Induktion Myointimale Hyperplasie Versus Atherosklerose in Mäuse: Eine Einführung von zwei gültigen Modelle

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, zwei valide Tiermodelle vorzustellen, die über unterschiedliche Mechanismen zu einer Verengung der Aorta führen. Das erste Modell ist die Ballonkatheterisierung der Aorta, um die Entwicklung einer myointimalen Hyperplasie zu erzeugen. Zunächst wird die infrarenale Bauchaorta freigelegt und abgeklemmt.

Dann wird die Aorta mit einem transversalen Schnitt eröffnet und der Ballonkatheter eingeführt. Das Endothel der Aorta wird anschließend mit dem aufgeblasenen Katheter abgeschält und die Operation abgeschlossen. Das zweite Modell ist eine fütterungsbedingte Modifikation transgener APOE-defizienter Mäuse zur Erzeugung atherosklerotischer Plaques.

Diese Mäuse werden unter Standardbedingungen gehalten und vier bis sechs Monate lang mit einer fettreichen westlichen Kost gefüttert. Die histologische Analyse der chirurgisch induzierten myointimalen Hyperplasie und des Modells der Ernährungsrestriktion zeigt schließlich, dass diese zu unterschiedlichen Lumeneinengungen führen. Heute stellen wir Ihnen zwei verschiedene Modelle zur Induktion einer Lumeneinengung vor: das Mausmodell, bei dem ein Ballonkatheter verwendet wird, um eine Gefäßverletzung zu erzeugen, und das Modell der arteriellen Sklerose.

Unter Verwendung transgener Mäuse in der westlichen Diät kann das Ballonkathetermodell helfen, zentrale Fragen im Bereich der Stenose zu beantworten. Das transgene homozygote obere E-Mutanten-Mausmodell wird zur Untersuchung der Pathophysiologie der Atherosklerose eingesetzt. Für das Modell der intimalen Hyperplasie beschaffen Sie C57BL/6J-Mäuse mit einem Gewicht von etwa 25 Gramm.

Halten Sie sie unter normalen Bedingungen mit einer normalen Ernährung. Nach der Anästhesie der Maus mit 2 % Isofluran schneiden Sie das Bauchfellhaar ab und verabreichen Carprofen subkutan zur Analgesie. Desinfizieren Sie die Haut anschließend abwechselnd mit Prov-Jod und 80 % Ethanol in zwei Zyklen.

Überprüfen Sie nun das Fehlen von Reflexen mittels einer Zehenquetschung. Beginnen Sie die Operation, indem Sie Haut und Muskulatur entlang der Linea alba trennen. Wickeln Sie danach die Därme in einen mit Kochsalzlösung angefeuchteten Handschuh und entfernen Sie sorgfältig das Fettgewebe, um die Bauchaorta freizulegen.

Legen Sie nun die infrarenale Aorta bis zu ihrer Bifurkation frei, wobei darauf geachtet werden muss, keine Seitenäste zu verletzen. Klemmen Sie nun die Aorta ab.

Platzieren Sie zuerst eine mikrochirurgische Klemme an der proximalen infrarenalen Aorta, um den Blutfluss zu unterbinden. Zweitens setzen Sie eine zweite distale Klemme nahe der Aortenbifurkation. Sobald der Blutfluss unterbrochen ist, führen Sie einen kleinen Schnitt in die Aorta nahe der proximalen Klemme ein.

Führen Sie den Katheter in Richtung der distalen Aortenklammer ein, um eine endotheliale Verletzung zu verursachen. Entfernen Sie das Aortenendothel, indem Sie den Katheterballon vorsichtig und langsam aufblasen und den Katheter in Richtung der proximalen Aortenklammer zurückziehen. Wiederholen Sie diesen Vorgang zweimal, sodass insgesamt drei Aufblasvorgänge an der Aorta durchgeführt werden.

Entfernen Sie nun den Katheter und schließen Sie den Aorteninschnitt mit fortlaufenden 10-au-Prolin-Nähten. Öffnen Sie bei vorhandener Blutung an der Aortotomiestelle vorsichtig die distale Klemme, solange die Nähte bereits gesetzt sind. Schließen Sie die Klemme erneut, lokalisieren Sie die Blutungsstelle und stillen Sie diese mit zusätzlichen Einzelknopfnähten.

Wenn keine Blutung auftritt, öffnen Sie langsam den proximalen Klemmverschluss. Ein aortaler Puls sollte distal zur Inzision sichtbar sein. Ordnen Sie nun die Därme in C zwei an.

Als Nächstes schließen Sie die Bauchwand, beginnend mit der Muskelschicht, unter Verwendung von sechs OTT-Proline-Laufnähten. Anschließend schließen Sie die Haut mit fünf OTT-Nähten und überführen die Maus zurück in ihren Käfig. Geben Sie während der ersten drei postoperativen Tage Metrazol über das Trinkwasser zur Schmerzkontrolle.

Überwachen Sie das Tier während seiner Erholungsphase, die etwa 28 Tage dauert. Für das Atherosklerose-Modell verwenden Sie vier Wochen alte A POE-defiziente Mäuse. Halten Sie diese Mäuse unter Standardbedingungen mit einer fettreichen westlichen Diät für vier bis sechs Monate.

Diese Diät während des gesamten Experiments beibehalten. Sechs Stunden vor der Entnahme der Aorta den Zugang zum Futter entziehen. Danach das Mäuschen gemäß der Beschreibung im vorherigen Abschnitt für die Operation vorbereiten.

Beginnen Sie die Operation mit dem Öffnen des Brustkorbs. Schneiden Sie danach die Herzspitze ab und perfundieren Sie das Herz unter leichtem Druck mit drei Milliliter 4 % Paraformaldehyd über die Aortenwurzel, um die Aorta zu fixieren. Trennen Sie anschließend die Aorta von der Wurzel bis zur Gabelung.

Versuchen Sie, so viel wie möglich Fettgewebe zu entfernen. Schneiden Sie anschließend den Aortenbogen ab und lagern Sie ihn in 4 % Paraformaldehyd. Überführen Sie nun das Herz und den Aortenbaum in eine mit PBS gefüllte Silikonlinie-Schale.

Schneiden Sie ein Ende des Aortenbaums ab und befestigen Sie es mit feinen Nadeln auf der Silikonschicht. Öffnen Sie die Aorta longitudinal und lassen Sie das Aortengewebe einige Minuten lang bei Raumtemperatur in PBS liegen. Spülen Sie das Gewebe anschließend einmal mit 50 % Ethanol und tauchen Sie es in ein Sudan-Bad ein.

Drei, Färbungslösung für etwa 15 Minuten. Nach der Färbung das Gewebe kurz mit 50 %igem Ethanol für einige Sekunden spülen, um lediglich überschüssiges Sudan zu entfernen. Übermäßiges Spülen würde zu viel Farbstoff entfernen; anschließend das Gewebe sofort mit destilliertem Wasser spülen und unverzüglich mit der Bildaufnahme fortfahren. Für das Myo-Intimalhyperplasie-Modell wurden entepithelialisierte Maus-Aorten entnommen, in Paraffin eingebettet und mit Chrom gefärbt. Die Verhältnisse wurden aus den Trichrom-Färbungsschnitten berechnet, indem die Dicke von Intima und Media gemessen wurde.

Mithilfe einer Computeranalyse und anschließender Berechnung des Verhältnisses wurde die maximale Plattendicke als maximale Intimadicke im Lumen mittels Computer-Morpho-Baum ermittelt. Der Prozentsatz der Lumenerklemmung wurde als Verhältnis des neuen inneren Lumens zum ehemaligen Lumen berechnet. Die Plaquefläche wurde berechnet, indem das neue innere Lumen vom ehemaligen Lumen subtrahiert wurde.

Dieselben Analysen wurden an dreifach gefärbten Querschnitten des Atherosklerosemodells am Aortenklappenbereich, am Aortenbogen und an der absteigenden Aorta ausschließlich für das Atherosklerosemodell durchgeführt. Die absteigende Aorta wurde longitudinal eröffnet und mit Sudanrot gefärbt. Die Plaquefläche und die gesamte Aortenfläche wurden mithilfe eines Computers gemessen zur Analyse beider Modelle.

Andere Methoden wie die histopathologische Untersuchung und die konfokale Immunfluoreszenzmikroskopie können durchgeführt werden, um Fragen bezüglich der luminalen Obliteration, der Morphologie und der Zellulärität zu beantworten. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.