Name: Induktion der Protein Deletion Durch In Utero Elektroporation, um Defizite in Neuronale Migration in Transgenic Models definieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-12T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 1 s
Description: Erfahren Sie die In-Utero-Elektroporation zur Analyse neuronaler Migrationsdefizite in transgenen Mausmodellen. Diese Methode ermöglicht gezielte Genmanipulation in spezifischen Hirnregionen für die Entwicklungsneurobiologie.

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Wir danken Pierre Mattar und Freda Miller für ihre Unterstützung bei der In-utero-Elektroporation und Noel Ghanem und Bensun Fong für die Erstellung von Diagrammen. Wir danken Linda Jui und Jason G. MacLaurin für die hervorragende technische Unterstützung. Die Ausrüstung wurde vom Centre for Stroke Recovery unterstützt.
Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium von HSFO und OGS an D.S.S. und ein CIHR-Stipendium für R.S.S. unterstützt.

HINWEIS: Alle Experimente wurden von der University of Ottawa Animal Care Ethikkommission genehmigt wurde, zu den Richtlinien des Canadian Council on Animal Care haften. 1. Präoperative Vorbereitung und Materialien <ol><li> Plasmidpräparation: <ol><li> Bereiten Plasmiden unter Verwendung des Qiagen MegaPrep nach dem Protokoll des Herstellers. Innoculate mindestens 400 ml LB-Medium mit transformierten Bakterien, um eine hohe DNA-Ausbeute zu gewährleisten und Inkubation über Nacht. </li><li> Resuspendieren Plasmid in 100-200 ul TE auf eine Endkonzentration von wenigstens 5 &amp; mgr; g / &amp; mgr; l. Aliquoten DNA und bei -20 ° C. Wenn die Konzentration zu niedrig ist, nicht ausfallen und Resuspendieren da dies Verunreinigungen hinzufügen. Starten Sie mit einem neuen Präparat. </li><li> Vor der Operation, verdünnte ein einzelnes Plasmid (Cre-GFP zum Beispiel) zu 2 ug / ul in sterilem Wasser mit 1 &amp; mgr; l von 0,1% (w / v) Fast Green Farbstoff pro 10 oder 20 &amp; mgr; l verdünnt Plasmidlösung. Wenn GFPund das Gen von Interesse sind, auf getrennten Plasmiden co-elektroporiert werden, spritzen die GFP-Plasmid und das Plasmid, das das Gen von Interesse in einem Verhältnis von 1: 4, um die Wahrscheinlichkeit zu maximieren, dass alle mit GFP markierten Zellen werden mit beiden co-elektroporiert Plasmide. </li></ol></li><li> Ziehen Glas Mikrokapillarröhrchen (1 mm Außendurchmesser - im Folgenden als Nadeln bezeichnet) auf einem Standard-Nadelzieher, mit einem einzigen Schritt Pull bei 62 ° C. </li><li> Autoklavieren eine chirurgische Packung, die die folgenden: Nadelhalter, Wundhaken, Zangen, Scheren für die Chirurgie, Scheren für Nadeln, Hefter, Heftklammern, Gaze, Wundabdeckungen, OP-Abdeckungen (1A, B, Werkstoff-Tabelle). </li><li> Sammeln Sie anderen erforderlichen Werkzeuge: Electroporator, FemtoJet Microinjecter, Tweezertrodes (5 oder 7 mm), Kochsalzlösung, Naht, 5-ml-Spritze (Werkstoff-Tabelle). </li></ol> 2. Bereiten Maus für Chirurgie <ol><li> Zur Schmerztherapie, spritzen ein zeitlich-pregnant Maus mit Buprenorphin (0,05 mg / kg Körpergewicht) eine Stunde vor der Operation. Wenden Sie dieses Protokoll, um Mäuse überall von embryonalen Tag 12,5 (E12.5) E17.5 zeitgleich. </li><li> Verwenden Sie Microloader Pipettenspitzen zu Back-Last gezogen Nadeln mit dem Plasmid-Lösung. Nicht ganz zu füllen nicht in die Spitze der Nadel noch da sonst die Nadel verstopft zu werden. </li><li> Betäuben Maus unter Verwendung von 2-5% Isofluran Gas mit 1 l / min O 2. Sobald unbeweglich, legen Sie in der Gesichtsmaske und wenden Salbe die Augen, um ein Austrocknen zu verhindern. Injizieren mit 1 ml Salzlösung (0,9% NaCl) subkutan im Rücken. HINWEIS: Bei der Arbeit mit Isofluran Gas, mit einem Gas-Scavenger, um überschüssiges Gas zurückerobern und verhindern, dass sie an der Flucht in den Raum. </li><li> Rasur Bauch. Waschen Sie Bauch mit Chlorohexadine Peeling, mit Wasser abspülen, und tragen Sie eine endgültige Lösung von prep chlorohexadine und 70% Ethanol. Abdeckung Maus mit sterilen Tuch oder Gaze zu Pelz ab, sondern lassen Leib ausgesetzt sind (Abbildung 1 C, D). </li></ol>In utero Elektroporation <ol><li> Einen Einschnitt in die Haut über dem Bauch zwischen den unteren Zitzen. Ziehen Sie die Haut von der zugrunde liegenden Muskelschicht durch Abreißen des Bindegewebes, dann durch das Bauchfell geschnitten in die Bauchhöhle entlang der Linea alba. Legen Sie die Wundhaken, um die Wundränder auseinander zu ziehen. </li><li> Entfernen Sie die Gebärmutter aus der Bauchhöhle und legte es wie gezeigt (Abbildung 1E). <ol><li> Wenn verschiedene Welpen mit verschiedenen Plasmiden (wie GFP gegen GFP mit dem Gen von Interesse) eingespritzt werden, zählen die Jungen auf jeder Seite und entscheiden, welche und wie viele mit jedem Plasmid injizieren. Ersetzen Sie eine Seite der Gebärmutter wieder in den Bauch, um die Embryonen warm und geschmiert zu halten. Sofort befeuchten ausgesetzt Gebärmutter mit Kochsalzlösung (vorzugsweise auf Körpertemperatur erwärmt). </li><li> Wenn die Injektion alle Welpen mit dem gleichen Plasmid (wie bei der Injektion Cre-GFP in transgenen Embryos) only entfernen ein Horn des Uterus zu einer Zeit. </li></ol></li><li> Setzen Sie einen geladenen Nadel im Spannkopf der Spritzstab und schneiden Sie vorsichtig die Spitze mit einem Paar von kleinen chirurgischen Schere oder feinen Pinzette. Schneiden Sie die Spitze, so dass die Nadel bleibt so lange wie möglich, während immer noch damit Fluid durch (Abbildung 1ji-iv) übergeben. <ol><li> Verstellbaren Länge der Injektion (in Sekunden) und der Einspritzdruck am Mikroinjektor so daß ein kleines, leicht sichtbare Tröpfchen von 0,1-0,2 &amp; mgr; l wird auf der Spitze der Nadel, wenn der Fuß Paddel gedrückt. Halten Sie die Lautstärke dieses Tröpfchen so konsistent wie möglich zwischen verschiedenen Nadeln. Hinweis: Dieser Schritt ist entscheidend für das Überleben Embryo (siehe Diskussion). </li><li> Verwenden Sie die folgenden Einspritzparameter für den FemtoJet: Injektion Druck (pi) = 250-300 hPa; Einspritzzeit (ti) = 0,8-1,2 sec; Kompensationsdruck = 10 bis 50 hPa. Falls erforderlich, stellen Sie diese Parameter, um Unterschiede zwischen den Nadeln unterzubringen. </li></ol></li><li> Swählt einen Embryo und sanft positionieren Sie es auf dem Rücken, den Kopf nach oben geneigt (1F). HINWEIS: Dies kann erfordern, Drehen oder Verschieben des Embryos; darauf achten, nicht zu viel Druck anwenden und vermeiden Ruptur der Fruchtblase, während die Manipulation des Embryos. </li><li> Sobald der Embryo vorhanden ist, suchen Sie die Herzkammer, die als halbmondförmigen Schatten parallel zum Sinus sagittalis präsentiert. Berühren Sie die Spitze der Nadel in die Gebärmutter über der Herzkammer in einem leichten Winkel und führen Sie die Nadel durch die Gebärmutterwand. Der erforderliche Druck hängt von der Schärfe der Nadel. Die Nadel in die Rinde in die Herzkammer. HINWEIS: Auch wenn es selten jede zusätzliche nachweisbar Widerstand, Leiter des Embryos wird oft weg leicht geschoben und dann zurückweicht, wenn die Nadel durch die Rinde in die Herzkammer führt. </li><li> Pumpen Sie den Fuß Paddel, um das Plasmid-Lösung zu injizieren. Weiter zu pumpen, bis ein grüner Bereich sichtbar und entspricht derBogenform des Ventrikels (Figur 1G). In jungen Embryonen (E12.5 bis E14.5) der Farbstoff oft diffundieren in die kontralaterale Ventrikels. HINWEIS: Die Anzahl von Pumpen ist abhängig vom Durchmesser der Nadelspitze, dem Alter des Embryos (und resultierende Größe des Ventrikels) und dem gewünschten Einspritzvolumen. Halten Volumen zwischen Embryonen injiziert so konsistent wie möglich. </li><li> Injizieren drei oder vier Embryonen. Bewahren Sie alle exponierten Embryonen feucht mit Kochsalzlösung im gesamten Verfahren. </li><li> Zurück zu den ersten Embryonen injiziert und legen die Paddel, so daß die positive Elektrode, die das Plasmid in die gewünschte Region des Gehirns (Abbildung 1H) ziehen. Winkel der negativen Elektrode, so dass der kürzeste Weg zwischen den Elektroden direkt durch die Struktur zur Elektroporation gezielte (Abbildung 2). </li><li> Sobald die Paddel sind vorhanden, wenden Sie den Schock. Je nach Alter und Größe des Embryos, nutzen 5 Impulse von 35-50 V (siehe TLage 1). Verwenden Sie die folgenden Elektroporationsparameter: Impulslänge von 5 ms mit einer Impulspause von 950 ms. Wiederholen Sie dies mit allen injizierten Embryonen. </li><li> Schneiden Sie die Spitze der neuen vorinstallierten Nadel, wie in Schritt 3.3 als die letzte Nadel wahrscheinlich, getrocknet und im Schritt 3.9 verstopft. Injizieren Sie die nächste Gruppe von drei oder vier Embryonen entweder mit dem gleichen Plasmid oder einem anderen Plasmid und dann den Schock wie in Schritt 3.9. Wenn alle Welpen in einer Seite der Gebärmutter injiziert werden, entfernen Sie die zweite Seite der Gebärmutter von Bauch des Weibchens und ersetzen Sie dann die fertige Seite, um sie warm zu halten. </li><li> Zurück auf beiden Seiten der Gebärmutter auf die weibliche darauf achten, die Oberfläche feucht mit Kochsalzlösung und nicht zu halten, um zu viel Druck, um Verletzungen der Fruchtblasen zu verhindern. Naht der Muskelschicht geschlossen mit einem einfachen kontinuierlichen Stich. Staple die Haut verschlossen. Wenn Heftklammern nicht verfügbar sind, nähen die Haut mit einer einfachen unterbrochenen Stich. (1I) </li><li> Während suturing, schrittweise reduzieren Sie die Isofluran-Narkose, damit der schwangeren Weibchens zu erhellen. Hinweis: Dies wird Erregung des Dammes zu beschleunigen, nachdem die Operation abgeschlossen ist; Halten des weiblichen für so kurze Zeit wie möglich wird Embryo Überleben verbessern betäubt. Gesamtoperationszeit, ab wann sich der weibliche zunächst betäubt, sollte ca. 30 min. </li></ol> 4. Nachsorge <ol><li> Legen Sie die Naht weiblichen in einem Brutschrank oder auf einem Heizkissen, um aus der Narkose zu erholen. Bed sie auf saubere Bettwäsche und legen Sie ein Standard-Recovery-Gel in den Käfig zu halten Feuchtigkeit. Für die Schmerztherapie nach einer Operation, ergeben die weiblichen drei Dosen von Buprenorphin (0,05 mg / kg Körpergewicht) in 8 Stunden Intervallen nach der Operation erhalten die vier zusätzlichen Dosen in 12 Stunden Intervallen. </li></ol> 5. Ernten Brains HINWEIS: Brains kann in jedem Alter bis zum Erwachsenenalter geerntet werden. Es giltzum Sammeln Gehirn vor der Geburt. Beachten Sie, dass einmal Welpen geboren werden, die Reihenfolge in der Gebärmutter ist verloren, also entweder alle Welpen im Wurf mit der gleichen Plasmid injiziert werden, oder ein anderes Verfahren zur Differenzierung zwischen Kontroll- und Versuchstiere müssen entwickelt werden. <ol><li> Bereiten kaltem (4 ° C) und filtriert, 4% Paraformaldehyd (PFA) vor euthanizing weiblich. </li><li> Euthanize das weibliche Verwendung einer intraperitonealen Injektion einer letalen Dosis von Natrium-Pentobarbital (100 mg / kg Körpergewicht) und aufgeschnitten Abdomen. Ziehen Sie beide Seiten der Gebärmutter und das Layout wie der Jungtiere zunächst injiziert. <ol><li> In dem Fall, wo alle Jungtiere erhielten die gleiche Plasmid wie beim Injizieren Cre zu einer transgenen Wurf ist Embryo Reihenfolge unwichtig, deshalb schneiden den Uterus aus dem weiblichen und in PBS. </li><li> Bei Jungtieren wurden mit verschiedenen Plasmiden injiziert ist, lesen Sie jeden Welpen zu finden und stellt fest, tote Jungtiere, und festzustellen, welche mit Steuer und experimen injiziert wurdental Plasmiden vor dem Entfernen der Gebärmutter vom Weibchen. Achten Sie darauf, den Überblick zu behalten, welche Welpen zu welcher Gruppe nach der Uterus in PBS. </li></ol></li><li> Nehmen Sie jedes Welpen einzeln, enthaupten mit einer scharfen Schere oder einer Rasierklinge und legen den Kopf in PBS. Im Falle von transgenen Mäusen, sammeln Gewebeproben für die Genotypisierung und halten jeden Kopf getrennt, wie in einer 12-Well-Platte. </li><li> Unter einem Binokular, entfernen Sie das Gehirn aus dem Schädel, man aufpassen, nicht nick die Rinde oder reißen die Mittellinie. Mit einem Fluoreszenzmikroskop, prüfen Sie, ob Gehirne haben eine GFP + Patch, was darauf hinweist, dass sie erfolgreich elektroporiert wurden. </li><li> Fix Gehirn durch Eintauchen in PFA bei 4 ° C über Nacht. HINWEIS: Überprüfen Sie Gehirne für die Expression von GFP vor der Fixierung seit PFA oft das Signal löscht. </li><li> Cryoprotect Gehirn durch Eintauchen in 20% Saccharose für mindestens drei Tage vor dem Einfrieren. Verwenden einen Saccharosegradienten von 10%, 15% und 20% (24 h in jeder Lösung) to verhindern Gewebeschädigung durch osmotischen Druck. Bewahren gefrorenen Gehirne bei -80 ° C und auf einem Kryostat geschnitten auf 10-14 um dicke Abschnitte. </li></ol> 6. Co-Färbung mit anti-GFP HINWEIS: Wenn Antigen-Retrieval, um Co-Fleck mit anti-GFP notwendig ist, ist es wichtig, eine schonende Antigen-Retrieval-Protokoll, das die GFP-Signal nicht beeinträchtigt verwenden. Einige Antigen-Retrieval-Protokolle sind zu hart, um in Verbindung mit der GFP-Färbung (sogar mit einem Antikörper gegen GFP) zu verwenden. Eine grundlegende Zitronensäure Vorbehandlung vor dem Aufbringen des primären Antikörpers ist erfolgreich für die meisten Epitope 24. <ol><li> Machen Sie eine 0,01 M Lösung von Zitronensäure in ddH 2 O. pH 6 unter Verwendung eines kalibrierten pH-Meters. </li><li> Wärme Zitronensäure in Färbung Kammer in Mikrowelle oder Wasserbad, bis Zitronensäure erreicht 75 bis 80 ° C. Legen Sie Folien in Färbung Kammer für 10-15 min. Haltetemperatur so stabil wie möglich. </li><li> Waschen Sie Dias in PBS3x für 3 min bei Raumtemperatur. Übernehmen Sie die primären Antikörper und fahren Sie mit Immunfärbung nach einem Standardprotokoll. </li><li> Bestätigen Cre vermittelte Exzision durch Co-Kennzeichnung für GFP und des Gens von Interesse zu bestätigen, knock down (3A). </li></ol>

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Die Autoren haben nichts offenzulegen

Zwei der wichtigsten Herausforderungen bei der Durchführung in utero Elektroporationen sind 1) verhindert Embryoletalität und 2) abnehmende Variabilität zwischen Elektroporationen. Einer der wichtigsten Faktoren bei der Vermeidung Letalität ist Nadelqualität, da stumpfe Nadeln verursachen mehr Schaden an dem Embryo. Beim Schneiden der Nadel, halten Sie die Spitze so lange wie möglich während immer noch eine sichtbare Tröpfchen von 0,1-0,2 &amp; mgr; l der Flüssigkeit zu erscheinen im Anschluss an eine Pumpe des...

Radial Migration ist ein zentraler Prozess zur frühen kortikalen Entwicklung. Es hängt von einer Vielzahl von Zell autonomen Faktoren wie korrekte mitotischen Ausfahrt und die neuronale Differenzierung, Zellpolarität, die Regulierung des Zytoskeletts und die Expression des Transmembran-Rezeptoren, wie auch nicht-zell autonomen Faktoren, wie die Bildung von radialen Gliazellen Gerüst und Sekretion der Migrationsberatung Moleküle 1-3. Da Störungen einer dieser Mechanismen neuronaler Migration in einem transgenen Mausmodell 4-8 In utero Elektroporation (IUE) beeinträchtigt, die Bestimmung der Ursache eines Fehlers in der Migration kann ein komplexer und schwieriger Prozess sein. Kann verwendet werden, zu ergänzen und zu vereinfachen Interpretation des Phänotyps einer genetischen Knock-out-Modells und damit wichtige Mechanismen aufzuklären radiale Migration 7,9-11 erforderlich. In utero Elektroporation (IUE) ist der Vorgang, bei dem ein Plasmid carryi<html> ng sowohl ein Gen von Interesse und ein Reportergen in die Ventrikel des Gehirns eines Maus oder Rattenembryo injiziert und dann in die Zellen der Herzkammer durch Anwendung eines elektrischen Stroms 12-14 gezogen. Dies ermöglicht dem Prüfer, die Wirkung der nach oben oder unten Regulation eines Gens von Interesse in der Entwicklung oder Funktion elektroporiert Neuronen zu analysieren. Nach IUE können Gehirne für die Immunhistochemie 7,9-11, Elektrophysiologie 15 oder Zellkultur 16,17 verarbeitet werden. Der große Vorteil ist, dass IUE wird ermöglicht hochspezifische Manipulation der Genexpression. Weiterhin kann IUE verwendet, um einen bestimmten Bereich des sich entwickelnden Gehirns durch einen gerichteten Strom (Abbildung 2) zu zielen. IUE können auch verwendet werden, um einen spezifischen Zelltyp, durch Injektion von Plasmiden, die Gene unter der Kontrolle von verschiedenen Promotoren oder Plasmid Aktivierungssysteme abzuzielen (Tetracyclin induzierte Genexpression ist ein Beispiel) 10,18-21. jove_content &quot;&gt; IUE kann in Verbindung mit dem Cre-Lox-vermittelten Gen Exzision System 7-9,11,22 verwendet werden. kann ein Plasmid, das ein Gen, das die Nachricht für die Cre-Protein kodiert, in einen Embryo homozygot für das Allel floxed (elektroporiert werden in denen das Gen oder spezifische DNA-Regionen werden durch zwei loxP-Stellen für Cre-vermittelte DNA-Rekombination) flankiert. Cre dann induzieren Rekombination des Gens von Interesse spezifisch in elektroporiert neuralen Vorläuferzellen, Erzeugen eines Knock-out des floxed allele.The Wirkung Protein auf neuronale Migration und Entwicklung in einzelnen Neuronen Knockdown kann dann untersucht werden. Die Elektroporation von Cre Rekombination induziert in nur einer kleinen Population von betroffenen Zellen, so dass die Unterstützung von Umwelt intakt. Im Gegensatz dazu gewebespezifische Expression von Cre unter der Kontrolle eines zelltypspezifischen Promotor, tritt während des gesamten Gewebes, so daß beide Migration Neuroblasten und der Umgebung beeinträchtigt werden. So juxtaposition dieser beiden Ansätze können bestimmen, ob ein bestimmter Migrationsdefekt aufgrund autonomer oder Zell nicht autonomen Mechanismen der Zelle ist. Defekte Migration in beiden experimentellen Systemen legt nahe, dass die beobachteten Phänotyp resultiert aus einer Zelle autonom Mechanismus; normaler Migrations nach Elektroporation von Cre mit defekten Migration auf eine gewebespezifische Cre Modell zeigt, dass das Gen von Interesse durch eine nicht-zell autonomen Mechanismus wirkt. IUE kann auch verwendet werden, um Rettungsversuche durch Elektroporation potenzielle Interaktion von Genen in Knock-out-Tiere 7,9,10 durchzuführen. Zum Beispiel könnte ein Forscher versucht, eine Migration Phänotyp in einer transgenen Modells durch Elektroporation ein stromabwärtiges Ziel und Bestimmen, ob die Migration Defekt in elektroporierten Neuronen korrigiert retten. Dies hat den zusätzlichen Vorteil, dass ein erfolgreicher Rettungs zeigt an, daß normale Migration kann durch Manipulieren der Proteinexpression in einer spe wiederhergestelltsche Neuron, obwohl die Umgebung noch defizient Zielgens. Wiederum ist dieser Ansatz mehr Zeit und kostengünstiger als die Kreuzung oder transgene Linien, mit dem zusätzlichen Vorteil der Bestimmung, ob der defekte Mechanismus Zelle autonom. IUE verwendet werden, um die Migration zu verfolgen Neuronen durch Elektroporation von einem Reporter-Plasmid in Knock-out-Embryonen (4C) werden. Da nur die Neuronen Auskleidung der Herzkammer zu der Zeit der Operation werden elektroporiert 17 kann IUE verwendet, um die Nervenzellen zu einem bestimmten Zeitpunkt mit dem Vorteil der Visualisierung ihrer Morphologie in vivo geboren folgt. Schließlich ist es möglich, IUE wie der medialen oder dorsalen Telencephalon, Hippocampus oder Ganglienhügel (Abbildung 2) zu verwenden, um Hirnregionen gezielt. Dies gibt Forschern die Möglichkeit Genfunktion in einem bestimmten Bereich unabhängig von Komplikationen zu untersuchendie sich aus Protein in benachbarten Strukturen Knockdown. Retinoblastom Protein (pRb), p107 und p130 umfassen die Tasche Proteinfamilie und sind gut etabliert Regulatoren des Zellzyklus zu beenden. Allerdings gibt es immer mehr Anzeichen dafür, dass diese Proteine ​​des Zellzyklus unabhängige Aspekte der neuralen Entwicklung regulieren auch. Wie wir bereits gezeigt haben, pRb und p107 spielen eine entscheidende Rolle in beiden tangentialen 4,23 und radiale Migration 6. Hier zeigen wir die Rolle der Tasche Proteinfamilienmitglieder pRb und p107 neuronaler Migration 6, den Einsatz von in utero Elektroporation von Cre in einem transgenen Modell veranschaulichen. Zusammengefasst stellt IUE eine leistungsfähige Möglichkeit zum Analysieren Zelle autonom Wirkungen der Gen-Deletion (oder Überexpression). Wenn mit gewebespezifischen Knock-out-Modelle kombiniert werden, können IUE zusätzliche Informationen über die Mechanismen, die neuronale Migration bieten.

<table><tbody><tr><td>ECM 830 Rechteck-Elektroporator</td><td>BTX Harvard Apparat</td><td>45-0052</td><td>Nur Elektroporator &ndash; Kabel separat kaufen (45-0204)</td></tr><tr><td>1250FS Fußschalter für ECM 830</td><td>BTX Harvard Gerät</td><td>45-0211</td><td>Fußpaddel ist für freihändige Elektroporation erforderlich</td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>BTX Harvard Apparatus</td><td>45-0489 (5mm)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 45-0488 (7mm)</td><td>Platin-Pinzettenelektroden</td></tr><tr><td>Femtojet</td><td>Eppendorf</td><td>920010504</td><td>Microinjector</td></tr><tr><td>Griphead 0</td><td>Eppendorf</td><td>920007414</td><td>Hält die gezogene Nadel</td></tr><tr><td>Universal-Kapillarhalter</td><td>Eppendorf</td><td>920007392</td><td>Verbindet den Griphead mit</td></tr><tr><td>dem Schlauch Injektionsschlauch</td><td>Eppendorf</td><td>920007431</td><td>Verbindet den Kapillarhalter mit dem Femtojet</td></tr><tr><td>Fußschalter</td><td>Eppendorf</td><td>920005098</td><td>Fußpaddel für freihändige Injektion</td></tr><tr><td>Microloader-Spitzen</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td>Spitzen zum Laden der gezogenen Kapillarröhrchen</td></tr><tr><td>Plasmid Mega Kit</td><td>Qiagen</td><td>12181</td><td>5 QIAGEN-tip 2500, Reagenzien, Puffer</td></tr><tr><td>Fast Green FCF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7252-5G</td><td>Ungiftiger Farbstoff</td></tr><tr><td>Extra feine Bonner Schere</td><td>Fine Science Tools</td><td>14084-08</td><td>Zum Trimmen der Nadeln</td></tr><tr><td>Bonn Strabismus Schere</td><td>Fine Science Tools</td><td>14084-09</td><td></td></tr><tr><td>Graefe Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11050-10</td><td>Gerade</td></tr><tr><td>Colibri Retraktoren</td><td>Fine Science Tools</td><td>17000-03</td><td></td></tr><tr><td>Tacker</td><td>Fine Science Tools</td><td>12031-07</td><td>Für 7mm Clips</td></tr><tr><td>Castroviejo Nadelhalter</td><td>Medizinische Werkzeuge</td><td>SNH-6737</td><td>Gerade, mit Schloss</td></tr><tr><td>Nadelabzieher</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td>Zum Ziehen von Mikrokappillaren</td></tr><tr><td>Mikrokapillaren</td><td>Drummond</td><td>1-000-800</td><td>0,4 mm Innendurchmesser Glaskapillarrohre</td></tr></tbody></table>

induktion der protein deletion durch in utero elektroporation, um defizite in neuronale migration in transgenic models definieren

Induction of Protein Deletion Through In Utero Electroporation to Define Deficits in Neuronal Migration in Transgenic Models

Genetische Löschen mit Hilfe des Cre-Lox-System in transgenen Mauslinien ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Proteinfunktion zu untersuchen. Außer in sehr spezifische Cre-Modelle, Deletion eines Proteins während eines Gewebe- oder Zellpopulation führt häufig zu komplexen Phänotypen aus mehreren zusammenwirkenden Mechanismen resultieren. Bestimmen, ob ein Phänotyp Ergebnisse Störung einer Zelle autonom Mechanismus, der untrennbar mit der betreffenden Zelle, oder von einem nicht-zellautonomen Mechanismus ein, wodurch Beeinträchtigung der Umgebung dieser Zelle führen würde, kann schwer zu erkennen sein. Um einen Einblick in die Proteinfunktion in einem in vivo-Kontext zu ermöglichen, in utero Elektroporation (IUE) ermöglicht Gendeletion in einer kleinen Untergruppe von Zellen innerhalb des Entwicklungsrinde oder einem anderen ausgewählten Hirnregion. IUE können bestimmte Gehirnbereiche, einschließlich der dorsalen Telencephalon, Endhirn medialen, Hippocampus oder Ganglienhügel zielen werden. Dies erleichtert die Beobachtung of die Folgen der Zelle autonom Gendeletion im Rahmen einer gesunden Umwelt. Das Ziel des Protokolls ist es, zu zeigen, wie IUE können zur Unterscheidung zwischen den Zell autonom und nicht zell autonome Wirkungen von Protein Löschung verwendet werden, um einen Defekt in radiale Migration in einer floxed transgene Mauslinie zu analysieren, mit einem Schwerpunkt. Durch den Vergleich des Phänotyps, die aus Gen-Deletion innerhalb des gesamten Kortex im Vergleich IUE-vermittelte Gen-Deletion in einem begrenzten Zellpopulation, einen besseren Einblick in die Proteinfunktion in der Entwicklung des Gehirns kann als mit beiden Techniken in Isolation erreicht werden.

Unterschiedliche Bereiche des Gehirns können durch Variation der Ausrichtung der Plattenelektroden über dem Kopf des Embryos für die Elektroporation gezielt werden (Abbildung 2). Für alle Teile des Vorderhirns wird das Plasmid in das Seitenventrikel injiziert (das Rückenmark kann durch Injektion in das vierte Ventrikel angepeilt werden). Im Allgemeinen sollten die Elektroden so platziert werden, dass die Gerade zwischen ihnen durch den interessierenden Bereich verläuft, wobei die DNA zum positiven Elektr...

Die Migration von Neuronen wird durch zahlreiche zellautonome und nicht-zellautonome Faktoren reguliert. Dieses Protokoll zeigt, wie die In-utero-Elektroporation verwendet werden kann, um festzustellen, ob ein Phänotyp in einer transgenen Maus auf eine Störung eines zellinternen Mechanismus oder eine Beeinträchtigung der Interaktion zwischen dem Neuron und seiner Umgebung zurückzuführen ist.

Induktion der Protein Deletion Durch In Utero Elektroporation, um Defizite in Neuronale Migration in Transgenic Models definieren

Genetic deletion using the Cre-Lox system in transgenic mouse lines is a powerful tool used to study protein function. However, except in very specific ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, Defekte in der neuronalen Entwicklung und Migration in transgenen Mausmodellen mittels in utero-Elektroporation verschiedener Regionen des embryonalen Vorderhirns zu analysieren. Dies wird erreicht, indem ein Plasmid, das Gene für Cree und ein Reporterprotein wie GFP trägt, in den Ventrikel eines embryonalen Gehirns injiziert und ein elektrischer Strom an den Kopf angelegt wird, um dieses Plasmid in die Zellschleimhaut des Ventrikels zu ziehen. In einem zweiten Schritt werden die Embryonen in die Bauchhöhle des Muttertiers zurückgebracht, damit sich die Embryonen weiter entwickeln können, während die Falte exprimiert wird und die Genentfernung spezifisch in den elektroporierten Neuronen vermittelt.Als nächstes werden Embryonen entnommen und die Gehirne für die Analyse fixiert, um die Wirkung der CRE-vermittelten Genexzision und des anschließenden Protein-Knockdowns in den elektroporierten Neuronen zu bestimmen. Es werden Ergebnisse erhalten, die zeigen, wie die Exzision des interessierenden Gens die neuronale Entwicklung und Migration auf zellspezifische Weise mit Hilfe der Immunhistochemie reguliert. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie z.B. gewebespezifischen transgenen CRE-Linien, besteht darin, dass die Elektroporation von Cree das interessierende Gen nur aus einer kleinen Population von Neuronen in einer vom Forscher ausgewählten Region des Gehirns herausschneidet, was die Ergebnisse erheblich vereinfacht und die Phänotypanalyse erleichtert. Die visuelle Demonstration dieser Technik ist von entscheidender Bedeutung, da die chirurgischen Schritte sehr schwer zu erlernen sein können und die Embryonen in diesem Stadium sehr empfindlich sind und leicht versehentlich beschädigt werden können.Verdünnen Sie vor der Operation ein einzelnes Plasmid auf zwei Mikrogramm pro Mikroliter in sterilem Wasser mit einem Mikroliter von 0,1 % Gewicht pro Volumen schneller grüner Farbstoff pro 10 oder 20 Mikroliter verdünnter Plasmidlösung. Ziehen Sie als Nächstes die Mikrokapillarröhrchen aus Glas auf eine Standard-Mikropipette, polar in einem einzigen Schritt von 62 Grad Celsius. Verwenden Sie dann die Pipettenspitzen des Mikroladers, um die gezogenen Nadeln mit Plasmidlösung nach hinten zu laden.Füllen Sie die Nadel nicht ganz in die Nadelspitze, da dies dazu führt, dass die Nadel verstopft. Bei diesem Verfahren wird ein Hautschnitt über dem Bauch zwischen den unteren Tets einer betäubten schwangeren Maus vorgenommen. Ziehe die Haut von der darunter liegenden Muskelschicht weg, indem du das Bindegewebe zerreißt.Schneiden Sie dann durch das Bauchfell in die Bauchhöhle entlang des linearen Ellenbogens. Führen Sie den gewickelten Retraktor ein, um die Ränder auseinander zu ziehen. Entfernen Sie dann die Gebärmutter aus der Bauchhöhle und legen Sie sie wie abgebildet aus.Wenn verschiedene Welpen mit unterschiedlichen Plasmiden injiziert werden sollen, zählen Sie die Welpen auf jeder Seite und entscheiden Sie, welche und wie viele mit jedem Plasmid injiziert werden sollen. Bringen Sie eine Seite der Gebärmutter zurück in den Bauch, um die Embryonen warm zu halten, und befeuchten Sie die freiliegende Gebärmutter sofort mit warmer Kochsalzlösung. Führen Sie anschließend eine geladene Nadel in den Griffkopf des Injektionsstabs ein. Schneiden Sie die Spitze vorsichtig mit einer kleinen chirurgischen Schere oder einer feinen Pinzette so ab, dass die Nadel so lange wie möglich bleibt und trotzdem Flüssigkeit durchgelassen wird.Stellen Sie dann die Länge der Injektion und den Injektionsdruck am Mikroinjektor so ein, dass ein kleines, aber gut sichtbares Tröpfchen von 0,1 bis 0,2 Mikrolitern auf der Nadelspitze erscheint. Wenn das Fußpaddel gedrückt wird, halten Sie das Volumen dieses Tröpfchens zwischen den verschiedenen Nadeln so gleichmäßig wie möglich. Wählen Sie nun einen Embryo aus und positionieren Sie ihn vorsichtig auf dem Rücken, wobei der Kopf nach oben geneigt ist.Sobald der Embryo an Ort und Stelle ist, lokalisieren Sie den Ventrikel, der sich als halbmondförmiger Schatten parallel zum Sinus sagittalis präsentiert. Berühren Sie die Gebärmutter oberhalb des Ventrikels in einem leichten Winkel mit der Nadelspitze und führen Sie die Nadel durch die Gebärmutterwand. Schieben Sie dann die Nadel durch die Hirnrinde in die Herzkammer.Pumpen Sie anschließend das Fußpaddel, um die Plasmidlösung zu injizieren. Pumpen Sie weiter, bis eine grüne Fläche sichtbar ist, die sich der Bogenform des Ventrikels anpasst. Bei jungen Embryonen diffundiert der Farbstoff oft in den kontralateralen Ventrikel.Injizieren Sie insgesamt etwa drei oder vier Embryonen und halten Sie alle freiliegenden Embryonen während des gesamten Eingriffs mit Kochsalzlösung feucht. Beginnen Sie mit dem ersten injizierten Embryo und platzieren Sie die Paddel so, dass die positive Elektrode das Plasmid in die gewünschte Region des Gehirns zieht. Winkeln Sie die negative Elektrode so an, dass der kürzeste Weg zwischen den Elektroden direkt durch die für die Elektroporation vorgesehene Struktur verläuft.Sobald die Paddel an Ort und Stelle sind, betätigen Sie den Stoßdämpfer. Verwenden Sie je nach Alter und Größe der Embryonen fünf Impulse mit 35 bis 50 Volt, fünf Millisekunden Impulslänge und 950 Millisekunden Impulsintervall. Für die Elektroporation wiederholen Sie den Vorgang mit allen injizierten Embryonen.Bringen Sie anschließend beide Seiten der Gebärmutter zur Maus zurück. Achten Sie darauf, die Oberfläche mit Kochsalzlösung feucht zu halten und nicht zu viel Druck auszuüben, um ein Trauma des Fruchtwassersaxophons zu vermeiden. Als nächstes vernähst du die Muskelschicht mit einem einfachen Endlosstich.Tackern Sie dann die Haut zu. Bereiten Sie nun vier Grad Celsius gefiltertes 4%PFA vor. Nachdem Sie das Tier mit einer intraperitonealen Injektion einer tödlichen Dosis Natrium-Pentobarbital eingeschläfert haben, schneiden Sie den Bauch auf.Ziehen Sie dann beide Seiten der Gebärmutter heraus und legen Sie sie so aus, wie die Welpen zum ersten Mal injiziert wurden. Wenn den Welpen verschiedene Plasmide injiziert wurden, stellen Sie sicher, dass Sie jeden Welpen lokalisieren und alle toten Welpen vermerken, und bestimmen Sie, welchen Welpen Kontroll- und experimentelle Plasmide injiziert wurden. Bevor Sie die Gebärmutter des Weibchens entfernen, entfernen Sie jedes Jungtier einzeln aus der Gebärmutter und dem Fruchtblasensack.Enthaupte ihn mit einer scharfen Schere oder einer Rasierklinge und lege den Kopf in PBS. Im Falle von transgenen Mäusen entnehmen Sie Gewebeproben für die Genotypisierung und halten Sie jeden Kopf getrennt, z. B. in einer 12-Well-Platte unter einem Präparierfernrohr, entfernen Sie das Gehirn aus dem Schädel, wobei Sie darauf achten, dass die Rinde nicht eingekerbt oder die Mittellinie gerissen wird. Überprüfen Sie mit einem Fluoreszenzmikroskop, ob die Gehirne ein GFP-positives Pflaster haben, das anzeigt, dass sie erfolgreich elektroporiert wurden.Fixieren Sie anschließend das Gehirn über Nacht in PFA bei vier Grad Celsius. Erhitzen Sie nun Zitronensäure, wo der pH-Wert zuvor auf sechs eingestellt war, in einer Färbekammer in der Mikrowelle oder im Wasserbad, bis sie 75 bis 80 Grad Celsius erreicht. Legen Sie dann die Objektträger für 10 bis 15 Minuten in die Färbekammer.Waschen Sie anschließend die Objektträger in PB S3 jeweils drei Minuten lang bei Raumtemperatur. Tragen Sie den Primärantikörper auf und fahren Sie mit der Immunfärbung gemäß einem Standardprotokoll fort. Validieren Sie dann die CRE-vermittelte Exzision durch Co-Markierung für GFP und das interessierende Gen, um den Knockdown zu bestätigen.Diese Abbildung zeigt die Bestätigung der CRE-vermittelten Exzision durch cos-Färbung für ein nachgeschaltetes Ziel des deletierten Gens. RB beflockt, P 1 0 7 knockout P one 30 beflockte Embryonen wurden entweder mit dem leeren PCI zwei Plasmid oder dem PCI zwei Cree Plasmid elektroporiert und für GFP und KI 67 gefärbt. Ein Marker für die Zellproliferation.Doppelt gefärbte Zellen wurden in Neuronen beobachtet, die mit Cree elektroporiert waren, aber nicht in Neuronen. Elektroporiert mit psig. Allein zwei.Die Exzision von RB wurde auch durch PCR mit Genotypisierungsprimern auf DNA bestätigt, die aus den von den Objektträgern entnommenen Gewebeschnitten extrahiert wurde. Das obere Band repräsentiert das F-Flox-Allel und das untere Band das Wildtyp-Allel. Der Pfeil zeigt das exzidierte Allel in der elektroporierten Seite des Gehirns.Nur die CRE-vermittelte Exzision kann auch in vitro mit Plasmiden mit beflockten Stoppcodons bestätigt werden. Vor dem RFP wie NL DS Red RFP wird nur in den EK-Zellen exprimiert, wenn die Rippe mit Cree GFP in HEK 2 93 Zellen transfiziert wurde, was darauf hindeutet, dass die Exzision erfolgreich war. Nach dieser Technik wurde eine erfolgreiche Exzision durchgeführt. Andere Methoden wie Zellkultur, Immunhistochemie oder Elektrophysiologie können verwendet werden, um zusätzliche Fragen zur Entwicklung und Funktion einzelner Neuronen nach einer c median Genexzision zu beantworten.Nachdem Sie sich diese Technik angesehen haben, können Sie sehen, wie die In-utero-Elektroporation verwendet werden kann, um die verschiedenen Regionen des Gehirns zu erreichen, und dies kann wirklich helfen, einige dieser komplexen Phänotypen zu verstehen, die wir bei verschiedenen transgenen Tieren haben.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

In utero Elektroporation ist eine wertvolle Methode zur Transfektion von neuronalen Vorläuferzellen in vivo. Abhängig von der Platzierung der Elektroden und der Entwicklungspsychologie Zeitpunkt der Elektroporation können bestimmte Teilmengen von kortikalen Zellen ausgerichtet werden. Gezielte Zellen können dann in vivo oder in vitro für die Auswirkungen der genetischen Veränderung untersucht werden.

In utero Elektroporation gefolgt von primären neuronalen Kultur für ein Studium Gene Function in Subset von kortikalen Neuronen

In utero Elektroporation ermöglicht eine schnelle Gentransfer in eine räumlich-und zeitlich kontrollierten Art und Weise in den Entwicklungsländern das zentrale Nervensystem (ZNS). Hier beschreiben wir eine sehr anpassungsfähig in utero Elektroporation Protokoll, mit dem Ausdruck Konstrukte in mehreren embryonalen ZNS-Domänen, einschließlich der Telencephalon, Diencephalon und der Netzhaut liefern können.

Effiziente Gene Lieferung in mehrere ZNS Territories mit In Utero Elektroporation

Ein Gentransfer-Methode in den Entwicklungsländern Gehirn der Maus ist mit einer einzigartigen chirurgischen Verfahren und spezielle Form der Elektroden beschrieben. Diese einzigartige Technik erlaubt die Transfektion von Plasmid-DNA zeitlich und räumlich, was viele Neurowissenschaftler in das Studium der Entwicklung des Gehirns wird die Beihilfe.

Maus in Utero Elektroporation: Kontrollierte Spatiotemporal Gene Transefection

Dieses Protokoll beschreibt im Detail, wie verschiedene Regionen im Zentralnervensystem C57BL/6 mittels in utero-Elektroporation spezifisch transfiziert werden. In diesem Protokoll sind detaillierte Anweisungen für Transfektionen von Regionen enthalten, die sich zum Kortex, Hippocampus, Thalamus, Hypothalamus, Nucleus lateralis septum lateralis und Striatum entwickeln.

Cortex, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus, Lateral Septal Nucleus- und Striatum spezifische<em&gt; In Utero</em&gt; Electroporation in der C57BL / 6-Maus,

Periventrikulären noduläre Heterotopie (PNH) ist die häufigste Form der Fehlbildung der kortikalen Entwicklung (MCD) im Erwachsenenalter, aber seine genetische Basis bleibt bei den sporadischen Fällen unbekannt. Vor kurzem haben wir eine Strategie, um neue Kandidatengene für MCDs zu identifizieren und direkt ihre ursächliche Rolle in Vivobestätigen.

Eine neuartige Strategie verbindet Array-CGH, ganze Exome Sequenzierung und In Utero Elektroporation bei Nagetieren verursachenden Gene für Hirnfehlbildungen identifizieren

Dieses Manuskript enthält Protokolle , die in utero Elektroporation (IUE) verwenden , um die strukturelle Konnektivität von Neuronen in der Ebene einzelner Zellen und die Erregbarkeit von fluoreszenzmarkierten Neuronen zu beschreiben. Histologie verwendet dendritische und axonale Projektionen zu charakterisieren. Whole-cell recording in akuten Scheiben verwendet Erregbarkeit zu untersuchen.

In Utero Ansätze Elektroporation die Erregbarkeit neuronaler Subpopulationen und Einzelzell - Konnektivität zu studieren

Zelle-autonome Funktionen der Gene im Gehirn können durch Induktion Verlust studiert werden oder der Funktion in geringer Dichte Bevölkerungen der Zellen gewinnen. Hier beschreiben wir in Utero Elektroporation Cre-Rekombinase in spärlichen Bevölkerung kortikale Neuronen mit Floxed Genen zu entwickeln, Verlust der Funktion in Vivozu liefern.

Induktion Cre Lox Rekombination in Maus Großhirnrinde durch Elektroporation In Utero

Hier bieten wir eine kostengünstige und zuverlässige Methode um elektroporiert Gehirn organotypischen Slice Kulturen von mäuseembryonen geeignet für konfokale Mikroskopie und Leben-bildgebende Verfahren zu generieren.

Ex Utero Elektroporation und organotypischen Slice Kulturen der embryonalen Mäusegehirnen für Live-Aufnahmen von Migration Gabaergen Interneuronen

Die doppelte Utero-Elektroporation ermöglicht die Ausrichtung auf Zellpopulationen, die räumlich und zeitlich getrennt sind. Diese Technik ist nützlich, um Wechselwirkungen zwischen diesen Zellpopulationen mit fluoreszierenden Proteinen unter normalen Bedingungen, aber auch nach funktionellen Experimenten zu visualisieren, um Gene von Interesse zu stören.

Double In Utero Elektroporation, um zeitlich und räumlich getrennte Zellpopulationen anzuvisieren

In diesem Protokoll beschreiben wir, wie die Amnionhöhle der Maus bei E7.5 mit Lentivirus injiziert wird, was zu einer gleichmäßigen Transduktion der gesamten Neuralplatte führt, mit minimalen nachteiligen Auswirkungen auf das Überleben oder die Embryonalentwicklung.

Murine Neural Plate Targeting by In Utero Nano-Injection (NEPTUNE) at Embryonic Day 7.5

Erfahren Sie die In-Utero-Elektroporation zur Analyse neuronaler Migrationsdefizite in transgenen Mausmodellen. Diese Methode ermöglicht gezielte Genmanipulation in spezifischen Hirnregionen für die Entwicklungsneurobiologie.

Induktion der Protein Deletion Durch In Utero Elektroporation, um Defizite in Neuronale Migration in Transgenic Models definieren (Video) | JoVE Journal

Induktion der Protein Deletion Durch In Utero Elektroporation, um Defizite in Neuronale Migration in Transgenic Models definieren

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