Isolierung der CA1 Kern angereicherten Fraktionen von Hippocampus-abhängigen Aktivität zu Nuclear Import von Synapto-Atom-Messenger Proteine ​​Studieren

Wir stellen ein detailliertes Protokoll für die Induktion von Langzeit-Potenzierung in der CA1-Region des Hippocampus und der anschließenden Trennung der Kern angereicherten Fraktionen aus dem tetanized Bereich der Scheibe. Dieser Ansatz kann verwendet werden, um abhängig Kernproteinimport in Zellmodellen von Lernen und Gedächtnis zu bestimmen Aktivität.

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, das aktivitätsabhängige nukleozytoplasmatische Shuttling von Proteinen anhand von akuten Hippocampusschnitten zu untersuchen, bei denen die neuronale Konnektivität und Funktion gut erhalten sind. Um dieses Ziel zu erreichen, wird zunächst der Hippocampus einer erwachsenen männlichen Ratte isoliert und in einem zweiten Schritt akute Querschnitte präpariert. Die Hippocampusschnitte werden in die Aufnahmekammer überführt und die späte Form von LTP wird im Radiatom der CA-Einschicht induziert. Als nächstes werden die potenzierten und Kontrollscheiben eingefroren und die stimulierten Ca-One-Regionen präpariert, um die mit Kern angereicherte Fraktion für die weitere Immun-Blott-Analyse zu isolieren.

Die Ergebnisse der Western-Blotting-Analyse zeigen Unterschiede in den nukleären Phosphoproteinspiegeln zwischen den potenzierten und den Kontrollscheiben 30 Minuten nach der Induktion von LTP. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, aus zwei Gründen Schwierigkeiten haben. Erstens die geringe Menge an Gewebeproben und zweitens der kritische Zeitrahmen, der für die Lyse der Proben in hypotonem Lysepuffer wiederholt wird, was die Freisetzung der Zellkerne ermöglicht. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Vorbereitung des Hippocampus-Lebens und die Isolierung der C-Eins-Region schnelle und sehr genaue Dissektionen erfordern, aber es gibt bestimmte Tricks.

Um es einfacher zu machen, müsste man sowohl den schriftlichen als auch den visualisierten Anweisungen für die Vorbereitung der nuklearen angereicherten Fraktion aus dem C eins-Bereich des Hippocampus folgen. Lyse Die Demonstration des Verfahrens wird vom pinon Postal Laboratory durchgeführt. Sie wird zeigen, wie man die akute Hippocampus-Lyse vorbereitet und LTP induziert.

Nach der Sektion von C zeigt Ihnen ein Student aus unserem Labor in einer Region, wie Sie Kernkraft und Zerstörung isolieren können. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie das Rattengehirn isolieren und in die vorkohlensäurehaltige eiskalte Blicklösung eintauchen. Als nächstes entfernen Sie das Kleinhirn und einen Teil der enteralen Rinde.

Trennen Sie die kortikalen Hemisphären mit einem mittleren sagittalen Schnitt. Machen Sie anschließend einen 50- bis 70-Grad-Schnitt entlang des dorsalen Randes jeder Hemisphäre. Legen Sie dann jede Halbkugel auf ihre mediale Oberfläche, kleben Sie jede Halbkugel mit der frisch geschnittenen Oberfläche auf die Schneideplattform des Vibratos.

Decken Sie anschließend die Plattform mit der vorkar bogierten eiskalten Blicklösung ab. Schneiden Sie mit dem Vibram 350 Mikrometer große Scheiben mit der Hippocampus-Formation, der subularen und enteralen Rinde von der vorderen zur hinteren Seite. Danach werden die Scheiben in einen U-förmigen und untergetauchten Inkubator überführt und mindestens zwei Stunden lang bei 32 Grad Celsius mit carbogen A CSF inkubiert.

Übertragen Sie nun eine Hippocampus-Scheibe in die unter einem Mikroskop montierte Aufnahmekammer. Perfundierte der Scheibe mit kohlensäurehaltigem A CSF bei sechs Millilitern pro Minute für mindestens 30 Minuten bei 32 Grad Celsius. Nach 30 Minuten füllen Sie die Glaskapillar-Mikroelektroden mit einem Liquor.

Platzieren Sie eine Mikroelektrode in den CA one Schaefer-Kollateralfasern zur Stimulation und eine weitere in das ca one schichtbereite Atom für die EPSP-Aufzeichnung im Feld mit einem Abstand von 300 Mikrometern. Rufen Sie dann die Feld-EP-SSPs hervor, indem Sie drei bis vier Volt durch phasische rechteckige Stromimpulse an die Schafer-Kollateralfasern abgeben. Führen Sie den Test der maximalen Stimulation durch, indem Sie die Eingangs-/Ausgangsbeziehung messen und die Stimulationsstärke als 40 % des maximalen EPSP-Steigungswerts des Feldes definieren.

Zeichnen Sie als Nächstes die Ausgangswerte mindestens 15 Minuten lang auf, indem Sie während des gesamten Experiments jede Minute die Reaktionen auf Teststimuli messen. Um eine späte LTP zu induzieren, wenden Sie hochfrequentes Tein an, um die EPSPs des evozierten Feldes in etwa einer Region zu erhöhen. Geben Sie fünf Mikromolaren per COE zwei Minuten vor dem Tetinus auf den A-Liquor und waschen Sie ihn sofort nach dem letzten Tetanus aus.

Stoppen Sie die Aufnahme. Entfernen Sie zwei Minuten oder 30 Minuten nach der späten LTP-Induktion die Elektroden und übertragen Sie die Scheibe schnell auf eine vorgekühlte Metallplattform, die auf Trockeneis gelegt wird. Sammeln Sie dann jede Scheibe in einem 1,5 Milliliter Eend Orph-Röhrchen und lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius.

In diesem Schritt nimmst du die gefrorenen Scheiben aus den minus 80 Grad Celsius und hältst sie auf Eis. Geben Sie 0,5 Milliliter frischen kalten TBS-Puffer, der Protease- und Phosphatasehemmer enthält, in das Röhrchen. Inkubieren Sie sie zwei bis drei Minuten lang, bevor Sie sie in ein Stereomikroskop überführen.

Als nächstes präparieren Sie die CA-Region des Hippocampus, indem Sie die Scheibe mit einer Nadel halten und den CA-Bereich mit der anderen abschneiden. Sammeln Sie anschließend die präparierten ca-eins-Regionen aus fünf Scheiben pro Gruppe in einem neuen Ein-Punkt-Milliliter-Röhrchen, das 50 Mikroliter Lysepuffer enthält. Homogenisieren Sie dann das gesammelte Gewebe, indem Sie mit einer 200-Mikroliter-Pipette vorsichtig auf und ab pipettieren.

Inkubieren Sie das Lysat fünf bis sieben Minuten lang auf Eis, damit die Zellen aufquellen können. Nehmen Sie danach zwei Mikroliter des Lysats und tropfen Sie es auf einen Objektträger. Visualisieren Sie die Schwellung der Zellen unter einem Hellfeldmikroskop.

Die Kerne erscheinen als runde, intakte Strukturen mit richtiger Schwellung. Sammeln Sie nun 20 Mikroliter Probe in einem frischen 1,5-Milliliter-Röhrchen als Homogenatfraktion. Fügen Sie acht Mikroliter denaturierenden Vier-XSDS-Probenpuffer hinzu.

Dann zentrifugieren Sie das restliche Lysat eine Minute lang bei 1100 RCF. Nach einer Minute den Überstand vorsichtig von oben auffangen und in ein neues Röhrchen umfüllen. Anschließend 20 Mikroliter mit vier x Probenpuffer hinzufügen.

Dann resuspendieren Sie das Pellet in 60 Mikrolitern hypotonischem Puffer und fügen Sie 20 Mikroliter vier x Probenpuffer hinzu. Diese Fraktion wird als nuklear angereicherte Fraktion bezeichnet. Lagern Sie die homogenaten, zytosolischen und nuklear angereicherten Fraktionen bei minus 20 Grad Celsius oder minus 80 Grad Celsius.

Für das spätere Immunblotting in diesem Verfahren tauen die Proben auf und kochen sie fünf Minuten lang bei 95 Grad Celsius, bevor die Proteinkonzentration mittels AM mito black test oder BCA-Testlast einer gleichen Menge an Proteinproben aus der homogenaten, zytoplasmatischen und nuklear angereicherten Fraktion gemessen wird. Auf einer SDS-Seite sollten Gelproben aus den Kontroll- und LTP-Scheiben für den direkten Vergleich im Western Blot auf dasselbe Gel gelegt werden. Diese Abbildung zeigt einen Immunblot für die homogenaten, zytosolischen und nukleär angereicherten Fraktionen von ca. einem Lysat, die mit zytosolischen und nukleären Markern untersucht wurden.

Hierbei handelt es sich um eine Immun-Blot-Analyse der PJS-180-Spiegel im Homogenat zwei Minuten und 30 Minuten nach der Induktion von Tein, und es handelt sich um eine Immunblutanalyse der PJS-180-Spiegel in der nuklearen angereicherten Fraktion. Zwei Minuten und 30 Minuten nach der Aktivierung blieben die Phospho-Jacob-Spiegel in den Gesamt-CA-1-Proteinhomogenaten und zwei Minuten nach der Aktivierung in der mit Kern angereicherten Fraktion unverändert. Es wurde jedoch ein signifikanter Anstieg der Immunreaktivität von p Jacob, S 180 30 Minuten nach der Induktion von LTP festgestellt.

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, ein angemessenes Volumen des hypotonischen Lyseventils zu verwenden. Außerdem muss der kritische Zeitrahmen für die Lyse der Proben standardisiert werden. Insbesondere wenn dieses Verfahren zur Isolierung von Kern- und Fraktionsproben aus Ratten- oder Maushirngewebeproben angewendet wird, die nicht der Hippocampus sind. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie die komplementäre Immunfärbung mit Antikörpern gegen Kandidatenproteine, die nach Induktion von OTP in den Zellkern importiert werden, oder Signalmoleküle wie aktive Formen der Kinase oder Phosphatase hilfreich sein, um diese Ergebnisse zu verifizieren.

Eine pharmakologische Behandlung kann durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten. Zum Beispiel, welche Signalkaskaden an der Translokation von synaptischen Kernproteinen beteiligt sind oder wie sie eine Kernfunktion beeinflussen. Darüber hinaus könnte man die Rolle von synap-nukleären Botenproteinen bei Erkrankungen des Hippocampus untersuchen.

Zum Beispiel die Alzheimer-Krankheit.