Direkte Induktion von humanen neuralen Stammzellen aus peripherem Blut hämatopoetischen Vorläuferzellen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, neurale Stammzellen direkt aus Blutzellen zu induzieren. Dies wird erreicht, indem zunächst CD 34-positive hämatopoetische Vorläuferzellen aus dem Blut angereichert werden. Der zweite Schritt besteht darin, CD 34-Zellen mit dem Sendi-Virus zu transfizieren, das Transkriptionsfaktoren enthält.

Anschließend werden die neuralen Stammzellen mit Hilfe eines selektiven Mediums gewonnen. Der letzte Schritt besteht darin, die induzierten neuralen Stammzellen in Neuronen, Astroglia und Oligodendrozyten zu differenzieren. Letztendlich wird die Immunfluoreszenzmikroskopie verwendet, um die resultierenden Zellen zu charakterisieren.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie z.B. der Dauer von Neuronen direkt aus Fibroblasten, auch IPS-Generierung, besteht darin, dass diese Methode den langwierigen Prozess der IPS-Generierung und -Berechnung umgeht, aber immer noch eine große Menge an neuronalen Zellen liefert, die sich mit Neuronen in Beziehung setzen und differenzieren können. Ich hatte die Idee zu dieser Methode, als ich bemerkte, dass angehängte transfizierte CT 34-Zellen tatsächlich sehr ähnlich wie primär kultivierte neuroprogene Zellen sind, was zeigt, dass das Verfahren Marines sein wird, ein Techniker aus meinem Leben. Nach der Isolierung von CD 34-Zellen aus mononukleären Zellen des peripheren Blutes gemäß den Anweisungen im Textprotokoll beginnen Sie den Prozess der Kultivierung der CD 34-Zellen durch Resus, suspendieren Sie die CD 34-Zellen in CD 34-Medien und säen Sie dann die Zellen in eine 24-Well-Platte mit dreimal 10 bis zu den fünften Zellen pro Vertiefung in einem Milliliter Medium.

Nach einer 24-stündigen Inkubation in einem 37 Grad Celsius heißen Gewebekultur-Inkubator mit 5 % Kohlendioxid werden die schwimmenden Zellen gesammelt und die Zellsuspension bei 110-facher Temperatur bei Raumtemperatur zentrifugiert. Dann wird der Überstand verworfen und die Zellen in frischem CD 34-Erhaltungsmedium wieder suspendiert. Sehen Sie sich eine neue 24-Well-Platte an, die einmal 10 bis fünf Zellen pro Well in einem Milliliter Medium aufbringt, fünf weitere Tage bei 37 Grad Celsius in einem 5%igen Kohlendioxid-Inkubator inkubiert und jeden zweiten Tag die Hälfte des Mediums austauscht.

Indem die obere Hälfte des Überstands vorsichtig abgesaugt wird, während sich die Zellen CD 34 auf dem Boden der Vertiefungen befinden, wie hier am fünften Tag gezeigt. Nach dem Plattieren werden CD 34-Zellen entnommen und die Zellen bei 170-fachem G für 10 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert, der Überstand verworfen, die Zellen wie zuvor resuspendiert und eine frische 24-Well-Platte mit einmal 10 bis 10 Zellen pro Well in einem Milliliter Medium ausgesät. Als nächstes tauen Sie ein Cyto Tune IPS Sendi Reprogrammierungskit auf.

Indem die Böden der Röhren zunächst 10 Sekunden lang in ein 37 Grad heißes Wasserbad getaucht und dann bei Raumtemperatur vollständig aufgetaut werden. Die Röhrchen kurz zentrifugieren und auf Eis legen. Bereiten Sie die Sendai-Virusmischung vor, indem Sie das empfohlene Volumen jedes Virus mischen, das auf dem Analysezertifikat für die entsprechende Charge aufgeführt ist.

Empfohlen wird eine Multiplizität von 15 Infektionen. Geben Sie die Sendai-Virusmischung in jede Vertiefung der CD 34-Zellen. Mischen Sie dann die Vertiefungen, indem Sie die Platte leicht schütteln.

Inkubieren Sie die Zellen nach 24 Stunden bei 37 Grad Celsius in einem 5%igen Kohlendioxid-Inkubator. Beobachten Sie die Transduktionseffizienz. Beachten Sie, dass Zellaggregate und Kugeln wie die hier gezeigten Indikatoren für eine erfolgreiche Transduktion sind.

Inkubieren Sie die Zellen dann fünf bis sieben Tage lang im Gewebekultur-Inkubator, bis anhaftende Zellen erscheinen und eine Konfluenz von 30 bis 50 % erreichen, wie hier jeden zweiten Tag gezeigt. Wechseln Sie die Hälfte des Mediums, indem Sie die obere Hälfte des Mediums vorsichtig in eine andere Vertiefung geben. Wenn Zellkügelchen auf die neuen übertragen werden, fügen Sie die gleiche Menge frisches Medium hinzu.

Überprüfen Sie die Kofluenz der Zellen mit dem inversen Mikroskop. Wenn die Zellen zu 30 bis 50 % konfluent sind, aspirieren Sie den Überstand und die Reserve und fügen Sie dann einen Milliliter neurales Vorläufermedium zu jeder Vertiefung hinzu, um mit den Kugeln in der Überstandszentrifuge eine Backup-Platte herzustellen, den Reserveüberstand bei 170 mal G für 10 Minuten. Aspirieren Sie dann den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in einer neuralen Vorläufer-Medium-Platte in einer mit Matrigel beschichteten 24-Well-Platte.

Wechseln Sie wie zuvor das Medium in jeder Zellplatte jeden zweiten Tag, bis die Zellen eine Konfluenz von 60 bis 80 % erreichen. In der Regel nach einer Woche. Sobald die Zellen die erforderliche Konfluenz erreicht haben, aspirieren Sie den Überstand und fügen Sie jeweils einen Milliliter neurales Stammzellmedium hinzu.

Nun, dann dissoziieren Sie die Zellen mit einem Zellschaber, gefolgt von einem sehr sanften Pipettieren. Übertragen Sie als Nächstes die Zellen aus einer Vertiefung der 24-Well-Platte in eine Vertiefung mit sechs Vertiefungen. Gut anrichten.

Geben Sie einen weiteren Milliliter Medium in die Vertiefung und nachdem Sie den Vorgang für alle Vertiefungen wiederholt haben, legen Sie die Platte mit sechs Vertiefungen in den 37 Grad Celsius heißen 5%igen Kohlendioxid-Inkubator. Wechseln Sie das volle Volumen des Mediums alle zwei Tage, bis die Zellen eine Konfluenz von 60 % erreichen, danach dissoziieren und rezitieren die Zellen in einem Verhältnis von eins zu drei, wie gerade gezeigt, um einen Teil der undifferenzierten neuralen Stammzellen einzufrieren. Bereiten Sie zunächst das Gefriermedium der Stammzellen vor, indem Sie dem neuralen Stammzellmedium 20 % Dimethylsulfoxid oder DMSO zusetzen und auf Eis legen.

Dissoziieren Sie dann die Zellen in der Sechs-Well-Platte. Mit einem Zellschaber und schonendem Pipettieren. Reservieren Sie ein Aliquot der Suspension für eine Zellzählung und zentrifugieren Sie dann die Zellen 10 Minuten lang bei Raumtemperatur, während sich die Zellen drehen, zählen Sie die Zellen im Aliquot der Suspension mit einem Hämometer, Zytometer oder einem automatisierten Zellzähler und berechnen Sie das Volumen des Mediums, das erforderlich ist, um den sechs Zellen pro Milliliter eine Zellkonzentration von eins mal 10 zu geben.

Nachdem die Drehung beendet ist, verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in neuralem Stammzellmedium zu einmal 10 bis sechs Zellen pro Milliliter. Geben Sie dann ein gleiches Volumen Gefriermedium, eine Pipette fünfmal 10 zu den fünften Zellen mit einem Volumen von einem Milliliter in ein Kryofläschchen und frieren Sie die Zellen in einem Gefrierbehälter gemäß den Anweisungen des Herstellers ein. Wenn die neuralen Stammzellen in der Sechs-Well-Platte eine Konfluenz von 80 % erreichen, lösen Sie sie mit einem Gummipolizisten ab und dissoziieren Sie dann durch sanftes Pipettieren.

Die Zellsuspension wird in ein steriles Röhrchen gepoolt. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämometer, Zytometer oder automatisierten Zellzähler und stellen Sie die Konzentration der Zellsuspension auf eins mal 10 bis fünf Zellen pro Milliliter mit neuralem Stammzellmedium ein. Pipettieren Sie dann einen Milliliter der Zellsuspension auf ein Poly-D-Lysin und einen laminatbeschichteten Deckschirm in eine Vertiefung einer 24-Well-Platte, nachdem Sie den Vorgang für die gewünschte Anzahl von Vertiefungen wiederholt haben.

Inkubieren Sie wie zuvor für 24 Stunden. Nach Ablauf der Inkubationszeit aspirieren Sie das Medium und ersetzen es durch neuronale Differenzierung. Medium: Inkubieren Sie zwei Wochen lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid, wobei das Medium nach zwei Wochen zweimal pro Woche gewechselt wird.

Die neuronalen Stammzellen sollten wie hier gezeigt vollständig differenziert und bereit für nachgelagerte Anwendungen wie die Immunfluoreszenzfärbung sein. Die ersten beiden Bilder zeigen, dass neurale Stammzellen nest in und SOX zwei exprimieren. Während das dritte Bild zeigt, dass OCT vier nicht exprimiert wird, wird DPI als nuklearer Marker verwendet und der Maßstabsbalken repräsentiert 200 Mikrometer.

Nachdem sie dem im Video beschriebenen Differenzierungsprotokoll gefolgt sind, exprimieren die differenzierten Neuronen den neuronalen Marker Beta-3-Tubulin. Die menschlichen neuralen Stammzellen können auch zu Gliazellen differenziert werden. Bei der Differenzierung zu Astrozyten exprimieren die Zellen den astrozytären Marker GFAP.

In diesem Bild wurden die Zellen schließlich in Oligodendrozyten differenziert und exprimieren den Oligodendrozytenmarker. O vier. Sobald die Beherrschung der Beherrschung ist, kann die Erzeugung von induzierten humanen neuralen Stammzellen aus peripherem Blut in etwa drei Wochen erfolgen.

Bei richtiger Durchführung könnten die Neurostammzellen weiter differenzierte Neuronen sein und unklar ist die Methode durch die langwierigen und komplizierten IPS-Erzeugungsprozesse und könnte eine einfache Option sein, um patientenspezifische neuronale Kulturen nach ihrer Entwicklung zu erzeugen. Diese Technik ermöglicht es Forschern im Bereich der Neurowissenschaften, die Modellierung einzelner Zellkulturen für verschiedene neurologische Erkrankungen zu erforschen, die die genetischen Unterschiede bei bestimmten Erkrankungen, insbesondere aus einzelnen Patientenproben, besser darstellen könnten.