Induktion der Protein Deletion Durch In Utero Elektroporation, um Defizite in Neuronale Migration in Transgenic Models definieren

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, Defekte in der neuronalen Entwicklung und Migration in transgenen Mausmodellen mittels in utero-Elektroporation verschiedener Regionen des embryonalen Vorderhirns zu analysieren. Dies wird erreicht, indem ein Plasmid, das Gene für Cree und ein Reporterprotein wie GFP trägt, in den Ventrikel eines embryonalen Gehirns injiziert und ein elektrischer Strom an den Kopf angelegt wird, um dieses Plasmid in die Zellschleimhaut des Ventrikels zu ziehen. In einem zweiten Schritt werden die Embryonen in die Bauchhöhle des Muttertiers zurückgebracht, damit sich die Embryonen weiter entwickeln können, während die Falte exprimiert wird und die Genentfernung spezifisch in den elektroporierten Neuronen vermittelt.

Als nächstes werden Embryonen entnommen und die Gehirne für die Analyse fixiert, um die Wirkung der CRE-vermittelten Genexzision und des anschließenden Protein-Knockdowns in den elektroporierten Neuronen zu bestimmen. Es werden Ergebnisse erhalten, die zeigen, wie die Exzision des interessierenden Gens die neuronale Entwicklung und Migration auf zellspezifische Weise mit Hilfe der Immunhistochemie reguliert. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie z.B. gewebespezifischen transgenen CRE-Linien, besteht darin, dass die Elektroporation von Cree das interessierende Gen nur aus einer kleinen Population von Neuronen in einer vom Forscher ausgewählten Region des Gehirns herausschneidet, was die Ergebnisse erheblich vereinfacht und die Phänotypanalyse erleichtert. Die visuelle Demonstration dieser Technik ist von entscheidender Bedeutung, da die chirurgischen Schritte sehr schwer zu erlernen sein können und die Embryonen in diesem Stadium sehr empfindlich sind und leicht versehentlich beschädigt werden können.

Verdünnen Sie vor der Operation ein einzelnes Plasmid auf zwei Mikrogramm pro Mikroliter in sterilem Wasser mit einem Mikroliter von 0,1 % Gewicht pro Volumen schneller grüner Farbstoff pro 10 oder 20 Mikroliter verdünnter Plasmidlösung. Ziehen Sie als Nächstes die Mikrokapillarröhrchen aus Glas auf eine Standard-Mikropipette, polar in einem einzigen Schritt von 62 Grad Celsius. Verwenden Sie dann die Pipettenspitzen des Mikroladers, um die gezogenen Nadeln mit Plasmidlösung nach hinten zu laden.

Füllen Sie die Nadel nicht ganz in die Nadelspitze, da dies dazu führt, dass die Nadel verstopft. Bei diesem Verfahren wird ein Hautschnitt über dem Bauch zwischen den unteren Tets einer betäubten schwangeren Maus vorgenommen. Ziehe die Haut von der darunter liegenden Muskelschicht weg, indem du das Bindegewebe zerreißt.

Schneiden Sie dann durch das Bauchfell in die Bauchhöhle entlang des linearen Ellenbogens. Führen Sie den gewickelten Retraktor ein, um die Ränder auseinander zu ziehen. Entfernen Sie dann die Gebärmutter aus der Bauchhöhle und legen Sie sie wie abgebildet aus.

Wenn verschiedene Welpen mit unterschiedlichen Plasmiden injiziert werden sollen, zählen Sie die Welpen auf jeder Seite und entscheiden Sie, welche und wie viele mit jedem Plasmid injiziert werden sollen. Bringen Sie eine Seite der Gebärmutter zurück in den Bauch, um die Embryonen warm zu halten, und befeuchten Sie die freiliegende Gebärmutter sofort mit warmer Kochsalzlösung. Führen Sie anschließend eine geladene Nadel in den Griffkopf des Injektionsstabs ein. Schneiden Sie die Spitze vorsichtig mit einer kleinen chirurgischen Schere oder einer feinen Pinzette so ab, dass die Nadel so lange wie möglich bleibt und trotzdem Flüssigkeit durchgelassen wird.

Stellen Sie dann die Länge der Injektion und den Injektionsdruck am Mikroinjektor so ein, dass ein kleines, aber gut sichtbares Tröpfchen von 0,1 bis 0,2 Mikrolitern auf der Nadelspitze erscheint. Wenn das Fußpaddel gedrückt wird, halten Sie das Volumen dieses Tröpfchens zwischen den verschiedenen Nadeln so gleichmäßig wie möglich. Wählen Sie nun einen Embryo aus und positionieren Sie ihn vorsichtig auf dem Rücken, wobei der Kopf nach oben geneigt ist.

Sobald der Embryo an Ort und Stelle ist, lokalisieren Sie den Ventrikel, der sich als halbmondförmiger Schatten parallel zum Sinus sagittalis präsentiert. Berühren Sie die Gebärmutter oberhalb des Ventrikels in einem leichten Winkel mit der Nadelspitze und führen Sie die Nadel durch die Gebärmutterwand. Schieben Sie dann die Nadel durch die Hirnrinde in die Herzkammer.

Pumpen Sie anschließend das Fußpaddel, um die Plasmidlösung zu injizieren. Pumpen Sie weiter, bis eine grüne Fläche sichtbar ist, die sich der Bogenform des Ventrikels anpasst. Bei jungen Embryonen diffundiert der Farbstoff oft in den kontralateralen Ventrikel.

Injizieren Sie insgesamt etwa drei oder vier Embryonen und halten Sie alle freiliegenden Embryonen während des gesamten Eingriffs mit Kochsalzlösung feucht. Beginnen Sie mit dem ersten injizierten Embryo und platzieren Sie die Paddel so, dass die positive Elektrode das Plasmid in die gewünschte Region des Gehirns zieht. Winkeln Sie die negative Elektrode so an, dass der kürzeste Weg zwischen den Elektroden direkt durch die für die Elektroporation vorgesehene Struktur verläuft.

Sobald die Paddel an Ort und Stelle sind, betätigen Sie den Stoßdämpfer. Verwenden Sie je nach Alter und Größe der Embryonen fünf Impulse mit 35 bis 50 Volt, fünf Millisekunden Impulslänge und 950 Millisekunden Impulsintervall. Für die Elektroporation wiederholen Sie den Vorgang mit allen injizierten Embryonen.

Bringen Sie anschließend beide Seiten der Gebärmutter zur Maus zurück. Achten Sie darauf, die Oberfläche mit Kochsalzlösung feucht zu halten und nicht zu viel Druck auszuüben, um ein Trauma des Fruchtwassersaxophons zu vermeiden. Als nächstes vernähst du die Muskelschicht mit einem einfachen Endlosstich.

Tackern Sie dann die Haut zu. Bereiten Sie nun vier Grad Celsius gefiltertes 4%PFA vor. Nachdem Sie das Tier mit einer intraperitonealen Injektion einer tödlichen Dosis Natrium-Pentobarbital eingeschläfert haben, schneiden Sie den Bauch auf.

Ziehen Sie dann beide Seiten der Gebärmutter heraus und legen Sie sie so aus, wie die Welpen zum ersten Mal injiziert wurden. Wenn den Welpen verschiedene Plasmide injiziert wurden, stellen Sie sicher, dass Sie jeden Welpen lokalisieren und alle toten Welpen vermerken, und bestimmen Sie, welchen Welpen Kontroll- und experimentelle Plasmide injiziert wurden. Bevor Sie die Gebärmutter des Weibchens entfernen, entfernen Sie jedes Jungtier einzeln aus der Gebärmutter und dem Fruchtblasensack.

Enthaupte ihn mit einer scharfen Schere oder einer Rasierklinge und lege den Kopf in PBS. Im Falle von transgenen Mäusen entnehmen Sie Gewebeproben für die Genotypisierung und halten Sie jeden Kopf getrennt, z. B. in einer 12-Well-Platte unter einem Präparierfernrohr, entfernen Sie das Gehirn aus dem Schädel, wobei Sie darauf achten, dass die Rinde nicht eingekerbt oder die Mittellinie gerissen wird. Überprüfen Sie mit einem Fluoreszenzmikroskop, ob die Gehirne ein GFP-positives Pflaster haben, das anzeigt, dass sie erfolgreich elektroporiert wurden.

Fixieren Sie anschließend das Gehirn über Nacht in PFA bei vier Grad Celsius. Erhitzen Sie nun Zitronensäure, wo der pH-Wert zuvor auf sechs eingestellt war, in einer Färbekammer in der Mikrowelle oder im Wasserbad, bis sie 75 bis 80 Grad Celsius erreicht. Legen Sie dann die Objektträger für 10 bis 15 Minuten in die Färbekammer.

Waschen Sie anschließend die Objektträger in PB S3 jeweils drei Minuten lang bei Raumtemperatur. Tragen Sie den Primärantikörper auf und fahren Sie mit der Immunfärbung gemäß einem Standardprotokoll fort. Validieren Sie dann die CRE-vermittelte Exzision durch Co-Markierung für GFP und das interessierende Gen, um den Knockdown zu bestätigen.

Diese Abbildung zeigt die Bestätigung der CRE-vermittelten Exzision durch cos-Färbung für ein nachgeschaltetes Ziel des deletierten Gens. RB beflockt, P 1 0 7 knockout P one 30 beflockte Embryonen wurden entweder mit dem leeren PCI zwei Plasmid oder dem PCI zwei Cree Plasmid elektroporiert und für GFP und KI 67 gefärbt. Ein Marker für die Zellproliferation.

Doppelt gefärbte Zellen wurden in Neuronen beobachtet, die mit Cree elektroporiert waren, aber nicht in Neuronen. Elektroporiert mit psig. Allein zwei.

Die Exzision von RB wurde auch durch PCR mit Genotypisierungsprimern auf DNA bestätigt, die aus den von den Objektträgern entnommenen Gewebeschnitten extrahiert wurde. Das obere Band repräsentiert das F-Flox-Allel und das untere Band das Wildtyp-Allel. Der Pfeil zeigt das exzidierte Allel in der elektroporierten Seite des Gehirns.

Nur die CRE-vermittelte Exzision kann auch in vitro mit Plasmiden mit beflockten Stoppcodons bestätigt werden. Vor dem RFP wie NL DS Red RFP wird nur in den EK-Zellen exprimiert, wenn die Rippe mit Cree GFP in HEK 2 93 Zellen transfiziert wurde, was darauf hindeutet, dass die Exzision erfolgreich war. Nach dieser Technik wurde eine erfolgreiche Exzision durchgeführt. Andere Methoden wie Zellkultur, Immunhistochemie oder Elektrophysiologie können verwendet werden, um zusätzliche Fragen zur Entwicklung und Funktion einzelner Neuronen nach einer c median Genexzision zu beantworten.

Nachdem Sie sich diese Technik angesehen haben, können Sie sehen, wie die In-utero-Elektroporation verwendet werden kann, um die verschiedenen Regionen des Gehirns zu erreichen, und dies kann wirklich helfen, einige dieser komplexen Phänotypen zu verstehen, die wir bei verschiedenen transgenen Tieren haben.