Untersuchung von Synaptic Tagging / Erfassung und Lang Capture mit akuten Schnitten des Hippocampus von Nagetiere

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Langzeitplastizität und ihre assoziativen Prozesse wie synaptisches Tagging, Capture und Cross-Tagging in den CA one Parametall-Neuronen unter Verwendung von Q-Hippocampus-Schnitten von Nagetieren zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zuerst das Gehirn präpariert und der Hippocampus schnell in kalte, sauerstoffhaltige künstliche Zerebra-Rückenmarksflüssigkeit isoliert wird. Der zweite Schritt besteht darin, akute Hippocampus-Schnitte mit einem manuellen Gewebeschneider vorzubereiten und in einer Grenzflächenkammer zu inkubieren.

Als nächstes werden zwei Stimulationselektroden und zwei Aufzeichnungselektroden in der CA-Region in einer Region platziert, um Feld-EPSP- und Populations-Spike-Antworten von zwei synaptischen Eingängen aufzuzeichnen. Der letzte Schritt besteht darin, eine vorübergehende Form der Plastizität in einem einst synaptischen Input und eine persistente Form der Plastizität in einem anderen Input innerhalb eines bestimmten Zeitfensters zu induzieren. Letztendlich werden die EPSP-Feldantworten beider Eingaben über einen längeren Zeitraum aufgezeichnet, um die Erfassung von synaptischen Tagging- und Cross-Capture-Mechanismen zu untersuchen.

Synaptisches Tagging und Capture bietet eine konzeptionelle Grundlage dafür, wie sich das Kurzzeitgedächtnis innerhalb eines bestimmten Zeitrahmens in ein Langzeitgedächtnis verwandelt. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die experimentellen Schritte schwer zu erlernen sind, da sie die Stimulation und Aufzeichnung mehrerer synaptischer Eingaben beinhalten. Das Verfahren wird von Mahesh Shira, Machete- und Maima Sharma-Doktoranden aus meinem Labor demonstriert.

Um diesen Vorgang zu beginnen, bereiten Sie einen Liquor vor und sprudeln Sie ihn mit 95 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid. Füllen Sie den Boden der Trennkammer bis zu etwa 70 % des Fassungsvermögens mit destilliertem Wasser. Schalten Sie dann den auf 32 Grad Celsius voreingestellten Temperaturregler ein.

Waschen Sie anschließend die obere Kammer 10 bis 15 Minuten lang, indem Sie destilliertes Wasser mit einer hohen Durchflussrate durch den Zuflussschlauch laufen lassen, bevor Sie auf A CSF mit einer Durchflussrate von einem Milliliter pro Minute umschalten. Lege dann ein Netz in die obere Kammer, um eine Auflagefläche für die Scheiben zu schaffen. Starten Sie carbogen die untere Kammer, tauchen Sie den Zulaufschlauch in das A CSF, das kontinuierlich carbogen wird.

Warten Sie 20 Minuten, bis der A-Liquor mit Carbogen gesättigt ist und die obere Kammer gefüllt ist. Montieren Sie in diesem Schritt eine Rasierklinge auf den Gewebezerkleinerer und achten Sie darauf, dass die Schneide gleichmäßig ausgerichtet ist. Testen Sie, indem Sie ein kleines Filterpapier hacken, um sicherzustellen, dass die Klinge fest sitzt.

Stellen Sie dann das verschiebbare Nonius-Mikrometer in seine Ausgangsposition. Nehmen Sie nun den Kopf einer eingeschläferten Ratte und machen Sie mit einer Irisschere einen Schnitt durch den hinteren Schädel, um den Hirnstamm zu entfernen. Machen Sie dann einen kleinen Schnitt entlang der rechten Schädelseite und einen längeren Schnitt auf der linken Seite.

Entfernen Sie vorsichtig den Schädel mit einem Knochen-UR, beginnend von der linken Seite bis zur rechten Seite des Schädels. Um die Rinde und die dünne Duraschicht, die sie bedeckt, freizulegen, entfernen Sie vorsichtig die Dura mit einem dünnen Spatel und entfernen Sie dann die Frontplatten mit dem Knochen. Entfernen Sie anschließend die verbleibende Dura speziell in der Verbindung zwischen Kortex und Kleinhirn mit dem flachen Ende eines Spatels und vermeiden Sie eine Schädigung des Gehirns, indem Sie den Druck nach oben aufrechterhalten.

Schöpfen Sie das Gehirn mit dem Spatel vorsichtig in eine Petrischale auf einem Aluminiumkühlblock, der mit kaltem und kohlensäurehaltigem A-Liquor gefüllt ist, um den Hippocampus mit einem Skalpell mit der Nummer 11 zu isolieren, machen Sie einen geraden Schnitt, um das Kleinhirn zu entfernen, und einen weiteren Schnitt, um ein Viertel des vorderen Teils des Gehirns zu entfernen. Machen Sie dann einen flachen sagittalen Schnitt entlang der Mittellinie. Beginnend von der Mittellinie.

Entfernen Sie vorsichtig die Rinde mit dem Sichelschupper, um den dorsalen Hippocampus freizulegen. Entfernen Sie danach die Schicht des Kortex über dem Hippocampus. Machen Sie einen kleinen Schnitt an der Hippocampus-Kommissur.

Entfernen Sie den Hippocampus vorsichtig mit dem Sichelschupper, beginnend vom dorsalen Ende mit rollenden Bewegungen. Entfernen Sie anschließend alle Rinde und das Bindegewebe um den isolierten Hippocampus herum mit dem gebogenen Ende des Sichelentrosters. Um das Hippocampusgewebe zu schneiden, legen Sie ein Stück eines mit Liquor getränkten 30-Millimeter-Watman-Filterpapiers auf die Schneidestufe des manuellen Slicers.

Übertragen Sie das Hippocampus-Gewebe auf das Filterpapier. Bewegen Sie mit dem flachen Ende des Sichelscalors das Filterpapier, um den Hippocampus in einer richtigen Ausrichtung in Bezug auf die Klinge des Slicers auszurichten, so dass der Hippocampus in einem Winkel von etwa 70 Grad zur Fia geschnitten wird. Tupfen Sie anschließend die überschüssige Lösung, die das Hippocampusgewebe umgibt.

Schneiden Sie den Hippocampus mit einem gefalteten Filterpapier quer und entsorgen Sie das Gewebe am äußersten Ende des Hippocampus, wo die Schnittmorphologie nicht klar ist. Schneiden Sie dann das restliche Gewebe in 400 Mikrometer dicke Scheiben, indem Sie das Nonius-Mikrometer nach jeder Schneiderunde einstellen. Nach jedem Schnitt die Scheibe vorsichtig von der Klinge mit einer Bürste mit weichen Borsten in ein kleines Becherglas geben, das mit kaltem kohlensäurehaltigem A CSF gefüllt ist.

Übertragen Sie dann die Scheiben vorsichtig mit einer sauberen Plastikpipette auf das Netz in der Scheibenkammer. Passen Sie mit einer breiten Spitze die Position der Scheiben vorsichtig so an, dass die Positionierung der Elektrode und die Überprüfung der Aufzeichnung erleichtert wird, um sicherzustellen, dass die Scheiben ausreichend von einer Schicht A-Liquor umgeben, aber nicht vollständig untergetaucht sind. Decken Sie danach die Kammer ab und inkubieren Sie die Scheiben zwei bis drei Stunden lang in synaptischen Markierungs- und Fangexperimenten.

Unter dem Mikroskop positionieren Sie die beiden Stimulationselektroden im Stratum radi Atom des CA einen Bereich zur Stimulation der Schaffer Kollateralfasern und bei der Aufnahme der Elektrode im apikalen dendritischen Bereich von ca einen auf halbem Weg zwischen den Stimulationselektroden. Um F-E-P-S-P-Antworten aufzuzeichnen, platzieren Sie eine weitere Aufzeichnungselektrode in der Stratum parid. DO-Layer zur Aufzeichnung von Bevölkerungsspitzen.

Wenn alle Elektroden die Scheibe berühren, geben Sie eine Teststimulation ab, um sicherzustellen, dass in beiden Eingängen ein korrektes Feld-EPSP-Signal empfangen werden kann. Sobald ein ordnungsgemäßes F-E-P-S-P-Signal erhalten wurde, senken Sie die Elektroden vorsichtig mit den feinen Bewegungsknöpfen der Manipulatoren um etwa 200 Mikrometer weiter ab. Warten Sie dann 20 Minuten, bis sich die Scheibe erholt hat.

Bestimmen Sie danach die Eingangs-Ausgangs-Beziehung, indem Sie die Steigung des Feldes EPSP in einem Bereich von Stromstärken von 20 Mikroampere bis 100 Mikroampere messen. Stellen Sie dann für jede Eingabe die Stimulationsintensität ein, die 40 % der maximalen Feld-EPSP-Steigung als konstante Stimuli während des gesamten Experiments hervorruft. Beginnen Sie nach 15 bis 20 Minuten mit der Aufzeichnung der Baseline, zeichnen Sie eine stabile Baseline von mindestens 30 bis 60 Minuten vor der L-T-P-L-T-D-Induktion in einer Eingabe auf und induzieren Sie eine frühe LTP unter Verwendung eines schwachen Tetinprotokolls, das aus einer einzigen hochfrequenten Stimulation besteht.

Während der andere Eingang die Grundlinie 30 Minuten nach der frühen LTP-Induktion weiterhin aufzeichnet, induzieren Sie einen späten LTP in Eingang S zwei, wobei ein starkes Tetin-Protokoll verwendet wird, das eine wiederholte hochfrequente Stimulation mit einem Intertrain-Intervall von 10 Minuten beinhaltet. Zeichnen Sie dann die EPSP-Antworten des Feldes für die Dauer von extended to auf, um die Transformation von frühem LTP in Eingabe S eins zu spätem LTP durch synaptisches Tagging und Capture zu zeigen. In ähnlicher Weise induziert man in einem Cross-Capture-Experiment zunächst eine frühe LTP und einen Input, gefolgt von einer späten LTD-Induktion 30 Minuten später, in einem anderen Input, unter Verwendung eines starken niederfrequenten Stimulationsprotokolls, das aus 900 Bursts über eine Dauer von 15 Minuten besteht.

Zeichnen Sie dann die EPSP-Antworten des Feldes für längere Zeiträume auf, um die Transformation von frühem LTP in Eingabe S eins zu spätem LTP durch die Kreuzerfassung zu zeigen. In dieser Darstellung sind zwei stimulierende Elektroden im Schichtradiatom der CA-Region positioniert, um zwei unabhängige, aber überlappende synaptische Eingänge zu stimulieren. Auf CA ein Parametall-Neuronen zwei extrazelluläre Aufzeichnungselektroden.

Einer zur Aufzeichnung von F-E-P-S-P aus dem apikalen dendritischen Kompartiment. Und ein weiterer, der einen somatischen Populationsanstieg aus den Parametall-Zellkörpern aufzeichnet, befindet sich im Radiatom des Stratum bzw. im Stratum para. Diese Abbildung zeigt die Woche vor dem starken Paradigma zur Untersuchung von synaptischem Tagging und Capture.

Schwaches Tetin wird auf S eins angewendet, um frühes LTP zu induzieren, gefolgt von starkem Tetin von S zwei nach 30 Minuten, um spätes LTP zu induzieren, und diese Abbildung zeigt die Woche vor dem starken Paradigma zur Untersuchung von Cross-Tagging. Die frühe LTP wird durch schwaches Tetin in S eins induziert, gefolgt von der Induktion der späten LTD in S zwei unter Verwendung eines starken niederfrequenten Stimulationsprotokolls. Nach 30 Minuten in S eins wird das frühe LTP in ein spätes LTP umgewandelt, das sechs Stunden dauert und Cross-Tagging und Capture zeigt.

Einmal gemeistert, kann diese Technik des Sezierens und der Schnittvorbereitung sehr schnell innerhalb von drei bis fünf Minuten durchgeführt werden. Somit kann die Lebensfähigkeit der Slices für Langzeitaufnahmen erhalten werden. Mit dieser Methode kann man auch die Auswirkungen verschiedener pharmakologischer Wirkstoffe auf die synaptischen Tagging- und Capture-Prozesse testen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man langfristige funktionelle Plastizitätsexperimente durchführt und wie man synaptische Markierung und Erfassung durchführt.