Untersuchung von Synaptic Tagging / Erfassung und Lang Capture mit akuten Schnitten des Hippocampus von Nagetiere

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die langfristige Plastizität und ihre assoziativen Prozesse wie synaptisches Tagging, Capture und Cross-Tagging in den CA1-parametralen Neuronen mithilfe von Q-Hippocampus-Schnitten von Nagetieren zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst das Gehirn präpariert und der Hippocampus rasch in kalter, mit Sauerstoff angereicherter künstlicher zerebrospinaler Flüssigkeit isoliert wird. Der zweite Schritt besteht darin, akute Hippocampus-Schnitte mit einem manuellen Gewebeschneider herzustellen und sie in einer Interface-Kammer zu inkubieren.

Anschließend werden zwei stimulierende Elektroden und zwei Ableitelektroden im CA1-Bereich platziert, um feldgebundene EPSP- und Populations-Spike-Antworten von zwei synaptischen Eingängen abzuleiten. Der letzte Schritt besteht darin, eine vorübergehende Form der Plastizität in einem synaptischen Eingang und eine dauerhafte Form der Plastizität in einem anderen Eingang innerhalb eines bestimmten Zeitfensters auszulösen. Letztendlich werden die feldgebundenen EPSP-Antworten beider Eingänge über längere Zeiträume aufgezeichnet, um die Mechanismen der synaptischen Markierung, Erfassung und Quervernetzung zu untersuchen.

Die synaptische Markierung und Erfassung bietet eine konzeptionelle Grundlage dafür, wie sich Kurzzeitgedächtnis innerhalb eines bestimmten Zeitraums in Langzeitgedächtnis umwandelt. Eine visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die experimentellen Schritte aufgrund der Notwendigkeit, mehrere synaptische Eingänge zu stimulieren und aufzuzeichnen, schwer zu erlernen sind. Die Durchführung des Verfahrens wird Mahesh Shira, machete und maima Sharma, Doktoranden aus meinem Labor, übernehmen.

Um dieses Verfahren zu beginnen, bereiten Sie ein ACSF vor und spülen Sie es mit 95 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid durch. Füllen Sie den Boden der Interface-Kammer bis zu etwa 70 % ihrer Kapazität mit destilliertem Wasser. Schalten Sie dann den Temperaturregler, der auf 32 Grad Celsius voreingestellt ist, ein.

Als Nächstes spülen Sie die obere Kammer 10 bis 15 Minuten lang, indem Sie destilliertes Wasser mit hoher Flussrate durch die Zulaufschläuche leiten, bevor Sie auf A-CSF mit einer Flussrate von einem Milliliter pro Minute umschalten. Danach platzieren Sie ein Netz in der oberen Kammer, um eine Ruhefläche für die Schnitte bereitzustellen. Beginnen Sie mit der Carbogenversorgung der unteren Kammer, indem Sie die Zulaufschläuche in das A-CSF eintauchen, das kontinuierlich mit Carbogen versorgt wird.

20 Minuten warten, bis das ACSF vollständig mit Carbogen gesättigt ist und die obere Kammer gefüllt hat. In diesem Schritt ein Rasiermesser an der Gewebeschneidvorrichtung befestigen und sicherstellen, dass die Schneidkante gleichmäßig ausgerichtet ist. Durch das Schneiden eines kleinen Filterpapiers testen, um zu gewährleisten, dass das Messer fest befestigt ist.

Dann stellen Sie den Schiebemessschieber auf seine Ausgangsposition ein. Entnehmen Sie nun den Kopf einer euthanasierten Ratte und schneiden Sie mit einer Iris-Schere durch den Hinterkopf, um den Hirnstamm zu entfernen. Anschließend führen Sie einen kleinen Einschnitt entlang der rechten Seite des Schädels und einen längeren Einschnitt auf der linken Seite durch.

Entfernen Sie vorsichtig den Schädel mit einem Knochen-UR, beginnend von der linken Seite und zur rechten Seite des Schädels gehend. Um die Hirnrinde und die dünne, sie bedeckende Dura zu freilegen, entfernen Sie die Dura vorsichtig mit einem dünnen Spatel und nehmen Sie anschließend die frontalen Platten zusammen mit dem Knochen heraus. Entfernen Sie danach die verbleibende Dura gezielt an der Übergangsstelle zwischen Kortex und Kleinhirn mit dem flachen Ende eines Spatels und vermeiden Sie Gehirnschäden, indem Sie den Druck nach oben gerichtet halten.

Mit dem Spatel das Gehirn vorsichtig in eine Petrischale auf einem Aluminiumkühlblock geben, die mit kaltem und karbonisiertem aCSF gefüllt ist. Um den Hippocampus zu isolieren, mit einem Skalpell der Nummer 11 einen geraden Schnitt ausführen, um das Kleinhirn zu entfernen, und einen weiteren Schnitt, um ein Viertel des vorderen Gehirnteils zu entfernen. Danach einen flachen sagittalen Schnitt entlang der Mittellinie ausführen, beginnend von der Mittellinie aus.

Entfernen Sie vorsichtig die Hirnrinde mit dem Sichelhöcker, um den dorsalen Hippocampus freizulegen. Danach entfernen Sie die Schicht der Hirnrinde oberhalb des Hippocampus. Führen Sie einen kleinen Schnitt in die Hippocampuscommissur ein.

Entfernen Sie vorsichtig das Hippocampus mit dem Sichelhöcker, beginnend am dorsalen Ende unter Verwendung von Rollbewegungen. Entfernen Sie anschließend jeglichen Kortex und Bindegewebe um das isolierte Hippocampus mithilfe des gebogenen Endes des Sichelhöckers. Um das Hippocampus-Gewebe zu schneiden, legen Sie ein Stück 30 Millimeter großes Watman-Filterpapier, das in künstlichem Zerebrospinalflüssigkeit (CSF) getränkt ist, auf die Schneidebühne des manuellen Schneiders.

Übertragen Sie das hippocampale Gewebe auf das Filterpapier. Bringen Sie mithilfe des flachen Endes des Sichel-Scalpells das Filterpapier in eine geeignete Position, sodass der Hippocampus in Bezug auf die Klinge des Schneiders korrekt ausgerichtet ist und im Winkel von etwa 70 Grad zur fia geschnitten wird. Danach entfernen Sie die überschüssige Flüssigkeit um das hippocampale Gewebe herum durch Abtupfen.

Unter Verwendung eines gefalteten Filterpapiers die Hippocampus quer schneiden und das Gewebe von den Enden des Hippocampus verwerfen, an denen die Schnittmorphologie nicht klar ist. Anschließend das verbleibende Gewebe in 400 Mikrometer dicke Schnitte aufteilen, wobei nach jeder Schnittebene der Feintrieb mit dem Nonius-Mikrometer neu eingestellt wird. Nach jedem Schnitt den Schnitt vorsichtig mit einem Pinsel mit weichen Borsten von der Klinge nehmen und in ein kleines Becherglas mit kaltem, kohlensäurehaltigem ACSF überführen.

Überführen Sie die Schnitte dann vorsichtig mit einer sauberen Plastik-Pasteurpipette auf das Netz im Schnittkammer. Positionieren Sie die Schnitte mit einer breiten Spitze sorgfältig so, dass die Elektrodenplatzierung und die Aufnahmeüberprüfung erleichtert werden; stellen Sie sicher, dass die Schnitte ausreichend von einer Schicht A-CSF umgeben, aber nicht vollständig untergetaucht sind. Danach decken Sie die Kammer ab und inkubieren die Schnitte für zwei bis drei Stunden in Experimenten zur synaptischen Markierung und Erfassung.

Positionieren Sie unter dem Mikroskop die beiden stimulierenden Elektroden in der Stratum-radiatum-Schicht des CA1-Bereichs, um die Schaffer-Kollateral-Fasern zu stimulieren, und platzieren Sie eine Ableitelektrode im apikalen dendritischen Bereich von CA1, genau in der Mitte zwischen den stimulierenden Elektroden. Um F-E-P-S-P-Antworten aufzuzeichnen, bringen Sie eine weitere Ableitelektrode in der Stratum-pyramidale-Schicht an, um den Populations-Spike zu registrieren.

Wenn alle Elektroden den Schnitt berühren, geben Sie eine Teststimulation ab, um sicherzustellen, dass in beiden Eingängen ein ordnungsgemäßes feldgebundenes EPSP-Signal erhalten werden kann. Sobald ein geeignetes F-E-P-S-P-Signal erzielt ist, senken Sie die Elektroden vorsichtig mithilfe der Feinbewegungsknöpfe der Manipulatoren etwa 200 Mikrometer weiter ab. Anschließend lassen Sie dem Schnitt 20 Minuten Zeit zur Erholung.

Danach bestimmen Sie die Ein- Ausgabe-Beziehung, indem Sie die Steigung des feldinduzierten EPSPs über einen Bereich von Stromintensitäten von 20 Mikroampere bis 100 Mikroampere messen. Legen Sie dann für jeden Eingang die Reizintensität fest, die 40 % der maximalen Steigung des feldinduzierten EPSPs hervorruft, und verwenden Sie diese als konstante Reize während des gesamten Experiments. Nach 15 bis 20 Minuten beginnen Sie mit der Aufzeichnung einer stabilen Basislinie, die mindestens 30 bis 60 Minuten andauern sollte, bevor die Induktion von LTP-LTD in einem Eingang erfolgt. Induzieren Sie in einem Eingang eine frühe Langzeitpotenzierung (LTP) unter Verwendung eines schwachen Tetanisierungsprotokolls, das aus einer einzelnen Hochfrequenzstimulation besteht.

Während die andere Eingabe weiterhin die Baseline 30 Minuten nach der Induktion der frühen LTP aufzeichnet, induzieren Sie eine späte LTP in Eingabe S zwei mittels eines starken Tetanisierungsprotokolls, das wiederholte Hochfrequenzstimulationen mit einem Intervall von 10 Minuten zwischen den Serien umfasst. Zeichnen Sie dann die Feld-EPSP-Antworten über verlängerte Zeiträume auf, um die Umwandlung der frühen LTP in Eingabe S eins in eine späte LTP durch das synaptische Markieren und Erfassen (synaptic tagging and capture) sichtbar zu machen. In ähnlicher Weise wird bei einem Kreuz-Erfassungs-Experiment (cross capture experiment) zunächst eine frühe LTP in einer Eingabe induziert, gefolgt von einer späten LTD-Induktion in einer anderen Eingabe 30 Minuten später, wobei ein starkes niederfrequentes Stimulationsprotokoll verwendet wird, das aus 900 Bursts über eine Dauer von 15 Minuten besteht.

Zeichnen Sie dann die feldgesteuerten EPSP-Antworten über längere Zeiträume auf, um die Umwandlung der frühen LTP in der Eingabe S eins in späte LTP durch die Kreuzbindung sichtbar zu machen. In dieser Darstellung werden zwei Stimulierelektroden im Stratum radiatum der CA-eins-Region platziert, um zwei unabhängige, aber überlappende synaptische Eingaben zu stimulieren. Auf CA-eins-Parasubikulumsneuronen zwei extrazelluläre Ableitelektroden.

Eine zur Aufzeichnung von F-E-P-S-P aus dem apikalen dendritischen Kompartiment. Und eine weitere zur Aufzeichnung des somatischen Populations-Sprungs aus den parameatalen Zellkörpern, die sich im Stratum radiatum bzw. im Stratum pyramidale befinden. Diese Abbildung zeigt die Versuchsanordnung vor dem starken Paradigma zur Untersuchung der synaptischen Markierung und des Captures.

Schwache Tetanisierung wird auf S eins angewendet, um eine frühe langanhaltende Potenzierung (LTP) auszulösen, gefolgt von einer starken Tetanisierung von S zwei nach 30 Minuten, um eine späte LTP zu induzieren. Diese Abbildung zeigt die Phase vor dem starken Paradigma zur Untersuchung des Cross-Taggings. Die frühe LTP wird durch schwache Tetanisierung in S eins ausgelöst, gefolgt von der Induktion einer späten langanhaltenden Depression (LTD) in S zwei mittels eines starken niederfrequenten Stimulationsprotokolls. Nach 30 Minuten wird in S eins die frühe LTP in eine späte LTP umgewandelt, die sechs Stunden anhält, was auf Cross-Tagging und -Capture hinweist.

Wenn man diese Technik der Dissektion und Schnittpräparation einmal beherrscht, kann sie innerhalb von drei bis fünf Minuten sehr schnell durchgeführt werden. Auf diese Weise kann die Lebensfähigkeit der Schnitte für Langzeitaufzeichnungen erhalten bleiben. Mithilfe dieser Methode lassen sich außerdem die Wirkungen verschiedener pharmakologischer Substanzen auf die synaptischen Markierungs- und Erfassungsprozesse untersuchen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Langzeit-Versuche zur funktionellen Plastizität durchführt, sowie für die Prozesse der synaptischen Markierung und des Captures.