzellen zu konventionellen dendritischen zellähnlichen Zellen vom Typ 1

Erfahren Sie die Herstellung eines dendritischen Zell-Impfstoffs mit Melanom- und Plattenkrebs-Stammzellen zur Induktion antitumoraler Immunität. Diese Methode zeigt eine deutlich stärkere Immunantwort als herkömmliche Impfstoffe.

Generierung eines neuartigen Dendritisch-Zell-Impfstoffs mit Melanom- und Plattenkrebs-Stammzellen

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