Name: V3 Stain-free Workflow für eine praktische, bequeme und zuverlässige Total Protein Loading Control in Western Blotting (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-30T20:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 33 s
Description: Lernen Sie den V3-Workflow für Western Blotting mit TGX-Stain-free-Gelen zur zuverlässigen Totalprotein-Normalisierung. Diese Methode ermöglicht präzise Proteinquantifizierung ohne Übersättigung von Housekeeping-Proteinen.

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Die Autoren danken Dr. Wolf-Dieter Stalz, Dr. Arnaud Remy, Dr. Anton Posch, Dr. Patricia Piatti, Tom Davies, Kris Simonyi und Jeff Durban für ihre kritische Rezension und Bearbeitung dieses Manuskripts. Die Autoren danken auch Allison Schwartz für die technische Unterstützung.

1. Protein-Probenvorbereitung
(Ein typisches Verfahren zur Extraktion von Proteinen aus der Zellkultur wird beschrieben)
<ol><li>Legen Sie die HeLa-Zellkulturschale in Eis und waschen Sie die Zellen mit eiskalter Tris-gepufferter Saline (TBS; 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl).</li>
	<li>Aspirieren Sie das TBS, dann fügen Sie 1 ml pro 100 mm Schale eiskalten RIPA Puffer (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,5% Natriumdeoxycholat, 0,1% SDS) ergänzt mit Phosphatase und Protease-Inhibitoren.</li>
	<li>Kratzen Haften zellen aus der Schale mit einem kalten Kunststoff-Zell-Schaber; die Zellsuspension vorsichtig in ein vorgekühltes Mikrozentrifugenrohr übertragen.</li>
	<li>Halten Sie konstante Sergung für 30 min bei 4 °C auf einem Rotator.</li>
	<li>Drehen Sie bei 16.000 x g für 20 min in einer vorgekühlten Zentrifuge von 4 °C.</li>
	<li>Entfernen Sie das Rohr vorsichtig von der Zentrifuge und legen Sie es auf Eis. Den Überstand auf ein frisches Rohr auf Eis geben und das Pellet entsorgen.</li>
	<li>Entfernen Sie ein kleines Volumen (10-20 l) Lysat, um einen Proteintest durchzuführen. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration für jede Probe mit dem RC DC Assay Kit.</li>
	<li>Bei Bedarf die Proteinproben für die Langzeitlagerung bei -20 °C aliquotieren. Wiederholte Gefrier- und Tauwetterzyklen verursachen Proteinabbau und sollten vermieden werden.</li>
	<li>Nehmen Sie ca. 20 g jeder Probe, fügen Sie ein gleiches Volumen von 2x Laemmli Probenpuffer (4% SDS, 10% 2-Mercaptoethanol, 20% Glycerin, 0,004% Bromphenolblau, 125 mM Tris-HCl, pH 6,8).</li>
	<li>Erhitzen Sie jede Zelle im Probenpuffer bei 95 °C für 5 min.</li>
	<li>Zentrifuge bei 16.000 x g in einer Mikrozentrifuge für 1 min.</li>
</ol>2. Gelelektrophorese mit fleckenfreien Gelen (ca. 30 min)
<ol><li>Nehmen Sie ein Criterion TGX Any KD fleckenfreies Precast-Gel (ein Midi-Format-Gel), entfernen Sie den Kamm und das Band von der Unterseite der Kassette.</li>
	<li>Legen Sie die Kassette in die Criterion-Zelle und füllen Sie die integrierte obere Pufferkammer mit 60 ml Laufpuffer (25 mM Tris, 190 mM Glycin, 0,1% SDS, pH 8,3). Spülen Sie die Brunnen mit dem laufenden Puffer.</li>
	<li>Füllen Sie jede Hälfte des unteren Puffertanks mit 400 ml Laufpuffer auf die markierte Fülllinie.</li>
	<li>Laden Sie die Proteinproben und die entsprechenden Proteinmarker.</li>
	<li>Legen Sie den Deckel auf den Tank und richten Sie die farbcodierten Bananenstecker mit entsprechenden Buchsen auf den Deckel aus.</li>
	<li>Führen Sie das Gel für 30 min bei 200 V oder 20 min bei 300 V.</li>
</ol>3. Fleckenfreie Gel-Bildgebung mit dem Chemidoc MP-System zur Überprüfung der Proteintrennungsqualität (ca. 5 min)
<ol><li>Entfernen Sie die Gelkassette aus der Zelle. Verwenden Sie das Öffnungswerkzeug der Gelkassette im Criterion Cell Deckel, um die Kassette zu öffnen und das Gel loszulassen.</li>
	<li>Tragen Sie ein paar Milliliter Wasser auf die Mitte des UV-Probenfachs des ChemiDoc MP-Imagers auf. Heben Sie das Gel vorsichtig aus der Kassette und legen Sie es auf das Fach.</li>
	<li>Starten Sie die Image Lab-Software und erfassen Sie das fleckenfreie Gelbild (Abbildung 1A) mit den folgenden Einstellungen: Anwendung: fleckenfreies Gel Gelaktivierungszeit: 1 min Bildgebungsbereich: Kriterium Gel Bildbelichtungszeit: automatisch optimiert für die intensivsten Bänder</li>
	<li>Entfernen Sie das Gel aus dem Probenfach und fahren Sie sofort mit dem Übertragungsschritt fort.</li>
</ol>4. Proteintransfer mit dem Trans-Blot Turbo System (ca. 10 min)
<ol><li>Öffnen Sie ein Trans-Blot Turbo Midi PVDF Transfer Pack; legen Sie den unteren Stapel (einschließlich der Membran) auf die Basis der Transferkassette.</li>
	<li>Legen Sie das Gel auf die Membran, legen Sie den oberen Stapel auf das Gel und rollen Sie Blasen aus.</li>
	<li>Legen Sie den Deckel auf die Kassettenbasis und drehen Sie das Zifferblatt, um es zu verriegeln.</li>
	<li>Legen Sie die Kassette in den Blotterschacht ein.</li>
	<li>Starten Sie die Übertragung, indem Sie ein voreingestelltes Turbo-Programm auswählen und die Criterion-Gelgröße (midi) auswählen, und drücken Sie dann RUN. Ein typischer Lauf dauert nur 7 min.</li>
	<li>Wenn der Transfer vorbei ist, zerlegen Sie das Fleck-Sandwich und legen Sie sowohl den Fleck als auch das Gel in einen Behälter mit entionisiertem Wasser.</li>
</ol>5. Fleckenfreie Gel- und Blot-Bildgebung mit dem Chemidoc MP-System zur Überprüfung der Proteintransfer-Effizienz und -Qualität (ca. 5 min)
<ol><li>Legen Sie das Post-Transfer-Gel auf das Probenfach des ChemiDoc MP-Imagers.</li>
	<li>Starten Sie die Image Lab-Software und erfassen Sie das fleckenfreie Bild des Post-Transfer-Gels (Abbildung 1B) mit den folgenden Einstellungen: Anwendung: fleckenfreies Gel Gelaktivierungszeit: keine Bildgebungsbereich: Kriterium Gel Bildbelichtungszeit: gleiche Belichtungszeit für das Pretransfer-Gelbild</li>
	<li>Entfernen Sie das Gel aus dem Probenfach, und stellen Sie dann den Blot (Abbildung 1C) mit den folgenden Einstellungen ab. Halten Sie den Fleck nass mit ein paar Tropfen Wasser oder TBST bei der Bildgebung. Anwendung: stain-free blot Bildgebungsbereich: Kriterium Gel Bildbelichtungszeit: automatisch optimiert für die intensivsten Bänder</li>
	<li>Entfernen Sie die Blotungsmembran aus der Probenschale und legen Sie sie in einen Behälter mit TBST (0,1% Tween 20 in TBS).</li>
</ol>6. Antikörper-Inkubation
<ol><li>Blockieren Sie, indem Sie den Fleck in einer Lösung von 3% Rinderserumalbumin (BSA) in TBST bei Raumtemperatur für 1 Stunde platzieren.</li>
	<li>Inkubieren Sie den Blot über Nacht bei 4 °C in der Lösung, die mausprimärer Antikörper enthält, der gegen das erste Zielprotein und den Kaninchen-Primärantikörper aufgebracht wird, der gegen das zweite Zielprotein aufgebracht wird.</li>
	<li>Gießen Sie die Lösung, die den primären Antikörper enthält. Als nächstes waschen Sie den Fleck, indem Sie in 20 ml TBST für 5 min. Wiederholen Sie 4x für insgesamt 5 Wähbe.</li>
	<li>Inkubieren Sie für 1 Stunde bei Raumtemperatur in der sekundären Antikörperlösung, die einen konjugierten Goat-Anti-Maus-Antikörper Dylight 650 und einen Dylight 549 konjugierten Ziegen-Anti-Kaninchen-Antikörper enthält.</li>
	<li>Gießen Sie die Lösung, die den primären Antikörper enthält. Als nächstes waschen Sie den Fleck, indem Sie in 20 ml TBST für 5 min. Wiederholen Sie 4x für insgesamt 5 Wähbe.</li>
</ol>7. Bildgebung und Datenanalyse durch Image Lab Software - TotalE Proteinnormalisierung (ca. 5 min)
<ol><li>Erfassen Sie ein Multiplex-Fluoreszenzbild des Blots (Abbildung 1E), indem Sie ein neues Mehrkanalprotokoll öffnen, drei fluoreszierende Kanäle konfigurieren und das Protokoll ausführen. Kanal 1: Bewerbung blot Dylight 650 Bildgebungsbereich: Kriterium Gel Bildbelichtungszeit: automatisch optimiert für die intensivsten Bänder Kanal 2: Bewerbung blot Dylight 549 Bildgebungsbereich: Kriterium Gel Bildbelichtungszeit: automatisch optimiert für die intensivsten Bänder Kanal 3: Anwendung: stain-free blot Bildgebungsbereich: Kriterium Gel Bildbelichtungszeit: automatisch optimiert für die intensivsten Bänder</li>
	<li>Klicken Sie in der Analyse-Toolbox auf das Symbol Normalisierung, und klicken Sie auf Ja, um Spuren und Bänder zu erkennen.</li>
	<li>Wählen Sie "Lanes and Bands tools" aus, und verwenden Sie sie, um bei Bedarf Anpassungen an den Fahrspuren und Bändern vorzunehmen.</li>
	<li>Wählen Sie das fleckenfreie Bild als Normalisierungskanal aus.</li>
	<li>Wählen Sie MW-Analysewerkzeuge aus, und weisen Sie die MW-Standardspuren zu, indem Sie die entsprechenden Kästchen aktivieren.</li>
	<li>Um die normalisierten Volumes anzuzeigen, klicken Sie auf der Symbolleiste auf die Analysetabelle. Alle Berechnungen werden automatisch von der Software durchgeführt, einschließlich des Normalisierungsfaktors und der normalisierten Volumes. Die Intensitätswerte des Zielproteinsband werden nun um die Variation der Proteinlast angepasst. Dies ermöglicht genaue Vergleiche von Zielproteinen zwischen den Proben.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren Anton Posch, Jonathan Kohn, Kenneth Oh, Matt Hammond und Ning Liu sind Mitarbeiter von Bio-Rad Laboratories, Inc.

Das oben beschriebene V3-Buntfreie Protokoll ist für das Multiplexieren von fluoreszierendem Western-Blotting. Es kann auch in westlichen Blotting mit chemiluminescent Detektion angewendet werden. Im Multiplex-Fluoreszenz-Western-Blot-Protokoll werden die fleckenfreien Blot-Bilder an zwei Zeitpunkten aufgenommen: 1) direkt nach dem Proteintransfer; 2) bei der Multiplex-Fluoreszenz-Bildgebung nach der Antikörperinkubation. Das erste fleckenfreie Bild wird verwendet, um die Übertragungseffizienz zu berechnen und das zweite fleckenfreie Bild wird als Ladesteuerung verwendet. Wenn die chemilumineszierende Methode angewendet wird, ist es nicht möglich, ein Multiplexbild für die fleckenfreien und Zielproteinsignale zu nehmen, da das chemilumineszierende Signal auch im fleckenfreien Kanal angezeigt wird. In diesem Fall empfehlen wir, das fleckenfreie Bild, das direkt nach dem Proteintransferschritt aufgenommen wurde, zur Belastungskontrolle und Normalisierungsanalyse zu verwenden.
Der V3-Western-Workflow bietet die folgenden einzigartigen Vorteile im Vergleich zum herkömmlichen Western-Blot-Workflow, der Housekeeping-Proteine als Ladesteuerung verwendet:
Erstens bietet der V3-Workflow eine praktische, komfortable und zuverlässigere Ladekontrolle, um die Veränderungen im Niveau des Proteins von Interesse zu validieren. Das V3-Protokoll verwendet eine Total-Protein-Ladekontrolle, um den Interessenkonfliktin in jeder Probe zu normalisieren. Es vermeidet zwei Fallstricke bei der Verwendung der Haushaltsproteine als Ladekontrolle: gesättigte Immunerkennung und inkonsistente Housekeeping-Proteinexpressionsniveaus unter den Proben unter bestimmten experimentellen Bedingungen. Stripping und Reprobing Schritte mit Antikörpern gegen die Hauswirtschaft sind nicht mehr notwendig. Mit der fleckenfreien Technologie ist es nicht notwendig, einen Fleck mit Flecken wie Coomassie oder Sypro Ruby für die gesamte Proteinmessung zu färben und zu entfärben. Es dauert nur ein paar Sekunden, um ein Blot-Bild zu erfassen und etwa 5 min, um die totale Proteinnormalisierung mit Image Lab Software zu tun.
Zweitens ermöglicht der V3-Workflow Wissenschaftlern eine bessere Kontrolle über das westliche Verfahren, da er das Verfahren transparenter macht und mehrere Kontrollpunkte für die Qualitätskontrolle einführt. Mit Hilfe der fleckenfreien Technologie können Forscher ihre Proteinproben sowohl auf dem Gel als auch auf dem Fleck visualisieren. Wissenschaftler können die Proteinprobenintegrität (degradiert oder nicht), die Trennungsqualität (gefällt oder nicht), die Übertragungseffizienz und die Übertragungsqualität (auch Transfer oder nicht) bewerten. Diese Checkpoints helfen Den Forschungen, das Experiment zu beenden, wenn große Fehler im Prozess zu sehen und vermeiden, Zeit für schlechte Proben und Flecken zu verschwenden. Diese Technologie hilft Wissenschaftlern auch zu beurteilen, ob es eine signifikante Menge an Proteinverlust nach dem Entfernen der Membran gibt und ob der Fleck für das Reprobing eines anderen Ziels 4geeignet ist.
Hier sind ein paar Tipps, um eine gute Erfahrung und Qualität der Daten mit V3 Western Workflow zu gewährleisten.
<ol><li>Stellen Sie das Gel unmittelbar nach dem Gellauf ab. Das Gel vor der ersten Bildgebung im Verfahren nicht in einen Puffer einweichen, da es die Fleckenverbindung wegwaschen kann.</li>
	<li>Verwenden Sie denselben Bildbereich, um alle Bilder im Protokoll zu erfassen. Dies ermöglicht es der Software, Bilder für die Datenanalyse wie die totale Proteinnormalisierung zu überlagern.</li>
	<li>Halten Sie die Belichtungszeit konsistent, wenn Sie die Vortransfer- und Post-Transfer-Gele abbilden. Auf diese Weise kann die Software die Übertragungseffizienz quantitativ messen.</li>
	<li>Halten Sie die Membran mit ein paar Tropfen Wasser oder TBST nass, wenn Sie das Blot-Bild erfassen. Dadurch werden mögliche schmutzige Hintergrundprobleme für die Zielproteinerkennung vermieden.</li>
	<li>Verwenden Sie eine fluoreszierende PVDF-Membran mit niedrigem Fluoreszenz für multipleszierendes Fluoreszenz-Western-Blotting.</li>
</ol>Es ist wichtig zu beachten, dass das fleckenfreie Molekül nach UV-Aktivierung irreversibel an Tryptophan-Rückstände gebunden ist. Diese irreversible Modifikation kann sich möglicherweise auf die Antigenerkennung bei der Verwendung monoklonaler Antikörper auswirken, wenn das Epitop Tryptophan enthält. Polyklonale Antikörper sind unwahrscheinlich, da sie mehrere Epitope auf dem Antigen erkennen. Ungebundene fleckenfreie Moleküle lassen sich leicht vom Gel und der Membran abwaschen und stören daher nicht die Wechselwirkungen zwischen Antikörpern und Antigen.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der V3-Western-Workflow den Western Blot-Prozess schneller, transparenter, quantitativer und zuverlässiger macht. Forscher können nun leicht die totale Proteinbelastungskontrolle in einem westlichen Blot-Experiment anwenden, um ihre Daten vertrauenswürdiger zu machen. Der V3-Workflow wurde von einer Reihe von Labors übernommen, und ihre Veröffentlichungen haben gezeigt, dass Zeitschriften fleckenfreie Daten als Ladekontrolle im westlichen Blot22,17,7,8,5,23,18,15akzeptieren.

Western Blot ist eine sehr nützliche Technik9, aber es gibt zwei große Herausforderungen mit westlichen Blotting: langen und arbeitsintensiven Prozess und Qualität der Daten. Ein traditionelles Protokoll benötigt ca. 2 Tage. Es umfasst viele Schritte, einschließlich Probenvorbereitung, Gelguss, Proteinelektrophorese und Transfer, Membranblockierung gefolgt von Antikörper-Inkubation, Bildgebung, und ziemlich oft, Reprobing, und schließlich Datenanalyse. Während dieses gesamten Prozesses gibt es keine zuverlässigen und flexiblen Werkzeuge für die Prozesssteuerung. Daher können bei jedem Schritt Fehler auftreten, und diese Fehler haben das Potenzial, Datenartefakte zu generieren. Daher sind Ladekontrollen im westlichen Blotting unerlässlich, um die Fehler zu identifizieren und zu korrigieren. Die Belastungskontrolle erfolgt in der Regel durch Überprüfung des Proteinspiegels eines Referenzproteins in jeder Probe, um festzustellen, ob es gleich dargestellt wird. Menschen verwenden oft Housekeeping-Proteine, wie z. B. β-Actin, β-tubulin, GAPDH, als Ladekontrolle.
Die Qualität der westlichen Blot-Daten hängt von einer zuverlässigen Ladekontrolle ab. Bei der Verwendung von Haushaltsproteinen für Dieladekontrollen bestehen jedoch zwei berechtigte Bedenken: 1) die Antikörper-basierte Immundetektion der Housekeeping-Proteinbänder ist oft gesättigt, so dass man die Belastungsunterschiede zwischen den Proben30nicht unterscheiden kann; 2) der Gehalt an Proteinexpression kann in den Proben unter bestimmten experimentellen Bedingungen variieren, z. B. siRNA-Behandlung, Zelltod, Zelldifferenzierung, etc.11,28,3,6,10,21. Aufgrund dieser Bedenken verlangen wissenschaftliche Fachzeitschriften nun, dass "für quantitative Vergleiche geeignete Reagenzien, Steuerungen und bildgebende Verfahren mit linearen Signalbereichen verwendet werden sollten" (Naturrichtlinie). In ähnlicher Weise fordern Redakteure des Journal of Clinical Investigation zuverlässigere Ladekontrollen24. Aus diesen Gründen muss ein Housekeeping-Protein validiert werden, um als Ladekontrolle verwendet zu werden. Zunächst muss man sicherstellen, dass es im linearen Dynamikbereich der Immundetektionsmethode14,29gemessen wird. Zweitens muss man sicherstellen, dass es konsequent in allen Proben26,31,25,19,20ausgedrückt wird.
Eine alternative Lösung für eine zuverlässige Belastungskontrolle ist die Verwendung der Gesamtproteinmessung aus dem Fleck. Einige Forscher haben die Flecken mit totalen Proteinflecken wie Coomassie, Flamingo Pink, Sypro Ruby, Amido Black, Ponceau S und fleckenfreie Technologie gefleckt, um das gesamte Proteinsignal in jeder Spur als Ladekontrolle16,20,13,27,1,4,12zu messen. Die gesamte Proteinbelastungskontrolle vermeidet die Fallstricke, die mit Housekeeping-Proteinen verbunden sind. Erstens ist es eine wahre Reflektion der Menge an Protein für jede Probe geladen. Zweitens weist der Gesamtproteinfleck einen hervorragenden linearen Dynamikbereich im gemeinsamen Belastungsbereich für die Western-Blot-Analyse auf (10-50 g Protein eines komplexen Zelllysats) und unterscheidet den Belastungsunterschied zwischen den Probengenau 12.
Die fleckenfreie Technologie ist eine neuartige Gesamtprotein-Färbungsmethode, bei der eine einzigartige Verbindung in Acrylamid-Gel-Lösung gemischt und gleichmäßig im gegossenen Gel verteilt wird. Nach Abschluss der Elektrophorese wird das Gel mindestens 1 min UV-Licht ausgesetzt, so dass die Fleckenverbindung mit den Tryptophan-Rückständen im Protein reagiert. Die Proteine werden unter UV-Licht erregbar, um ein starkes fluoreszierendes Signal zu geben, das in einem fleckenfreien, aktivierten Imager wie dem ChemiDoc MP-System visualisiert und quantifiziert werden kann. Die fleckenfreie Verbindung selbst absorbiert jedoch kein UV-Licht, was zu einem niedrigen Hintergrund des Gelbildes führt. Die Modifikation der Tryptophan-Rückstände ist irreversibel und Proteine können nicht nur im Gel, sondern auch auf dem Fleck jederzeit nach dem Proteintransfer visualisiert werden.
Die fleckenfreie Technologie wird im V3 Western Workflow (Abbildung 1) eingesetzt, um die hauptbelangen Beschwerden über den traditionellen Workflow zu beheben, insbesondere die Bedenken bei der Verwendung von Haushaltsproteinen als Ladesteuerung. Mit diesem Workflow könnte man: 1) ein Gel in ca. 20-30 min, 2) überprüfen Probenintegrität und Proteintrennung Qualität in 5 min nach Gellauf; 3) Übertragen von Proteinen in 3-10 min; 4) die Übertragungseffizienz quantitativ zu überprüfen; und 5) am wichtigsten ist, Änderungen des Wertes des Proteins von Interesse mit der totalen Proteinbelastungskontrolle zu validieren.

<table><tr><tbody><td colspan="4">REAGENTS</strong</td></tr><tr><td>>4-20% Kriterium TGX Stain-Free Precast Gel</td><td>Bio-Rad</td><td>567-8093</td><td>Wählen Sie eine Gelgröße und einen Prozentsatz, die den spezifischen Anforderungen in einem Experiment entsprechen</td></tr><tr><td>Trans-Blot Turbo Midi PVDF Transfer Packs</td><td>Bio-Rad</td><td>170-4157</td><td>Wählen Sie entweder PVDF oder Nitrocellulose und passen Sie die Membrangröße an das Gel an size</td></tr><tr><td>Clarity Western ECL Substrat, 500 ml </td><td>Bio-Rad</td><td>170-5061<</td><td></td></tr><tr>td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>Criterion Cell </td><td>Bio-Rad</td><td>165-6100</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot Turbo Transfer Starter System </td><td>Bio-Rad</td><td>170-4155</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc MP System </td><td>Bio-Rad</td><td>170-8280</td><td></td></tr></tbody></table>

v3 stain-free workflow für eine praktische, bequeme und zuverlässige total protein loading control in western blotting

V3 Stain-free Workflow for a Practical, Convenient, and Reliable Total Protein Loading Control in Western Blotting

Der westliche Blot ist eine sehr nützliche und weit verbreitete Labortechnik, aber seine Ausführung ist eine Herausforderung. Der Workflow wird oft als "Black Box" charakterisiert, da ein Experimentalist nicht weiß, ob er bis zum letzten von mehreren Schritten erfolgreich ausgeführt wurde. Darüber hinaus wird die Qualität der westlichen Blot-Daten manchmal aufgrund des Mangels an effektiven Qualitätskontrollinstrumenten während des gesamten westlichen Blotting-Prozesses in Frage gestellt. Hier beschreiben wir den V3-Western-Workflow, der fleckenfreie Technologie anwendet, um die Hauptprobleme im Zusammenhang mit dem traditionellen Western Blot-Protokoll anzugehen. Dieser Workflow ermöglicht es Forschern: 1) ein Gel in etwa 20-30 min laufen; 2) die Qualität der Probentrennung innerhalb von 5 min nach dem Gellauf zu visualisieren; 3) Proteine in 3-10 min zu übertragen; 4) quantitativ die Übertragungseffizienz zu überprüfen; und vor allem 5) Veränderungen des Proteins von Interesse mit der totalen Proteinbelastungskontrolle zu validieren. Dieser neuartige Ansatz eliminiert die Notwendigkeit, den Blot für Haushaltsproteine wie β-Actin, β-Tubulin, GAPDH usw. zu entfernen und zu reprosieren. Der V3-Schmutz-Workflow macht den Western-Blot-Prozess schneller, transparenter, quantitativer und zuverlässiger.

1. Bewertung der Probenintegrität, Proteintrennungsqualität und Übertragungseffizienz mit fleckenfreien Gelbildern.
Proteinextrakt aus HeLa-Zellen wurde bei 300 V für 20 min auf einem 18-Well Criterion AnyKD TGX fleckenfreies Gel getrennt. Die Proteinproben wurden 3x in vier verschiedenen Mengen (Lanes 1-3, 40 g; Bahnen 4-6, 30 g; Bahnen 7-9, 20 g; Bahnen 10-12, 10 g). Das Gel wurde 1 min unter UV-Licht aktiviert. Abbildung 2A zeigt das gelbild, das direkt nach der Proteintrennung aufgenommen wurde. Mit diesem Gelbild können die Proteinprobenintegrität(z.B. Abbau) und die Trennqualität(z.B. Proteinfällung) visuell beurteilt werden. Proteine wurden dann 7 min lang mit Trans-Blot Turbo auf eine Nitrocellulosemembran übertragen. Abbildung 2B zeigt das fleckenfreie Bild des Post-Transfer-Gels. Beide Bilder wurden mit der gleichen Belichtungszeit (6,8 Sek.) aufgenommen. Lane 3 und 12 wurden ausgewählt, um die Übertragungseffizienz zu messen. Mit dem Volumenwerkzeug in der Image Lab-Software wurde eine rechteckige Box (blau) gezeichnet, um Spur 3 und 12 auf beiden Gelbildern abzudecken. Die Berechnung auf der Grundlage der Volumenwerte aus diesen Feldern ergab, dass die Übertragungseffizienz beider Fahrspuren 80 % betrug (Abbildung 2C). In diesem Experiment wurde das AnyKD TGX Gel ausgewählt, um kleine bis mittelgroße Zielproteine zu untersuchen, und es war nicht für den Transfer großer Proteine optimiert. Die Optimierung der Übertragungseffizienz würde die Verwendung von geläutes gel(z. B. 4-20%) erfordern. und/oder eine Anpassung der Transferzeit, um den Transfer großer Proteine zu erleichtern. 2. Die fleckenfreie Gesamt-Proteinbelastungskontrolle ist eine zuverlässige Alternative zur Haushaltsbeladungskontrolle im westlichen Blotting, um eine kleine Veränderung des Proteinanteils zu quantifizieren.
MCM-7 ist ein DNA-Lizenzierungsreplikationsfaktor, deren Niveau in Lymphoblastoid-Zelllinien (LCL) nach der Bestrahlungsbehandlung um 20-50% abnimmt. In diesem Experiment wurden Lysate (je 30 g) von vier kontroll- und bestrahlungsbehandelten Lymphoblastoid-Zelllinienkulturen (LCL) auf einem 12-Well-Kriterium AnyKD TGX-Flecken-freien Gel getrennt. Das Gel wurde 1 min unter UV-Licht aktiviert und von Trans-Blot Turbo zur Immunoblotting auf eine PVDF-Membran übertragen. Das Housekeeping-Protein GAPDH (grün) wurde mit einem Kaninchen-Antikörper (Cell Signaling Technology, USA, 1:2.500) und einem Dylight 549 konjugierten Ziegen-Anti-Kaninchen-Antikörper (Rockland, USA, 1:20.000) untersucht. Das protein of interest MCM-7 (red) was sondiert mit a mouse antikörper (Abcam, USA, 1:1,000) and a Dylight 649 konjugated Goat-anti-mouse antikörper (Rockland, 1:10,000).
Abbildung 3A zeigt ein Multiplex-Fluoreszenzbild der Gesamtproteine (blau), MCM-7 (rot) und GAPDH (grün), die in vier kontroll- und bestrahlungsbehandelten LCL-Proben nachgewiesen wurden. Abbildung 3B ist ein fleckenfreies Bild desselben Flecks, das die gesamten Proteinmuster in jeder Probe (30 g) zeigt. Die Image-Labor-Software wählte die Probenspuren (blaue Boxen) aus, um MCM-7, GAPDH und das gesamte Proteinvolumen in jeder Spur zu messen. Die MCM-7-Spiegel wurden entweder gegen die fleckenfreie Gesamtproteinmessung oder gegen GAPDH normalisiert. Die normalisierten MCM-7-Proteinspiegel wurden statistisch analysiert und das durchschnittliche MCM-7-Proteinbandvolumen und die Standardabweichung (n=4) werden in der Tabelle dargestellt (Abbildung 3C). Beide Normalisierungsmethoden ergaben einen leichten Rückgang (ca. 25%) in MCM-7-Proteinspiegeln nach Bestrahlungsbehandlung. Die Daten mit der Gesamtproteinnormalisierung wiesen eine geringere Standardabweichung auf als bei GAPDH als Ladekontrolle.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50948/50948fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50948/50948fig1.jpg"> Abbildung 1. V3 Westlicher Workflow. Der V3-Workflow wird in der linken Spalte in 4 Schritten dargestellt. Die wichtigsten Instrumente und Reagenzien, die im Workflow verwendet werden, werden in jedem Schritt gezeigt. Die geschätzte Zeit für jeden Schritt ist ebenfalls enthalten. Die rechte Spalte zeigt, dass mindestens 4 Bilder im V3-Workflow generiert werden können. Die Verwendung der einzelnen Daten wird beschrieben. Die fleckenfreien Bilder des Pretransfer-Gels, des Post-Transfer-Gels und des Blots (A, B, C) können mit traditionellen westlichen Blotting-Techniken nicht leicht erzeugt werden; Diese Bilder und Daten liefern wichtige Informationen und Checkpoints entlang des Verfahrens, um die Kontrolle und Reproduzierbarkeit des Western Blot-Workflows durch den Wissenschaftler zu verbessern. Die Zielproteinsignale können entweder auf einem chemilumineszierenden Blotbild (D) erfasst werden, wenn ein HRP-konjugierter Sekundärantikörper bei der Detektion oder auf einem fluoreszierenden Fleckbild (E) angewendet wurde, wenn multiplexierende fluoreszierende Westernblotting durchgeführt wurde, um mehr als ein Zielprotein gleichzeitig auf demselben Fleck zu detektieren. 
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50948/50948fig1highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50948/50948fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50948/50948fig2.jpg"> Abbildung 2. Fleckenfreie Bilder von Pretransfer- und Post-Transfer-Gelen im V3-Western-Workflow zur Bewertung der Probenintegrität, Trennqualität und Übertragungseffizienz. (A) Pretransfer-Gel fleckenfreies Bild. (B) Post-Transfer-Gel fleckenfreies Bild. (C) Messung der Proteintransfereffizienz.
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50948/50948fig2highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50948/50948fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50948/50948fig3.jpg"> Abbildung 3. Vergleich der fleckenfreien Gesamtproteinmessung mit GAPDH-Immundetektion als Belastungskontrolle zur Normalisierung des Proteingehalts. (A) Fluoreszierendes westliches Blotbild. (B) Fleckenfreies Blotbild. (C) Normalisierter MCM-7-Proteinspiegel. 
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50948/50948fig3highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen.</a>

V3-Workflow ist ein Western-Blot-Verfahren mit fleckenfreien Gelen. Die fleckenfreie Technologie ermöglicht es Forschern, die Proteintrennungsqualität zu visualisieren, die Übertragungseffizienz zu überprüfen und vor allem die Veränderung des von Interesse interessierten Proteins mithilfe der gesamten Proteinquantifizierung als zuverlässige Belastungskontrolle zu validieren.

V3 Stain-free Workflow für eine praktische, bequeme und zuverlässige Total Protein Loading Control in Western Blotting

The western blot is a very useful and widely adopted lab technique, but its execution is challenging. The workflow is often characterized as a &#34;black ...

Der BioRad V three Workflow bietet Forschern eine zuverlässigere Quantifizierung und mehr Sicherheit im Western-Blotting-Prozess. Dies wird erreicht, indem zunächst TGX-Färbefrei-Gele zur Trennung und Sichtbarmachung von Proteinproben verwendet werden. Nach der Trennung werden die Proteine mittels des Blot-Turbo-Schnelltransfersystems auf eine Membran übertragen, wodurch die Überprüfung der Qualität und Effizienz der Übertragung ermöglicht wird.Nach der Überprüfung des Transfers wird die Membran blockiert und anschließend mit primären und sekundären Antikörpern gegen die Zielproteine inkubiert. Abschließend werden die Mengen der Zielproteine anhand der „Stain-free“-Gesamtproteinkennung als Ladekontrolle normalisiert. Die V3-Workflow-Lösung bietet Bequemlichkeit und Transparenz im Western-Blot-Prozess und vermittelt den Forschern bei jedem Schritt – von der Trennung über den Transfer bis zur Quantifizierung – Sicherheit.Der Hauptvorteil des V three Western-Workflows gegenüber der traditionellen Western-Blot-Analyse liegt darin, dass die stain-free-Technologie eine praktische, bequeme und zuverlässige Kontrolle der Gesamtproteine für die Normalisierung der Signale Ihres Zielproteins bietet. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen zur Zuverlässigkeit von Methoden zur Ladungskontrolle in der Western-Blot-Analyse zu beantworten, insbesondere im Hinblick auf die Übersättigung der Signale von Housekeeping-Proteinen und die unterschiedlichen Expressionsniveaus von Housekeeping-Proteinen unter variierenden experimentellen Bedingungen. Wir fanden heraus, dass Proteine, die in stain-free-Gelen aktiviert wurden, auch auf Membranen ohne weitere Färbung sichtbar gemacht werden können, wodurch sie als Alternative zu herkömmlichen Gesamtprotein-Färbungen sowie als Ladungskontrollen für Housekeeping-Proteine verwendet werden können.In den nächsten Minuten werden wir den kompletten V-drei-Workflow unter Verwendung der Multiplex-Fluoreszenz demonstrieren. Dasselbe Verfahren kann auch für Chemilumineszenz verwendet werden, nachdem Proteinproben gemäß dem Textprotokoll vorbereitet wurden. Unter Verwendung eines Criterion-TGX-Stain-free-any-kD-Präcast-Gels entfernen Sie den Kamm und das Band vom unteren Rand der Kassette.Setzen Sie die Kassette in die Gelelektrophoresevorrichtung ein und füllen Sie beide Wannen mit Laufpuffer. Laden Sie die Proteinstandards und Proben auf. Führen Sie dann das Gel 20 Minuten lang bei 300 Volt durch.Nach Abschluss der Elektrophorese öffnen Sie die Gelenkassette mithilfe des Kassettenöffnungswerkzeugs am Deckel der Criterion-Cell. Geben Sie anschließend einige Milliliter Wasser auf den UV-Transilluminator des Chemi Dock MP-Bildgebungssystems. Heben Sie das Gel vorsichtig aus der Kassette und platzieren Sie es auf dem UV-Transilluminator. Starten Sie die Image Lab-Software und richten Sie ein neues Einzelkanal-Protokoll für färbefreie Gele ein, wobei Sie die voreingestellte Aktivierungszeit von einer Minute verwenden. Wählen Sie den geeigneten Geltyp sowie die Standard-Autooptimierung für intensive Banden aus.Klicken Sie dann auf „Protokoll ausführen“. Sobald die Bildaufnahme abgeschlossen ist, überprüfen Sie die Trennung und die Probenqualität. Fahren Sie anschließend unverzüglich mit dem Transferschritt fort.Um die Proteinübertragung durchzuführen, öffnen Sie ein Trans-Block-Turbo-MIDI-PVDF-Transfer-Set. Legen Sie den unteren Stapel in die Mitte der Kassettenbasis. Entfernen Sie das Gel aus dem Detektor. Platzieren Sie das Gel vorsichtig auf der Membran. Verwenden Sie sanft den Blot-Roller, um Luftblasen zwischen dem Gel und der Membran zu entfernen. Danach platzieren Sie den oberen Stapel auf das Gel.Nachdem Luftblasen entfernt wurden, setzen Sie den Kassettendeckel auf die Basis. Drücken Sie den Deckel fest nach unten, drehen Sie den Drehknopf im Uhrzeigersinn, um ihn zu verriegeln, und schieben Sie die Kassette in eine der beiden Blotterbuchten. Wählen Sie auf dem Startbildschirm das Turbo-Protokoll aus.Wählen Sie die beiden Mini- oder eine Mini-Gel aus und drücken Sie die Starttaste für die entsprechende Kammer. Der Transfer ist in sieben Minuten abgeschlossen. Entfernen Sie die Kassette aus der Kammer. Öffnen Sie die Kassette und bauen Sie das Blotting-Sandwich auseinander. Legen Sie das Gel nach der Übertragung auf den UV-Transilluminationstisch des Chemi-Dock-MP-Bildgebers und geben Sie die Membran unverzüglich in entionisiertes Wasser. Richten Sie ein neues Einzelkanal-Protokoll für färbefreie Gele ohne Aktivierungszeit ein.Wählen Sie den geeigneten Gelelektrophorese-Typ aus und stellen Sie die Belichtungszeit manuell auf die des Gels vor der Übertragung ein, und klicken Sie auf „Protokoll ausführen“. Sobald die Bildaufnahme abgeschlossen ist, überprüfen Sie die Übertragungseffizienz, indem Sie die Bandenintensitäten der Proben zwischen dem Gel vor und nach der Übertragung vergleichen.Entfernen Sie das Gel aus der Probenwanne, da es nicht mehr benötigt wird, und entsorgen Sie es. Zur Überprüfung übertragen Sie es auf die Blot-Membran. Legen Sie die Membran auf die Probenwanne und richten Sie ein neues Einzelkanal-Protokoll ein.Für die fleckenfreie Übertragung. Wählen Sie den geeigneten Geltyp und die Standard-Auto-Optimierung für intensive Banden aus. Klicken Sie dann auf „Protokoll ausführen“.Nach Abschluss der Bildaufnahme überprüfen Sie die Übertragung auf die Membran. Entfernen Sie die Blot-Membran vom UV-Durchlichttisch und geben Sie sie in den Blockpuffer für den Western Blot. Nach einer einstündigen Inkubation der Membran bei Raumtemperatur wird diese am folgenden Tag über Nacht bei vier Grad Celsius mit primären Antikörpern von Maus und Kaninchen inkubiert.Geben Sie die Antikörperlösung ab und waschen Sie den Blot fünf Minuten lang mit 50 Milliliter TBST. Inkubieren Sie den Blot eine Stunde bei Raumtemperatur mit fluoreszenzmarkierten sekundären Antikörpern gegen Maus und Kaninchen. Waschen Sie anschließend den Blot fünfmal jeweils fünf Minuten lang mit TBST.Um die Membran zu dokumentieren, legen Sie sie auf den UV-Durchlichttisch des Chemi Doc MP-Imagers in der Image Lab-Software. Richten Sie ein neues Mehrkanal-Protokoll ein. Konfigurieren Sie Kanal eins, indem Sie unter „Blot Applications“ die Option „Dite Six 50“ auswählen, und verwenden Sie die standardmäßige automatische Optimierung für intensive Banden.Wiederholen Sie diese Schritte, um die Kanäle zwei und drei für DITE 5 49 bzw. die färbefreie Blot-Methode zu konfigurieren. Wählen Sie den geeigneten Geltyp aus und klicken Sie auf „Protokoll ausführen“. Um die Gelleisen zu definieren, wählen Sie das Bild des färbefreien Blots mit den Gelen und Banden aus.Danach automatischer Bandfinder für eine genaue Quantifizierung. Stellen Sie sicher, dass die Hintergrundprofile in jedem Probenkanal ähnlich sind, indem Sie die Größe der Rollenscheibe auf 70 anpassen. Überprüfen Sie die Hintergrundgleichförmigkeit, indem Sie alle Kanalprofile durchscannen, um Banden sowohl in den Kanälen dite six 50 als auch 5 49 zu definieren.Verwenden Sie das Bandenfinder-Tool, um Banden mithilfe der voreingestellten Empfindlichkeitseinstellungen zu detektieren. Um den Normalisierungskanal festzulegen, kehren Sie zur Analysewerkzeugleiste zurück. Klicken Sie auf Normalisierung und wählen Sie „Stain-free-Blot“, wobei sichergestellt werden muss, dass „Gesamtprotein der Spur“ ausgewählt ist.Um die Standard-Läufe für das Molekulargewicht zuzuweisen, kehren Sie zur Analysewerkzeugleiste zurück, klicken Sie auf Molekulargewichts-Analysewerkzeuge und aktivieren Sie das Kästchen unter dem entsprechenden Lauf. Abschließend klicken Sie in der Symbolleiste auf die Analysetabelle, um die normalisierten Proteinbandenintensitäten anzuzeigen. Die Software generiert automatisch eine Tabelle, die Volumenintensitäten, Normalisierungsfaktoren und normalisierte Volumina enthält.Die normalisierten Volumina sollten für die Datenanalyse und Berichterstattung verwendet werden. Die Tabelle kann exportiert werden. Für weitere Analysen haben wir den vollständigen V3-Western-Blotting-Workflow dargestellt.Nun zeigen wir Ihnen repräsentative Ergebnisse eines echten Experiments. Lysate von Kontroll- und bestrahlten Lymphoblasten-Zellkulturen wurden mit dem V-three-Western-Blot-Workflow analysiert. Das farblose Gesamtproteinsignal erscheint in Blau.Das Zielprotein M CM sieben ist in Rot dargestellt, und das validierte Housekeeping-Protein als Beladungskontrolle, GA DH, ist in Grün dargestellt. GA DH wurde als geeignete Beladungskontrolle validiert, indem seine Linearität unter Verwendung der in diesem Video beschriebenen experimentellen Bedingungen überprüft wurde. Die Signale des färbefreien Gesamtproteins für jede Spur auf dem Blot wurden mithilfe der Image Lab-Software gemessen.Die Signalintensitäten von MCM sieben wurden unter Verwendung der Gesamtproteinsignale sowie der GA-DH-Signale normalisiert. Die durch beide Methoden normalisierten Bandenvolumina des MCM-sieben-Proteins zeigten eine um 25 % verringerte Expressionsstufe in bestrahlten Proben im Vergleich zu Kontrollproben vor der genauen Normalisierung. Das Housekeeping-Protein erfordert eine Validierung, die dessen linearen Bereich und eine konstante Expression zwischen den Proben bestätigt, ohne dass eine Validierung vorliegt.Beladungskontrollen mit Housekeeping-Proteinen garantieren keine genaue Normalisierung. Im Gegensatz dazu erfordert die Normalisierung mittels Gesamtprotein keine Validierung. Daher bietet das farbfreie Gesamtproteinsignal, das mit dem V3-Workflow erhalten wird, eine praktische, bequeme und zuverlässigere Beladungskontrolle bei Durchführung dieses Verfahrens.Beachten Sie, dass die stain-free-Technologie eine fluoreszierende Visualisierung von Proteinstichproben durch eine UV-induzierte kovalente Modifikation verfügbarer Tryptophan-Reste ermöglicht. Nur in seltenen Fällen beeinträchtigt diese Modifikation nachgeschaltete Anwendungen wie die Immunodetektion oder Massenspektrometrie signifikant. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man den V3-Western-Workflow und die stain-free-Gesamtprotein-Normalisierung durchführt.Obwohl wir diesen Arbeitsablauf für multiplex fluoreszierende Western Blots demonstriert haben, kann die stain-free-Technologie auch zur Normalisierung auf Gesamtprotein bei lumineszenten Western Blots verwendet werden.

v3-stain-free-workflow-for-practical-convenient-reliable-total

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieser technische Artikel beschreibt eine Standard-Western-Blot-Verfahren unter Verwendung der kommerziell erhältlichen NuPAGE Elektrophorese Mini-Gel-System von Invitrogen.

Western Blot mit dem Invitrogen NuPage Novex Bis Tris Minigele

Nach der Trennung durch elektrophoretische Methoden können Proteine ​​in einem Gel durch mehrere Färbemethoden nachgewiesen werden. Die Färbung von Proteinen mit Coomassie Blue, Silver Färbung, SYPRO Orange, SYPRO Ruby sind in diesem Video demonstriert.

Die Färbung Proteine ​​in Gelen

Western-Blot ist eine analytische Technik verwendet, um bestimmte Proteine ​​in einer Probe von Gewebehomogenat oder Extrakt zu erkennen.

Western Blot: Probenvorbereitung zur Detektion

Das Video zeigt eine auf der Normalisierung von Gesamtproteinen basierende Western-Blotting-Technik zur Quantifizierung der Zielproteinexpression in einer Probe. Unter Verwendung der Gesamtproteinfärbung der Probe wird eine ratiometrische Analyse durchgeführt, um das relative Expressionsniveau des Zielproteins zu bestimmen.

Quantitatives Western Blot zur Abschätzung der Proteinexpressionsniveaus

Dieses Video beschreibt das Chemilumineszenz-basierte Western Blot von immunpräzipitierten Lysaten. Die Technik hilft bei der Bestimmung der Proteinverarbeitung und -aktivierung. Das detektierte Chemilumineszenzsignal ist proportional zum Grad der Proteinverarbeitung während seiner Aktivierung.

Chemilumineszenz-Western-Blot-Assay für die Proteinverarbeitung

Dieses Protokoll untersucht die neuesten Fortschritte bei der Durchführung von Western-Blot-Analysen. Diese neuen Änderungen setzen eine Bis-Tris-Gel-System mit einer 35 min Elektrophorese Laufzeit, einer 7 min-Dry-Blotting Transfersystem und Infrarot-fluoreszierende Protein Erkennung und Bildgebung, höhere Auflösung, Qualität, Empfindlichkeit und verbesserte Genauigkeit der West Daten erzeugt.

Der schnellste westlichen Stadt: Eine moderne Variante der Classic Western-Blot-Analyse

Die Weiterentwicklung des Western Blotting mittels Fluoreszenz hat den Nachweis subtiler Veränderungen in der Proteinexpression ermöglicht, was quantitative Analysen ermöglicht. Hier beschreiben wir eine robuste Methodik zum Nachweis einer Reihe von Proteinen über eine Vielzahl von Spezies und Gewebetypen hinweg. Eine Strategie zur Überwindung häufiger technischer Probleme wird ebenfalls vorgestellt.

A Guide to Modern Quantitative Fluoreszenz Western Blot mit Strategien zur Fehlersuche

Diese Methode beschreibt, einen stabile und reproduzierbaren Ansatz für den Vergleich der Proteingehalte in verschiedenen Geweben und an verschiedenen Entwicklungsstörungen Zeitpunkten mit einem standardisierten quantitativen westlichen befleckenden Ansatz.

Robuste Vergleich der Proteingehalte in Gewebe und in der gesamten Entwicklung mit standardisierten quantitativen Western Blotting

Eine Ultra-High-Speed-Western-Blotting-Technik wird entwickelt, indem die Kinetik der Antigen-Antikörper-Bindung durch zyklische Entwässerungs- und Auffüllungstechnologie (CDR) in Verbindung mit einem Immunreaktions-Verbesserungsmittel verbessert wird.

Ultra-High-Speed Western Blot mit Immunoreaction Enhancing Technology

Die Leitersprosse Walking Aufgabe ist es, eine neue Prüfung zur qualifizierten Fuß beurteilen und zu messen sowohl Vorderbein und Hinterbein platzieren, Stepping, und inter-Schenkel Koordination.

Die Leitersprosse Walking-Aufgabe: Ein Scoring-System und seine praktische Anwendung.

Lernen Sie den V3-Workflow für Western Blotting mit TGX-Stain-free-Gelen zur zuverlässigen Totalprotein-Normalisierung. Diese Methode ermöglicht präzise Proteinquantifizierung ohne Übersättigung von Housekeeping-Proteinen.

V3 Stain-free Workflow für eine praktische, bequeme und zuverlässige Total Protein Loading Control in Western Blotting

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