V3 Stain-free Workflow für eine praktische, bequeme und zuverlässige Total Protein Loading Control in Western Blotting

BioRad V three Workflow bietet Forschern eine zuverlässigere Quantifizierung und Vertrauen in den Western-Blotting-Prozess. Dies wird erreicht, indem zunächst TGX stain free Gele zur Trennung und Visualisierung von Proteinproben verwendet werden. Nach der Trennung werden die Proteine mit dem Blot-Turbo-Schnelltransfersystem auf eine Membran übertragen, das eine Überprüfung der Transferqualität und -effizienz ermöglicht.

Nach der Verifizierung des Transfers wird die Membran blockiert und mit primären und sekundären Antikörpern für die Zielproteine untersucht. Schließlich werden die Zielproteinspiegel unter Verwendung der fleckenfreien Gesamtproteinmessung als Belastungskontrolle normalisiert. Der V three-Workflow bringt Komfort und Transparenz in den Western-Blotting-Prozess und gibt den Forschern bei jedem Schritt von der Trennung über den Transfer bis hin zur Quantifizierung Sicherheit.

Der Hauptvorteil des V three Western-Workflows gegenüber herkömmlichem Western Blotting besteht darin, dass die stain-free-Technologie eine praktische, bequeme und zuverlässige Kontrolle der Gesamtproteinbeladung für die Normalisierung Ihrer Zielproteinsignale bietet. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Zusammenhang mit der Zuverlässigkeit von Belastungskontrollmethoden für die Western-Blotting-Technik zu beantworten, die die Übersättigung der Signale von Haushaltsproteinen und die unterschiedlichen Expressionsniveaus von Haushaltsproteinen unter verschiedenen experimentellen Bedingungen beinhalten. Wir entdeckten, dass Proteine, die in fleckenfreien Gelen aktiviert wurden, auch ohne weitere Färbung auf blos sichtbar gemacht werden konnten, so dass sie als Alternative zu herkömmlichen Gesamtproteinfärbungen sowie als Kontrolle der Proteinbeladung im Haushalt verwendet werden konnten.

In den nächsten Minuten werden wir den kompletten V three Workflow mittels Multiplex-Fluoreszenz demonstrieren. Das gleiche Verfahren kann auch für die Chemilumineszenz nach der Aufbereitung von Proteinproben gemäß dem Textprotokoll angewendet werden. Entfernen Sie mit einem fleckenfreien KD-Fertiggel von Criterion TGX den Kamm und das Klebeband von der Unterseite der Kassette.

Setzen Sie die Kassette in das Gelgerät ein und füllen Sie beide Behälter mit Laufpuffern. Laden Sie die Proteinstandards und Proben. Lassen Sie das Gel dann 20 Minuten lang bei 300 Volt laufen.

Nachdem die Elektrophorese abgeschlossen ist, verwenden Sie das Öffnungswerkzeug für die Gelkassette auf dem Criterion Cell-Deckel, um die Kassette zu öffnen. Tragen Sie dann einige Milliliter Wasser auf den UV-Transluminator des Chemi Dock MP Imagers auf. Heben Sie das Gel vorsichtig aus der Kassette und legen Sie es auf die UV Trans Illuminator Launch Image Lab-Software und richten Sie ein neues Einkanalprotokoll für fleckenfreie Gele mit der standardmäßigen Gelaktivierungszeit von einer Minute ein. Wählen Sie den geeigneten Geltyp und die standardmäßige automatische Optimierung für intensive Banden.

Klicken Sie dann auf Protokoll ausführen. Sobald die Bildaufnahme abgeschlossen ist, visualisieren Sie die Trennung und die Probenqualität. Fahren Sie dann sofort mit dem Übertragungsschritt fort.

Um den Proteintransfer durchzuführen, öffnen Sie ein trans block turbo MIDI PVDF Transfer Pack. Platzieren Sie den unteren Stapel in der Mitte des Kassettenbodens. Entfernen Sie das Gel aus dem Imager.

Richten Sie das Gel auf der Membran aus. Verwenden Sie vorsichtig den Tupfroller, um Luftblasen zwischen dem Gel und der Membran zu entfernen. Richten Sie als Nächstes den oberen Stapel auf dem Gel aus.

Nachdem Sie alle Luftblasen entfernt haben, setzen Sie den Kassettendeckel auf die Basis. Drücken Sie den Deckel fest nach unten, drehen Sie das Zifferblatt zum Verriegeln im Uhrzeigersinn und setzen Sie die Kassette in einen der beiden Löschpapierschächte ein. Wählen Sie auf dem Startbildschirm das Turbo-Protokoll aus.

Wählen Sie die beiden Mini- oder ein Mini-Gel aus und drücken Sie die Run-Taste für den entsprechenden Schacht. Die Überweisung ist in sieben Minuten abgeschlossen. Nehmen Sie die Kassette aus dem Schacht.

Entriegeln Sie die Kassette und zerlegen Sie das Blotting-Sandwich. Legen Sie das Post-Transfer-Gel auf den UV-Transluminator des Chemi dock MP Imagers und legen Sie die Membran sofort in deionisiertes Wasser. Richten Sie ein neues Einkanalprotokoll für fleckenfreie Gele ohne Aktivierungszeit ein.

Wählen Sie den entsprechenden Geltyp aus, stellen Sie die Belichtungszeit manuell auf die des Vortransfergels ein und klicken Sie auf Protokoll ausführen. Sobald die Bilderfassung abgeschlossen ist. Überprüfen Sie die Übertragungseffizienz, indem Sie die Intensitäten der Probenbanden zwischen den Gelen vor und nach dem Transfer vergleichen.

Nehmen Sie das Gel aus der Probenschale, da es nicht mehr benötigt wird, und entsorgen Sie es. Zur Überprüfung auf den Blot übertragen. Platzieren Sie die Membran auf dem Probentablett und richten Sie ein neues Einkanalprotokoll ein.

Für fleckenfreien Blot. Wählen Sie den geeigneten Geltyp und die standardmäßige automatische Optimierung für intensive Banden aus. Klicken Sie dann auf Protokoll ausführen.

Sobald die Bildaufnahme abgeschlossen ist, überprüfen Sie die Übertragung auf die Membran. Entfernen Sie die Blot-Membran vom UV-Trans-Illuminator und legen Sie sie in einen Blocking-Puffer für Western Blotting. Nachdem Sie die Membran eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert haben, inkubieren Sie sie am nächsten Tag über Nacht bei vier Grad Celsius mit Maus- und Kaninchen-Primärantikörpern.

Gießen Sie die Antikörperlösung aus und verwenden Sie 50 Milliliter TBST, um den Blot fünf Minuten lang zu waschen. Inkubieren Sie den Blot mit fluoreszierenden konjugierten, anti-muse- und anti-kaninchen-Sekundärantikörpern eine Stunde lang bei Raumtemperatur. Waschen Sie den Tupfer dann mit TBST fünfmal für jeweils fünf Minuten.

Um den Blot abzubilden, legen Sie ihn auf den UV-Trans-Illuminator des Chemi doc MP Imagers in der Image Lab-Software. Richten Sie ein neues Multi-Channel-Protokoll ein. Konfigurieren Sie Kanal eins, indem Sie dite six 50 under Blot-Anwendungen auswählen und die standardmäßige automatische Optimierung für intensive Bänder verwenden.

Wiederholen Sie diese Schritte, um die Kanäle zwei und drei für DITE 5, 49 bzw. stain free blot zu konfigurieren. Wählen Sie den entsprechenden Geltyp aus und klicken Sie auf Protokoll ausführen. Um Lanes zu definieren, wählen Sie die Flecken-Free-Blot-Bildspur und die Bänder aus.

Dann automatischer Spurfinder für genaue Quantifizierung. Stellen Sie sicher, dass die Hintergrundprofile in jeder Probenspur ähnlich sind, indem Sie die Größe der Rollscheibe auf 70 einstellen. Bestätigen Sie die Gleichmäßigkeit des Hintergrunds, indem Sie alle Spurprofile durchsuchen, um Bänder sowohl in den dite six 50- als auch in den 5-49-Kanälen zu definieren.

Verwenden Sie das Bandfinder-Tool, um Bänder mit den Standardempfindlichkeitseinstellungen zu erkennen. Um den Normalisierungskanal festzulegen, kehren Sie zur Analyse-Toolbox zurück. Klicken Sie auf Normalisierung und wählen Sie stain free blot, wobei Sie sicherstellen, dass das gesamte Lane-Protein ausgewählt ist.

Um die Standard-Lanes mit Molekulargewicht der Toolbox wieder zuzuweisen, klicken Sie auf MW-Analysewerkzeuge, und aktivieren Sie das Kontrollkästchen unter der entsprechenden Lane. Um schließlich die normalisierten Proteinbandenintensitäten anzuzeigen, klicken Sie auf die Analysetabelle in der Symbolleiste. Die Software generiert automatisch eine Tabelle, die Volumenintensitäten, Normalisierungsfaktoren und normalisierte Volumina enthält.

Die normalisierten Volumina sollten für die Datenanalyse und Berichterstellung verwendet werden. Die Tabelle kann exportiert werden. Für die weitere Analyse haben wir den kompletten V three Western Blotting-Workflow demonstriert.

Nun zeigen wir Ihnen repräsentative Ergebnisse aus einem echten Experiment. Lysate von Kontroll- und bestrahlten Lymphoblast-Zellkulturen wurden mit dem V drei Western Blot-Workflow analysiert. Das färbefreie Gesamtproteinsignal erscheint in blau.

Das Zielprotein M CM seven ist rot dargestellt, und die validierte Housekeeping-Protein-Loading-Kontrolle GA DH ist grün dargestellt. GA DH wurde als geeignete Belastungskontrolle validiert, indem seine Linearität unter den in diesem Video beschriebenen experimentellen Bedingungen bewertet wurde. Die färbungsfreien Gesamtproteinsignale für jede Spur auf dem Blot wurden mit Hilfe von Bildlaborsoftware gemessen.

Die Signalintensitäten von MCM sieben wurden sowohl unter Verwendung des Gesamtprotein- als auch des GA-DH-Signals normalisiert. MCM mit sieben Proteinbandenvolumina, die mit beiden Methoden normiert wurden, zeigten vor der genauen Normalisierung eine um 25 % verringerte Expression in bestrahlten Proben im Vergleich zu Kontrollproben. Das Housekeeping-Protein muss validiert werden, um seinen linearen Bereich und seine konsistenten Expressionsniveaus zwischen den Proben ohne Validierung zu bestätigen.

Die Kontrollen der Proteinbeladung im Housekeeping garantieren keine genaue Normalisierung. Im Gegensatz dazu ist für die Normalisierung des Gesamtproteins keine Validierung erforderlich. Somit bietet das färbungsfreie Gesamtproteinsignal, das durch den V 3-Workflow erhalten wird, eine praktische, bequeme und zuverlässigere Ladekontrolle beim Versuch dieses Verfahrens.

Denken Sie daran, dass die stain-free-Technologie die fluoreszierende Visualisierung von Proteinproben durch eine UV-induzierte kovalente Modifikation verfügbarer Tryptophan-Rückstände ermöglicht. Nur in seltenen Fällen hat diese Modifikation signifikante Auswirkungen auf nachgelagerte Anwendungen wie die Immundetektion oder die Massenspektrometrie. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie den V drei Western-Workflow durchführen und die färbefreie Gesamtproteinnormalisierung

Obwohl wir diesen Arbeitsablauf für Multiplex-Fluoreszenz-Western-Blots demonstriert haben, kann die stain-free-Technologie auch für die vollständige Proteinnormalisierung mit lumineszierenden Western-Blots verwendet werden.