Frühe Metamorphic Insertion Technologie für Fluginsektenverhaltensüberwachung

Hallo, ich bin Alex Derber aus dem Labor von Dr.Albert Bos. Ich bin der Fachbereich Elektrotechnik an der North Carolina State University. Heute werden wir ein neuartiges chirurgisches Verfahren zur Implantation von Elektroden in die Geschlechtsräue der Manica in frühen metamorphen Stadien demonstrieren.

Bei diesem Verfahren, das als Early Metamorphic Insertion Technology bezeichnet wird, werden die implantierten Elektroden während des pupillenmetamorphen Stadiums in das Gewebe des Insekts integriert. Ein großer Vorteil dieses Verfahrens besteht darin, dass es zu einer mechanisch stabilen und elektrisch zuverlässigen Kopplung mit dem neuromuskulären Gewebe führt und die Untersuchung der Flugneurophysiologie des Insekts ermöglicht. In der Erwachsenenphase durchläuft die IC Mensa einen metamorphen Lebenszyklus, der etwa 40 Tage dauert.

Die Mensa beginnt ihren Lebenszyklus im Eistadium. Nach sieben bis 10 Tagen ist die Larve geschlüpft und hat das dritte Stadium der Sternlarve erreicht. Es gibt insgesamt fünf Sternlarvenstadien, und in jedem dieser Stadien durchlaufen die Larven die Energiegewinnung und das Wachstum.

Fünf bis sechs Tage nach dem fünften Larvenstadium tritt das Insekt in das frühe Pupillenstadium ein. Während der Pupillenphase findet eine umfangreiche Programmdegeneration und eine anschließende Regeneration des Insektengewebes statt. Zur Vorbereitung auf das Schlüpfen als erwachsene Motte verbringt das Insekt 17 bis 19 Tage.

Im frühen Pupillenstadium, bevor wir in das späte Pupillenstadium eintreten, während des späten Pupillenstadiums, führen wir operativ eine elektrisch leitfähige Elektrode in den dorsalen Thorax der Pupille ein. Das Gewebe bildet sich um die implantierten Elektroden herum und sichert deren Befestigung am Körper des Insekten. Im Laufe einiger Tage treten die Elektroden, die in den Brustkorb der Pupille eingeführt werden, im letzten Erwachsenenstadium als Motte als Teil des Körpers des Insekts hervor und nutzen so den Wiederaufbau des gesamten Gewebesystems des Insekts.

Während der metamorphen Entwicklung werden die Elektroden in die indirekte Flugmuskulatur im Thorax implantiert. Diese Muskelgruppen, die indirekt für die Flügelbewegung verantwortlich sind, sind die dorsale ventrale und die dorsale Längsmuskulatur. Hier zeigen wir eine Elektrodeneinführung in die dorsalen ventralen Muskeln, die indirekt für den Flügelaufschlag verantwortlich ist.

Mit diesem Einsetzen werden wir drahtlos das Elektromyogramm der dorsalen Bauchmuskulatur während der Bewegung aufzeichnen. Da das Insekt an einer elektromagnetisch schwebenden Plattform in einer LED-Arena hängt, stimuliert dies die Bewegung. Das Verfahren zur frühen Metamorphose-Einfügetechnik beginnt mit dem Aufbau einer Leiterplatte, die als Schnittstelle zwischen den eingesetzten Elektroden und dem Aufzeichnungsinstrument verwendet wird.

Die Drahtelektroden werden auf die Leiterplatte gelötet, die in einem flachen, flexiblen Kabelstecker angeschlossen ist. Messen und schneiden Sie zunächst ein 0,5 x fünf Zentimeter großes Stück kupferkaschiertes Laminat mit einer feinen Spitze, einem Permanentmarker und einer Schere mit derselben feinen Spitze, dem Permanentmarker. Zeichnen Sie drei 0,1 x fünf Zentimeter große quadratische Pads als Ätzmaskenmuster.

Verwenden Sie ein Gerät mit gerader Kante, z. B. ein Lineal, um die Markierungen über die gesamte Länge des Kupferlaminatausschnitts vorzunehmen. Achten Sie darauf, dass die Markierungen fett sind und sich nicht überlappen. Überlappen sich die Markierungslinien miteinander, werden die Elektroden kurzgeschlossen.

Wenn Sie den Anschluss an den flachen, flexiblen Kabelstecker herstellen und die Platinen unbrauchbar machen, bringen Sie den Kupferlaminatausschnitt in einen belüfteten Bereich, am besten mit dem Abzug zum Ätzen der Markierungen auf das Kupferlaminat. Seien Sie vorsichtig beim Umgang mit dem Ätzen der Leiterplatte, da dies giftig ist. Wenn es verschluckt oder verschluckt wird und die Haut bei Kontakt reizen kann, legen Sie das Teflonband auf ein Ende des Kupferlaminatausschnitts, der etwa einen Zentimeter entlang der Länge abdeckt.

Befestigen Sie als Nächstes den Kupferlaminatausschnitt mit Klebeband an der Innenseite eines Messbechers, so dass die Hälfte des Kupferlaminatstreifens in die Ätzung eingetaucht ist. Stellen Sie den Becher für 20 Minuten auf eine rotierende Plattform. Entfernen Sie das geätzte Kupferlaminat aus dem Becherglas und legen Sie es für 10 Minuten in ein mit Wasser gefülltes Becherglas.

Zum Spülen der Rückstände tragen Sie Isopropylalkohol auf ein Stück zartes Tuch auf und wischen Sie die Markierungen ab, um die nicht geätzten Kupferpads freizulegen. Entfernen Sie alle Spuren des Permanentmarkers. Schneiden Sie die Leiterplatte in kleinere Quadrate von etwa einem Zentimeter Länge.

Nachdem die Leiterplatten nun geätzt wurden, müssen die Elektroden für die Befestigung vorbereitet werden. Es wird empfohlen, diese Schritte mit visueller Hilfe eines Mikroskops durchzuführen. Schneiden Sie mit einer scharfen Klinge zwei Stücke beschichteten, knieenden Edelstahldraht mit einem Durchmesser von 0,11 Zoll beschichtet und 0,008 Zoll blank, zwei Längen von jeweils drei Zentimetern.

Diese Stücke aus Edelstahldraht sind die aktiven Elektroden, die in den Brustkorb des Insekts eingeführt werden. Entfernen Sie mit einer Rasierklinge vier bis fünf Millimeter der Kunststoffbeschichtung von jedem Ende jedes Drahtes. Als nächstes schneiden.

Ein 0,7 Zentimeter langes Stück isolierter Edelstahldraht, um eine Spitzenverlängerung für die Masseelektrode zu schaffen. Entfernen Sie die Beschichtung vorsichtig mit der Rasierklinge, wie im vorherigen Schritt durchgeführt, oder schmelzen Sie sie mit der Hitze eines Lötkolbens. Schneiden Sie als nächstes ein Stück lititz Draht auf eine Länge von 4,5 Zentimetern ab.

Für dieses Lot kann auch Induktordraht verwendet werden. Das zuvor vorbereitete 0,7 Zentimeter große Stück Edelstahl wird an das lititz Erdungsanschlusskabel angehängt. Eine freiliegende Edelstahlspitze sollte sich am Ende des Erdungsanschlusses befinden.

Kleben Sie die geätzte Leiterplatte mit einem Teflonband an den Lötarbeitsbereich. Legen Sie das Klebeband so über die Leiterplatte, dass ein bis zwei Millimeter der Pads das Löten der Elektroden auf die Platine ermöglichen. Die maskierten lötfreien Enden der Pads werden in den FCC-Anschluss eingeführt.

Richten Sie die drei Elektrodendrähte mit Teflonband so aus, dass jeweils ein Ende mit den entsprechenden Pads auf der Elektrodenplatine verlötet werden kann. Die beiden aktiven Elektroden sollten auf die Pads in der Nähe der Ränder der Platine gelötet werden. Die beleuchteten Masseelektroden sollten auf das Mittelpad gelötet werden.

Tragen Sie Edelstahlflussmittel auf die Elektrodenpads auf, um das Löten zu erleichtern. Achten Sie darauf, dass die Pad-Verbindungen nicht durch zu viel Lot kurzgeschlossen werden. Tauchen Sie die Elektroden jeweils 10 Minuten lang in Aceton in Isopropylalkohol.

Zur Reinigung der Lötrückstände. Die Lösungen können in separate Schalen oder Becher gegossen werden Um die Reinigungsleistung zu verbessern, können Sie die Elektroden während des Eintauchens in ein Ultraschallbad legen und die Reinigungslösungen verwenden. Die Insekten sind während der Übergänge zwischen Tag und Nacht am aktivsten.

Daher sollte innerhalb einer Insektenkammer mit Hilfe von automatischen Auslass-Timern ein künstlicher Tag-Nacht-Zyklus eingerichtet werden. Diese sollten so eingestellt sein, dass sie einen siebenstündigen Dunkel- und einen 17-stündigen Lichtzyklus simulieren. Untersuchen Sie das Manduka Sex Auge Pu Auge täglich, um die geeignete Einführzeit zu bestimmen.

Die Pu-Ösen sind etwa einen Tag nach den Flügeln bereit zum Einsetzen. Zeigen Sie dunkle Flecken: Das Einführen ist am erfolgreichsten, wenn es sieben bis vier Tage vor Schließung hier durchgeführt wird. Das dunklere PU auf der Unterseite ist bereit für das chirurgische Einführen der Elektroden, um das Pui zu betäuben.

Legen Sie sie für etwa sechs Stunden bei vier Grad Celsius in den Kühlschrank. Bereiten Sie als Nächstes das Einfügen des Arbeitsbereichs vor. Der Arbeitsbereich sollte Isopropylalkohol und scharfe Pinzettenklingen in einer 30-Gauge-Injektionsnadel enthalten.

Als Option kann Cyanacrylat-Klebstoff verwendet werden, um die Elektrodenfixierung zu verbessern, die Nadelpinzette und die Elektroden zu sterilisieren, indem sie in Iso-Propylalkohol getaucht oder abgewischt werden. Nehmen Sie die Pupille nach sechs Stunden aus dem Kühlschrank und bringen Sie sie in den Arbeitsbereich. Bestimmen Sie die Position am dorsalen Thorax, die der interessierenden Muskelgruppe entspricht.

Hier interessieren wir uns für die dorsalen ventralen Muskeln, die für die Bewegung des Flügels nach oben verantwortlich sind. Kratzen Sie mit einer scharfen Klinge oder einer Injektionsnadel vorsichtig ein Quadrat von einem Zentimeter durch die Exo-Nagelhautschicht. Mit der Pinzette diese Stücke langsam abziehen.

Verwenden Sie die Pinzette, um Flügelhaare aus dem freiliegenden Bereich des Brustkorbs zu entfernen. Optional kann ein Vakuum verwendet werden, um den Reinigungsprozess zu unterstützen. Es ist wichtig, so viel wie möglich von den Haaren zu entfernen, um eine Beeinträchtigung der eingeführten Elektroden zu vermeiden.

Führen Sie die Nadel langsam etwa fünf Millimeter in den Meso-Thax ein, wo die Flügel am Brustkorb ansetzen, um zwei Einstichpunkte zu schaffen, die auf die Muskelgruppe abzielen. Merken Sie sich, wo die Löcher gemacht sind, da sie schwer zu finden sein können, wenn sie verloren gehen. Stabilisieren Sie die Puppe auf dem Tisch und führen Sie die beiden Aufnahmeelektroden optional mit einer Pinzette in die beiden Einführpunkte, um die mechanische Haltbarkeit zu erhöhen.

Reinigen Sie alle Haare um die Elektroden herum und tragen Sie mit dem Drahtapplikator großzügig Ciano Accolate Kleber um jeden Einstichpunkt auf dem Brustkorb auf. Bereiten Sie den Käfig für ELO mit einem rauen und strukturierten Material vor, das die Wände und die Decke abdeckt und auf das das Insekt klettern könnte. Im Aufgang können perforierte Kartons oder Packpapier verwendet werden.

Bereiten Sie eine starre Fixierung vor. Halten Sie sich an etwa sechs Zentimeter Länge und zwei Millimeter Durchmesser. Schieben Sie diesen Stick vorsichtig durch das Loch unter den hervorstehenden Profis.

Plastik rührt. Für diesen Schritt kann ein Wattestäbchen oder Metalldrähte verwendet werden. Befestigen Sie beide Seiten des Stäbchens so auf der Käfigoberfläche, dass die Puppe nicht herumrollen kann.

Positioniere die Puppe so im Käfig, dass der Meso Thax nach oben zeigt. Umfangreiche Bewegungen können zu einer Beschädigung der Elektroden, zum Verlust des Heli oder zur Unbrauchbarkeit des Einführens führen. Die Erdungselektrode sollte in den Bauch oder den distalen Teil des Thorax eingeführt werden.

Um eine Signalkopplung zu vermeiden, kann die Disin-Insertion entweder in den späteren Stadien der Pupillenentwicklung oder nach dem Schlüpfen des Insekts erfolgen. Die Einführstelle der Erdungselektrode muss in dieser Pupillenstufe entweder für das Einsetzen in die Pupillenstufe oder für das Einsetzen im Erwachsenenstadium vorbereitet werden. Hier wird im Erwachsenenstadium das Einführen von Masseelektroden demonstriert.

Lege sie für sechs Stunden bei vier Grad Celsius in den Kühlschrank. Bereiten Sie für die Kaltbehandlung die Immobilisierung des Einführarbeitsbereichs vor, einschließlich Isopropylalkohol, scharfer Pinzette, einer 30-Gauge-Injektionsnadel Cyan, einem Creol-Kleber, einem Stück Draht zum Auftragen von Klebstoff, einem optionalen thermischen Kauterisator in einem optionalen Zahnwachsstift. Tauchen Sie die Injektionsnadel wie zuvor in den Isopropylalkohol ein, bevor Sie mit der Motte in Kontakt kommen, die sich an einem Einstichpunkt befindet, der etwa ein bis zwei Zentimeter von den Aufzeichnungselektroden entlang des hinteren Abdomens entfernt ist, führen Sie die Nadel langsam ein, um den Bauch zu punktieren und eine Einführseite bereitzustellen.

Die Nadel sollte nicht mehr als vier Millimeter eindringen. Wenn Hämolymphe an der Einführseite austritt, haben Sie die Nadel zu weit eingeführt und es ist weniger wahrscheinlich, dass der Eingriff erfolgreich ist. Führen Sie die Masseelektrode vorsichtig mit einer Pinzette in die Einstichstelle ein und üben Sie Druck aus, bis sie drei bis vier Millimeter tief ist.

Halten Sie die Elektrode an Ort und Stelle und verwenden Sie einen Draht, um Klebstoff um die Einstichstelle aufzutragen Als optionaler Schritt. Um die mechanische Festigkeit des Einstichs weiter zu verbessern, verwenden Sie den thermischen Kauterizer und sammeln Sie einen kleinen Wachsschlag von zwei bis drei Millimetern an der Spitze. Platzieren Sie die Spitze nahe an der Einstichstelle und wenden Sie Hitze an, so dass das Wachs die Elektrode umgibt und sie fest an Ort und Stelle hält.

Lassen Sie das Insekt nach dem Abkühlen einen Tag lang sich von der Insertion erholen, bevor Sie Experimente durchführen. Eine Adapterplatine mit einem flachen, flexiblen Kabelstecker, der erforderlich ist, um die Elektrodenplatine des Insekts mit dem Dreieck der internationalen Kopftischeinheit von Biosystems zu verbinden. Die Adapterplatine verwendet eine geätzte Kupferlaminatplatte, die vorbereitet werden muss, indem die zuvor beschriebenen Schritte zur Vorbereitung der Kante zur Elektrodenplatine an der Lötstation befolgt werden, löten Sie einen flachen flexiblen Kabelstecker an ein Ende der vorbereiteten Platine.

Ein 10-poliger flexibler Flachkabelstecker kann mit den beiden Stiftpaaren an den Kanten des Steckverbinders und dem zentralen Stiftpaar in Kontakt mit den drei Kupferpads auf die Platine gelötet werden. Als nächstes löten Sie drei 30 amerikanische Drahtquerschnittsdrähte an drei Pads. Am anderen Ende der Platine werden drei Mini-Anschlüsse an die drei Pads auf der Adapterplatine für Oszilloskop-Messwerte wie beschrieben angeschlossen.

Im nächsten Schritt positionieren Sie zwei der Verbinder senkrecht zu den Rändern der Platine. Der mittlere Steckverbinder sollte leicht nach oben von der Ebene der Platine weg abgewinkelt werden, wobei das andere Ende dieser drei Drähte an den Kopfstufenstecker gerichtet werden sollte. Zur Verfügung gestellt von Triangle Biosystems International.

Die Leiterplatte des Kopftisches sollte dann auf dem Schweberahmen befestigt werden, um die Zuverlässigkeit der Elektroden zu verbessern und das Signal-Rausch-Verhältnis zu beobachten. Es können Aufzeichnungen von angebundenen Oszilloskopen bezogen werden. Bevor Sie das drahtlose Aufzeichnungssystem einsetzen, schließen Sie das Oszilloskop an einen Mehrkanal-AC-Neuroaufzeichnungsverstärker an.

Stellen Sie die Verstärkerparameter auf eine Hochpass-Grenzfrequenz von einem Hertz, eine Tiefpass-Grenzfrequenz von 20 Kilohertz und eine Verstärkung von 100 ein. Verbinden Sie jede der Mini-Kabelbuchsen auf der Adapterplatine mit den Eingangskanälen des Verstärkers. Entfernen Sie das Insekt mit der implantierten Elektrodenplatte aus dem Käfig.

Wenn es sich in einem aktiven Zustand befindet, kann ein Stück Gewebe unter die Motte gelegt werden, um sich darauf auszuruhen, bevor die Messungen durchgeführt werden. Schieben Sie die Elektrodenplatine mit einer Pinzette in den flachen, flexiblen Kabelverbindungsempfänger auf der Adapterplatine. Entfernen Sie das Gewebe unter dem Insekt und beobachten Sie die Entstehung von Elektromyogramm-Spikes. Während das Insekt mit seinen Flügeln schlägt, erfassen und speichern es die Daten auf dem Oszilloskop.

Diese Abbildung zeigt das Muskelpotentialsignal, das mit dem Oszilloskop von einem der Muskeln vor und während des Flügelschlags erfasst wird. Das Signal wurde mit hundertfacher Verstärkung und einem Hochpassfilter von einem Hertz und einem Tiefpassfilter von 20 Kilohertz und der Ruhephase verarbeitet. Es werden keine Muskelpotentiale beobachtet.

Die Muskelpotentiale beim Flügelschlag treten bei etwa 15 bis 20 Hertz auf. Sobald die Oszilloskop-Messungen erfasst und verifiziert wurden, sollten die drahtlosen EMG-Signale gesammelt werden. Eine elektromagnetische Schwebeplattform kann für die drahtlose Aufzeichnung von EMG-Signalen während des angebundenen Manus-Sex zum Flug gebaut werden.

Die Schwebeplattform besteht aus einem Rahmen, der so konzipiert ist, dass ein Anbindemechanismus ausbalanciert ist. Die frei schwebende Levitation lässt den Rahmen und damit das Insekt zu ya. Während der Tests ohne Einschränkungen durch Anbindedrähte kann der Rahmen mit einer Fused Deposition Modeling-Maschine schnell prototypisiert werden.

Dieser magnetbeladene Rahmen wird durch eine Reihe von Elektromagneten in der Basisplattform schwebend gehalten. Diese schwebende Plattform befindet sich im Inneren der LED-Arena, die aus 60 Paneelen besteht, die aus einem Array von fünf mal sieben einzelnen LEDs bestehen. Die Arena wird von einem Mikrocontroller APIC 18 F 45 20 gesteuert, der die Simulation sowohl der Drehung im Uhrzeigersinn als auch gegen den Uhrzeigersinn sowie die Steuerung der Drehzahl ermöglicht.

Richten Sie das drahtlose TBSI-Aufzeichnungssystem ein. Durch Verbinden des TBSI-Kopftisches mit dem Adapterplatinenstecker auf der Schwebeplattform. Entfernen Sie das Insekt aus dem Käfig, wenn es aktiv ist, vorzugsweise während der Morgendämmerung.

Mit einer Pinzette. Führen Sie die Elektrodenplatine vorsichtig in den flachen, flexiblen Kabelaufnehmer am Schweberahmen ein, so dass das Insekt fest in der Einrichtung hängt. Platzieren Sie den Magnetstab in der Nähe des Magnetschalters auf dem Kopftisch, um die drahtlose Datenübertragung zu aktivieren.

Ein blaues Licht leuchtet auf und zeigt an, dass die Kopfbühne aktiv und bereit für die Aufnahme ist. Schalten Sie das Licht im Raum aus, um vollständige Dunkelheit zu erhalten, und öffnen Sie die TBSI Neuro Aware-Software auf einem Computer. Sie können eine rote Lampe verwenden, um dem Raum zusätzliche Beleuchtung hinzuzufügen.

Wählen Sie die entsprechende Konfigurationsdatei aus. Bei den Konfigurationsdateien, die in diesem Verfahren verwendet werden, handelt es sich um die Standardeinstellung W fünf. Klicken Sie dann auf die Schaltfläche "Startdeck" in der oberen linken Ecke der Benutzeroberfläche.

Um mit der Anzeige von Signalen zu beginnen, wählen Sie die Registerkarte "Alle Kanäle" für die Beobachtung von EMG-Signalen auf dem TBSI-Aufzeichnungssystem. Um eine zuverlässige drahtlose Verbindung und einen zuverlässigen Elektrodenbetrieb zu gewährleisten, schalten Sie alle Komponenten der LED-Arena, die geregelte Gleichstromversorgung und den Mikrocontroller ein. Balanciere die Schwebeplattform langsam in der Arena aus.

Wählen Sie die Registerkarte Datensatz in Binärdatei im linken Bereich der nor aware-Oberfläche aus. Legen Sie die Aufnahmezeit und den Speicherort der Datei fest. Wählen Sie die entsprechenden Ausgabeeinstellungen aus, um Ihre Daten zu speichern.

Klicken Sie auf die Schaltfläche Start, um eine Aufnahmesitzung in der TBSI-Aufnahmesoftware zu starten. Dadurch wird Ihre Datei als nächste Datei gespeichert, die in gängige Datenverarbeitungsprogramme importiert werden kann.

Beobachten Sie, wie das Insekt in die Richtung fliegt, die der Bewegung der LEDs entspricht. Kehren Sie die Richtung der LEDs um und vergewissern Sie sich, dass das Insekt die Richtung umkehrt. Führen Sie dies so oft wie gewünscht aus. Der abgebildete Pfeil zeigt die Drehrichtung des LED-Musters an.

Der Pfeil wird gelb. Wenn das Insekt eine Drehung gegen den Uhrzeigersinn macht, wird der Pfeil blau, wenn das Insekt eine Drehung im Uhrzeigersinn vollzieht. Die gezeigte Filmwiedergabe ist 50 % schneller als normal.

Diese Abbildung zeigt das Muskelpotentialsignal, das von der drahtlosen Instrumentierung für einen Muskel vor und während des Flügelschlags in der Ruhephase erfasst wurde. Es werden keine Muskelpotentiale beobachtet. Die Muskelpotentiale beim Flügelschlag treten bei etwa 15 bis 20 Hertz auf.

Hier haben wir gerade eine einkanalige Aufnahme gezeigt. Eine Mehrkanalaufnahme, die mit diesem Setup aufgenommen wurde, kann jedoch verwendet werden, um die Koordination zwischen mehreren Muskelgruppen während der Flugmanöver zu beobachten. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie eine frühe Elektrodeneinführung im metamorphen Stadium in einen Mann von Geschlecht zu Puppe durchführen.

Es ist wichtig, das Einsetzen im späten Pupillenstadium so zu planen, dass das Einsetzen nicht zu früh oder zu spät im Pupillenstadium erfolgt. Andernfalls könnten Sie Schwierigkeiten haben, ein zuverlässiges Elektroden-Setup zu erhalten. Wir haben Ihnen auch gezeigt, wie Sie elektrische Komponenten zusammenbauen, die für die drahtlose Aufzeichnung von EMG-Daten von indirekten Flugmuskeln erforderlich sind, während das Insekt in der LED-Arena schwebt.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.