Name: Direkte Induktion von humanen neuralen Stammzellen aus peripherem Blut hämatopoetischen Vorläuferzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: Erfahren Sie die direkte Induktion neuronaler Stammzellen aus CD34-positiven hämatopoetischen Vorläuferzellen aus peripherem Blut. Diese Methode ermöglicht die effiziente Generierung von Neuronen, Astroglia und Oligodendrozyten für die regenerative Medizin.

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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

1. Anreicherung von hämatopoetischen Vorläuferzellen aus Vollblut Erwachsene HINWEIS: Hämatopoetische Vorläuferzellen oder CD34 + Zellen aus peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) aus einer Vielzahl von Quellen einschließlich Nabelschnurblut, Leukapherese Material und Vollblut mittels Dichtegradientenzentrifugation basieren Verfahren abgeleitet, gereinigt werden. Die hier aufgeführte Methode verwendet Vollblut als Beispiel. <ol><li> Isolierung von PBMCs aus Vollblut: <ol><li> Hinzufügen 4,5 ml der Lymphozytentrennmedium zum SepMate Rohr pipettiert es durch die zentrale Bohrung des Einsatzes ist. </li><li> Verdünne die Blutprobe mit einem gleichen Volumen an steriler DPBS mit 2% Humanserum (v / v). B. 5 ml der Probe mit 5 ml DPBS + 2% Humanserum. </li><li> Fügen Sie die verdünnte Probe durch Pipettieren sie an der Seite des Rohres. Achten Sie darauf, die Probe direkt durch die zentrale Öffnung zu gießen. </li><li> Zentrifuge bei 1.200 xg für 10 min bei RT. </li><li> Den Überstand über dem PMBC Schicht vorsichtig entfernen. </li><li> Sammeln Sie die PBMC Schicht (bewölkt) in ein neues Röhrchen. </li><li> 15 ml von Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS) mit 2% menschlichem Serum in das Röhrchen und zentrifugiert bei 150 g für 10 min bei RT mit der Bremse aus. </li><li> Den Überstand verwerfen und das Pellet in 15 ml DPBS mit 2% Humanserum. Zählen die Anzahl von Zellen. </li><li> Zentrifuge bei 690 × g für 10 min bei RT. Entfernen all des Überstandes aus der Röhre. </li><li> Die Zellen in 1 x 10 7 Zellen pro 15 ml Iscove modifiziertem Dulbecco-Medium (IMDM), das 1% Antibiotika (v / v) und 10% menschlichem Serum (v / v). </li><li> Vor Isolierung von CD34 + Zellen, die Zellen O / N bei 37 ° C in 5% CO 2 -Inkubator. </li></ol></li><li> Positive Selektion von CD34 + Zellen aus PBMCs mit CD34 Multisort Kit: HINWEIS: schnell arbeiten und vorgekühlten Lösungen für Zellen machen kalt und zu verhindern Deckelungvon Antikörpern auf der Zelloberfläche und nicht-spezifische Markierung von Zellen pro Bausatz Instruktion. <ol><li> Sammeln Sie alle PMBCs in einem 50-ml-Tube und zählen die Anzahl der gesamten Zellen in dem Medium. </li><li> Zentrifugiere die Zellen bei 300 g für 10 min. Entfernen Sie alle überstehenden komplett. </li><li> Resuspendieren bis 10 8 Zellen pro 300 ul in Perlenpuffer (DPBS, das 0,5% Humanserum (v / v) und 2 mM EDTA). </li><li> 100 l FcR Blocking-Reagenz und fügen Sie 100 ul von CD34 MultiSortMicroBeads. </li><li> Gut mischen und inkubieren für 30 Minuten in den Kühlschrank (2 - 8 ° C). </li><li> Wash-Zellen durch Zugabe von 2 ml Puffer pro Wulst 10 8 Zellen und Zentrifugieren bei 300 xg für 10 min bei RT. Überstand entfernen vollständig. </li><li> Resuspendieren bis zu 10 &amp; sup8; Zellen in 500 ul Puffer. </li><li> Platzieren MACS LS Säule im Magnetfeld einer MACS Separator und bereiten Säule durch Waschen mit 3 ml Wulst Puffer. </li><li> Bewerben Zellsuspension auf die center der Kolonne. Unmarkierten Zellen fließen, durch die dann erhoben, wenn bevorzugt. </li><li> Waschkolonne dreimal mit 3 ml Puffer Wulst. </li><li> Entfernen Sie die Säule aus dem Abscheider und legen Sie sie auf einem 15-ml-Tube. </li><li> 5 ml Bead-Puffer auf die Säule und sofort spülen die magnetisch markierten Zellen, indem Sie den Kolben in die Spalte. </li><li> Mit 20 ul Multisort Freisetzungsmittel pro 1 ml Zellsuspension. Gut mischen und inkubieren für 10 Minuten in den Kühlschrank (2 - 8 ° C). </li><li> Hinzufügen 1-2 ml Wulst Puffer pro 10 7 Zellen und Zentrifugieren der Zellen bei 300 g für 10 min bei RT. Überstand entfernen vollständig. </li><li> Zellen in 50 ul Kügelchen Puffer pro 10 7 Zellen. </li><li> In 30 ul Multisort Stopp-Reagenz pro 10 7 Zellen und Inkubation für 15 Minuten in den Kühlschrank stellen. </li><li> 5 ml Kügelchen Puffer und Zentrifugieren der Zellen bei 300 g für 10 min bei RT. Überstand verwerfen. </li></ol></li></ol> 2. Herleitung der induzierten neuralen Stammzellen aus CD34 + Zellen <ol><li> CD34 + Zellen Kultur: HINWEIS: Frisch zubereitete Medium sollte innerhalb von 7 Tagen verwendet werden, wenn im Kühlschrank gelagert werden. Signifikante CD34 Zellen Verlust konnte nach 24 Stunden beobachtet werden, aber die eine signifikante Proliferation von Zellen sollte erkennbar sein, insbesondere für Tag 5. Wenn die Anzahl von Zellen kontinuierlich abnimmt oder keine Proliferation entweder schlechte Qualität des Mediums oder CD34-Zellen und die Zellen impliziert dies, nicht für den nächsten Schritt verwendet werden. <ol><li> Resuspendieren und Kultur CD34 + Zellen in CD34 beibehalten Medium (StemSpan SFEM mittlerer menschlicher Thrombopoetin enthaltenden (TPO, 100 ng / ml), fms-ähnliche Tyrosinkinase 3 (Flt-3) Ligand (100 ng / ml) und Stammzellfaktor (SCF, 100 ng / ml), Interleukin-6 (IL-6, 20 ng / ml) und Interleukin-7 (IL-7, 20 ng / ml)) in einer 24-Well-Platte (bis zu 3 x 10 5 / Vertiefung in 1 ml Medium pro Vertiefung) bei 37ºC in 5% CO 2 -Inkubator. </li><li> After 24 Stunden, sammeln Sie die schwimmenden Zellen und Zentrifugieren der Zellen bei 110 × g bei RT zu der alle angeschlossenen Zellen und Zelltrümmer zu entfernen. Verwerfen des Überstandes und Resuspendieren der Zellen in 1 ml frischem Medium und CD34 beibehalten Saatgut in eine neue Platte mit 24 Vertiefungen (bis zu 1 x 10 5 / Vertiefung) bei 37 ° C in 5% CO 2 Inkubator für weitere 5 Tage. </li><li> Ersetzen der Hälfte des Mediums alle neulich durch vorsichtiges Ansaugen der oberen Hälfte des Überstandes während die CD34 + Zellen werden auf dem Boden der Vertiefungen (1A) schweben. </li></ol></li><li> Sendai-Virus-Transfektion: <ol><li> Am Tag 5 sammeln CD34 Zellen und Zentrifugieren der Zellen bei 170 g für 10 min bei RT. Überstand verwerfen. </li><li> Resuspendieren der Zellen in frischem Medium bei 1 x 10 5 / Vertiefung in einer Platte mit 24 Vertiefungen in 1 ml Medium. </li><li> Tauen Sie eine cytotune-iPS Sendai Umprogrammierung Satz von ersten Eintauchen der Boden der Röhrchen in einem 37 ° C Wasserbad für 10 Sekunden und dann vollständig auftauen eint RT. Kurz zentrifugieren die Rohre und legte sie auf Eis. Bereiten Sie das Sendai-Virus-Mischung durch Mischen der empfohlenen Volumen jedes Virus auf dem Analysenzertifikat (COA) für die entsprechende Menge enthalten sind. MOI 15 wird empfohlen. </li><li> Hinzufügen Sendaivirus Mischung in jede Vertiefung der CD34-Zellen. Mischen Sie die Wells durch leichtes Schütteln. Inkubieren der Zellen bei 37 ° C in 5% CO 2 -Inkubator. </li><li> Beachten Sie die Transfektionseffizienz nach 24 Stunden. Beachten Sie, daß Zellaggregate und Kugelbildung sind Indikatoren für eine erfolgreiche Transfektion (1B). </li><li> Ändern Sie die Hälfte des Mediums durch vorsichtiges Übertragung der oberen Hälfte des Medium in ein anderes auch. Wenn es Zellkugeln in der neuen gut, mit der gleichen Menge an frischem Medium. </li><li> Ändern Sie jedes Medium den anderen Tag, indem Sie Schritt 2.2.6. </li></ol></li><li> Neuronale Stammzellen Induktion: HINWEIS: Je nach Zellenbedingungen, etwa 5 oder 7 Tage nach der Transfektion Mono anhaftenden Zellen wird 30 zu erreichen -50% Konfluenz (Abbildung 1C). <ol><li> Entfernen der Überstände, die schwimmende Zellen und Kugeln und dann 1 ml der neuralen Vorläufermedium (Dulbecco Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM / F12), das 1 × N2 Ergänzung, 0,1% (w / v) Rinderserumalbumin ( BSA), 1% (v / v) Antibiotika, 20 ng / ml basischen Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF) und 20 ng / ml des epidermalen Wachstumsfaktors (EGF)) in die anhaftenden Zellen. </li><li> Optional distanzieren die Zellkugeln durch vorsichtiges Pipettieren und Zentrifugieren der Zellen bei 170 g für 10 min. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Zellen in 1 ml der neuralen Vorläufer Medium in einem neuen 24-Well-Platte mit Matrigel pro Befehl als Backup beschichtet. </li><li> Ändern Sie das Medium jeden zweiten Tag, bis die Zellen zu erreichen 60-80% konfluent, in der Regel nach 1 Woche. </li><li> Überstand verwerfen und fügen Sie in 1 ml der neuronalen Stammzellmedium (serumfreies Medium, NSC SFM). Distanzieren die Zellen mit einem Zellschaber, gefolgtdurch sehr vorsichtiges Pipettieren. </li><li> Entfernen der Zellen und Samen alle von ihnen in eine Vertiefung einer Platte mit 6 Vertiefungen. Fügen Sie eine weitere 1 ml neurale Stammzellmedium auf 2 ml Medium für jeden gut zu machen. Inkubieren der Zellen bei 37 ° C in 5% CO 2 -Inkubator. </li><li> Ändern Sie jedes Medium den anderen Tag. </li><li> Wenn Zellen erreicht 60% Zusammenfluss, distanzieren und Ausstrich der Zellen bei 1: 3-Verhältnis wie im Abschnitt 2.3.4 und 2.3.6. </li></ol></li><li> Einfrieren von neuralen Stammzellen: <ol><li> Bereiten neuralen Stammzellengefriermedium durch Zugabe von 20% Dimethylsulfoxid (DMSO) in die neuronale Stammzellmedium. Halten Sie das Gefriermedium auf Eis. </li><li> Distanzieren die Zellen in einer Platte mit 6 Vertiefungen, mit Zellschaber, gefolgt durch vorsichtiges Pipettieren. Zählen Sie die Zellen. Zentrifugiere die Zellen bei 170 g für 10 min bei RT. Überstand verwerfen. </li><li> Die Zellen in neuralen Stammzellenmedium bei 1 x 10 6 / ml. Das gleiche Volumen der Gefriermedium zu den Zellen. </li><li> 1 ml (5 x 10 5 Zellen insgesamt) von Zellen in einem Kryoröhrchen. Frieren Sie die Zellen unter Verwendung eines Mr. Froster Gefrierbehälter nach der Anweisung. </li></ol></li></ol> 3. Neuronale Zelldifferenzierung <ol><li> Neuronalen Zellen Differenzierung: <ol><li> Wenn Nervenstammzellen 80% Konfluenz erreichen, nehmen Sie die neurale Stammzellen mit einem Gummiwischer und dann durch vorsichtiges Pipettieren distanzieren. </li><li> Zählen Sie die Zellen und stellen die Konzentration auf 1 x 10 5 / ml in der neuralen Stammzellmedium. </li><li> Für die neuronale Differenzierung, Platte die Zellen auf Poly-D-Lysin / Laminin-Deckgläser in 24-Well-Platten mit 1 x 10 5 / Vertiefung. Inkubieren der Zellen bei 37 ° C in 5% CO 2 -Inkubator. </li><li> Ersetzen Sie das Medium mit neuronalen Differenzierungsmedium (DMEM / F12 aus 1x N2 zu ergänzen, 1x B27 ergänzen, zu 300 ng / ml cAMP, 0,2 mM Vitamin C, 10 ng / ml Gehirn derived neurotrophic factor (BDNF) und 10 ng / ml Gliazellen abgeleitet neurotrophic factor (GDNF)) after 24 Stunden. Inkubieren der Zellen bei 37 ° C in 5% CO 2 -Inkubator. </li><li> Ändern neuronalen Differenzierungsmedium zweimal pro Woche für 2 Wochen. </li></ol></li><li> Astroglia-Differenzierung: <ol><li> Distanzieren die neuralen Stammzellen durch Pipettieren. </li><li> Zählen Sie die Zellen und Einstellen der Zellkonzentration auf 5 × 10 4 Zellen / ml. Samen der Zellen auf 24-Well-Platten. Inkubieren der Zellen bei 37 ° C in 5% CO 2 -Inkubator. </li><li> Ersetzen des Mediums mit DMEM / F12 mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und Inkubation der Zellen bei 37 ° C in 5% CO 2 Inkubator. </li><li> Ändern Medium zweimal pro Woche für 2 Wochen. Wenn Zellen erreichen Fluss vor 2 Wochen, Ausstrich die Zellen folgenden Schritte 3.2.1 und 3.2.2. </li></ol></li><li> Oligodendrozyten-Differenzierung: <ol><li> Distanzieren die neuralen Stammzellen durch Pipettieren. </li><li> Zählen Sie die Zellen und seed 1 x 10 5 Zellen auf Poly-L-Ornithin-beschichteten Platten mit 24 Vertiefungen in 1 ml Oligodendrozyten differentiation Medium bestehend aus DMEM / F12, enthaltend N2 ergänzen, 10 ng / ml von Blutplättchen abgeleitetem Wachstumsfaktor-AA (PDGF-AA), 2 ng / ml von Neurotrophin-3 (NT-3), 2 ng / ml sonic hedgehog ( Shh) und 3 nM Triiodthyronin (T3). Inkubieren der Zellen bei 37 ° C in 5% CO 2 -Inkubator. </li><li> Ändern Medium zweimal pro Woche für 2 Wochen. </li><li> Ersetzen des Mediums mit DMEM / F12 mit 1xN2 Ergänzung und 3 nM T3 und Kultur werden die Zellen für eine weitere Woche für basisches Myelinprotein (MBP) Produktion. </li></ol></li></ol> 4. Immunfluoreszenzfärbungen <ol><li> Tauschen Sie Medien mit 4% Paraformaldehyd (PFA). Inkubieren für 10 min bei RT. </li><li> Verwerfen PFA und waschen mit PBS, das 0,1% Triton X-100 (PBS-T) 3-mal, jeweils 5 min. </li><li> Permeabilisieren Zellen mit PBS, enthaltend 0,5% Triton X-100 für 10 min bei RT. </li><li> Blockieren der Zellen mit PBS-T, enthaltend 4% Ziegenserum für 20 min bei RT. </li><li> Die Zellen mit entsprechenden primären Antibo inkubierenMatrizen in PBS-T, enthaltend 0,1% BSA für 2 Stunden bei RT oder O / N in Kälteraum verdünnt. </li><li> Die Zellen werden 3 Mal mit PBS-T, je 5 min. Inkubieren der Zellen mit der entsprechenden sekundären Antikörper gekoppelt mit einem Fluorochrom mit 1: 400-Verdünnung in PBS-T, enthaltend 0,1% BSA für 1 h auf einem Rüttler in der Dunkelheit. </li><li> Die Zellen mit PBS-T, enthaltend 4 &#39;, 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) für 10 min bei RT waschen. </li><li> Für jede 5 min bei RT Waschen der Zellen zweimal mit PBS-T. </li><li> Beachten Sie die markierten Zellen mit einem Mikroskop und fotografieren (Abbildung 3). </li></ol>

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<li>Goolsby, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+progenitors+express+neural+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic progenitors express neural genes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 14926-14931 (2003).</li>
</ol>

Die Studie wird von NIH-internen Fonds finanziert.

Ein detailliertes Protokoll, um direkt zu generieren neuralen Stammzellen aus dem peripheren hämatopoetischen Vorläuferzellen ist. Im Vergleich zu Fibroblasten, ist menschlichem peripheren Blut leichter zugänglich. Verwendung des vorgestellten Protokoll, mehr als 1 x 10 5 hämatopoetischen Vorläuferzellen oder CD34-positiven Zellen aus 10 ml Vollblut angereichert werden. Obwohl Kontamination mit Blutplättchen ist normalerweise nicht vermeidbar, kann es leicht durch Niederalkyl Zent...

In vitro haben neuronalen Kulturen als ein grundlegendes Instrument für die Untersuchung von neurologischen Erkrankungen eingesetzt. Primäre tierische (meist Nagetier) neuronalen Kulturen 1, 2 und humanen neuralen Zelllinien aus Gliomen und anderen Tumore abgeleitet sind die am häufigsten verwendete in solchen Studien. Jedoch wurde erkannt, dass es signifikante Unterschiede zwischen Nager- und menschliche Zellen. Viele Erkenntnisse basierend auf Nagetiere können nicht auf den Menschen übertragen werden. Darüber hinaus mit der rasanten Entwicklung bei der Analyse von Massen genomischer Informationen und die relativ einfach Gen Bearbeitung und Sequenzierung ganzer Genome, geht der Trend immer mehr darauf ausgerichtet, die Entdeckung Krankheit anfällig Gene und die Abgrenzung ihrer Funktionen und Rollen in bestimmten Krankheiten, die die wenigen menschlichen neuronalen macht Zelllinien sind nur begrenzt Gebrauch. Theoretisch humanen primären neuronalen Kulturen aus Proben von Patienten Nervensystem abgeleitet werden, sind die beste Wahl, aber sie unmöglich zu erhalten sind; daher alternative meththoden notwendig. In den letzten Jahren haben einige Ansätze verfolgt, mit zwei die unterscheidbar. Nach der Entwicklung der Technik der Erzeugung von pluripotenten Stammzellen (iPS) unter Verwendung der Maus und menschliche Körperzellen 3, 4, Nervenzellen weiter differenziert daraus 5-7 sein könnte. Allerdings Erzeugung und Charakterisierung iPSC verlangt intensive Arbeit, Techniken und Zeitaufwand, manchmal sogar unerschwinglich. Kurze Zeit später wurde ein anderer Ansatz entwickelt, um direkt zu verwandeln neuronalen Zellen aus somatischen Zellen 8, 9. Die resultierenden Neuronen nichtproliferativer schränkt sie ihre Anwendung in intensive Studien und Wirkstoff-Screening, die eine große Menge an Zellen benötigt. Um die Vorteile beider Techniken, direkte Ableitung von neuralen Stammzellen nehmen / Vorläuferzellen aus Körperzellen wurde von mehreren Gruppen von 10 bis 12, das die mühsame Prozess der iPSC Herstellung und Charakterisierung, aber immer noch provi umgeht erforschtdes eine anständige Anzahl von neuralen Stammzellen für spätere neuronalen Differenzierung. Wir haben zuvor gezeigt, dass nach der Einführung der Yamanaka Transkriptionsfaktoren in hämatopoetische Vorläuferzellen, neurale Stammzellen können direkt mit einer neuralen Vorläuferzelle-Auswählschaltung Medium 13 erzeugt werden. Hier berichten wir über die Verfahren im Einzelnen.

<table><tbody><tr><td>Lymphozyten-Trennmedium</td><td>Lonza</td><td>17-829E</td><td>1x</td></tr><tr><td>SepMate</td><td>Stemcell Technologies</td><td>15415</td><td>15 ml</td></tr><tr><td>Humanserum</td><td>Invitrogen</td><td>34005-100</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotika</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td>1%</td></tr><tr><td>CD34 MultiSort Kit</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-056-701</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Cellgro</td><td>46-034-Cl</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>MACS LS Säule</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>StemSpan SFEM Medium</td><td>Stemcell Technologies</td><td>9650</td><td>1x</td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Quality Biologicals</td><td>112-035-101</td><td>1x</td></tr><tr><td>TPO</td><td>Peprotech</td><td>300-18</td><td>100 ng/ml</td></tr><tr><td>Flt-3</td><td>Peprotech</td><td>300-19</td><td>100 ng/ml</td></tr><tr><td>SCF</td><td>Peprotech</td><td>300-07</td><td>100 ng/ml</td></tr><tr><td>IL-6</td><td>Peprotech</td><td>200-06</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>IL-7</td><td>Peprotech</td><td>200-07</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>IPS Sendai Reprogramming Kit</td><td>Life Technologies</td><td>A1378001</td><td></td></tr><tr><td>Zellschaber</td><td>Sarstedt</td><td>83.183</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>CryoTube Fläschchen</td><td>Thermo</td><td>368632</td><td></td></tr><tr><td>Mr. Frosty Behälter</td><td>Thermo</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>12400-024</td><td>1x</td></tr><tr><td>N2 Supplement</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td>1x</td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Sigma</td><td>A2934</td><td>0,1% (w/v)</td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>B27 Nahrungsergänzungsmittel</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td>1x</td></tr><tr><td>NSC Serum freies Medium</td><td>Life Technologies</td><td>A1050901</td><td>1x</td></tr><tr><td>Poly-D-Lysin/Laminin beschichtete Deckgläser</td><td>BD Bioscences</td><td>354087</td><td></td></tr><tr><td>cAMP</td><td>Sigma</td><td>A9501</td><td>300 ng/ml</td></tr><tr><td>Vitamin C</td><td>Sigma</td><td>A0278</td><td>0,2 mM</td></tr><tr><td>BDNF</td><td>Peprotech</td><td>450-02</td><td>10 ng/ml</td></tr><tr><td>GDNF</td><td>Peprotech</td><td>450-10</td><td>10 ng/ml</td></tr><tr><td>Poly-L-Ornithin</td><td>Sigma</td><td>P4957</td><td>1x</td></tr><tr><td>PDGF-AA</td><td>Peprotech</td><td>100-13A</td><td>10 ng/ml</td></tr><tr><td>NT-3</td><td>Peprotech</td><td>450-03</td><td>2 ng/ml</td></tr><tr><td>Shh</td><td>Peprotech</td><td>1314-SH/CF</td><td>2 ng/ml</td></tr><tr><td>T3</td><td>Sigma</td><td>T6397</td><td>3 nM</td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td>4%</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Qualität biologisch</td><td>119-069-101</td><td>1x</td></tr><tr><td>Ziegenserum</td><td>Sigma</td><td>G9023</td><td>4%</td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Maus monoklonales Anti-Nestin</td><td>Millipore</td><td>AB5922</td><td>1:1.000 Verdünnung</td></tr><tr><td>Anti-SOX2 Antikörper</td><td>Angelegte Stammzell-ASA0120</td><td></td><td>Gebrauchsfertiges</td></tr><tr><td>Maus-Anti-&Beta; III-Tubulin-Antikörper</td><td>Promega</td><td>G712A</td><td>1:1.000 Verdünnung</td></tr><tr><td>Kaninchen Anti-GFAP-Antikörper</td><td>Sigma</td><td>G4546</td><td>1:100 Verdünnung</td></tr><tr><td>Anti-O4-Antikörper</td><td>R& D Systems</td><td>MAB1326</td><td>IgM; 1 ng/ml</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Anti-Kaninchen-Antikörper</td><td>Lebenstechnologien</td><td>A11012</td> 1<td>:400 Verdünnung</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Anti-Maus-Antikörper</td><td>Lebenstechnologien</td><td>A11001</td> 1<td>:400 Verdünnung</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Anti-Maus-IgM-Antikörper</td><td>Lebenstechnologien</td><td>A21042</td> 1<td>:250 Verdünnung</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>1 &mu; g/ml</td></tr></tbody></table>

direkte induktion von humanen neuralen stammzellen aus peripherem blut hämatopoetischen vorläuferzellen

Direct Induction of Human Neural Stem Cells from Peripheral Blood Hematopoietic Progenitor Cells

Menschliche Krankheit spezifischen neuronalen Kulturen sind für die Erzeugung von in-vitro-Modellen für neurologische Erkrankungen des Menschen. Der fehlende Zugang zu primären humanen adulten neuralen Kulturen wirft jedoch einzigartige Herausforderungen. Die jüngsten Entwicklungen in induzierte pluripotente Stammzellen (iPS) bietet einen alternativen Ansatz zur neuronalen Kulturen aus Hautfibroblasten durch patientenspezifische iPS ableiten, aber dieser Prozess ist arbeitsintensiv, erfordert spezielles Know-how und große Mengen an Ressourcen und kann mehrere Monate dauern. Dies verhindert, dass die breite Anwendung dieser Technologie auf die Untersuchung von neurologischen Erkrankungen. Um einige dieser Probleme zu überwinden, haben wir eine Methode, um neurale Stammzellen direkt aus menschlichen adulten peripheren Blut abgeleitet entwickelt, unter Umgehung der iPSC Ableitungsprozesses. Hämatopoetischen Vorläuferzellen aus humanen adulten peripheren Blut angereichert wurden in vitro kultiviert und mit Sendai-Virus-Vektoren, die Transkriptionsfaktoren Sox2, Oktober transfiziert3/4, Klf4 und c-Myc. Die Transfektionsergebnisse in morphologischen Veränderungen in den Zellen, die unter Verwendung von humanen neuralen Vorläufer Medium mit basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) und den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) weiterhin ausgewählt sind. Die resultierenden Zellen werden durch die Expression neuronaler Stammzellenmarker wie Nestin und SOX2 gekennzeichnet. Diese Nervenstammzellen könnte weiter zu Neuronen, Astroglia und Oligodendrozyten in bestimmten Differenzierungsmedien unterschieden werden. Mit leicht zugänglichen menschlichen peripheren Blut-Proben, könnte diese Methode verwendet werden, um neurale Stammzellen zur weiteren Differenzierung zu Nervenzellen für In-vitro-Modellierung von neurologischen Störungen abgeleitet werden und können Studien zur Pathogenese und Behandlung dieser Krankheiten zu fördern.

<html> Die Qualität der CD34-Zellen ist kritisch für den Erfolg der neuronalen Stammzellübertragung. Hochwertige CD34-Zellen vermehren sich während der ersten paar Tage der Kultur und erscheinen als nicht haftende, homogene Rundzellen, Schwimm knapp über dem Boden der Kulturgefäße (Abbildung 1A). Die erfolgreiche Infektion führt zu Zellaggregaten, die im Laufe der Zeit (Abbildung 1B) erweitert, während unspezifische Zellaggregate können während der Zellkultur auf, die sich ausdehnen und ...

Es wurde eine Methode entwickelt, um direkt abzuleiten humanen neuralen Stammzellen aus hämatopoetischen Vorläuferzellen aus peripherem Blut Zellen angereichert.

Direkte Induktion von humanen neuralen Stammzellen aus peripherem Blut hämatopoetischen Vorläuferzellen

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, neuronale Stammzellen direkt aus Blutzellen zu induzieren. Dies wird erreicht, indem zunächst CD34-positive hämatopoetische Vorläuferzellen aus dem Blut angereichert werden. Der zweite Schritt besteht darin, die CD34-Zellen mit einem Sendai-Virus zu transfizieren, das Transkriptionsfaktoren enthält.Anschließend werden die neuronalen Stammzellen unter Verwendung eines selektiven Mediums gewonnen. Der letzte Schritt besteht darin, die induzierten neuronalen Stammzellen in Neuronen, Astroglia und Oligodendrozyten zu differenzieren. Abschließend wird die Charakterisierung der resultierenden Zellen mittels Immunfluoreszenzmikroskopie durchgeführt.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie der Differenzierung von Neuronen direkt aus Fibroblasten oder der iPS-Generierung, besteht darin, dass diese Methode den zeitaufwändigen Prozess der iPS-Generierung und Passagierung umgeht, dennoch aber eine große Menge an neuronalen Zellen liefert, die sich zu Neuronen differenzieren lassen. Ich hatte die Idee zu dieser Methode erstmals, als mir auffiel, dass angeheftete transfizierte CD34-Zellen tatsächlich einem primär kultivierten neurogenen Zelltyp stark ähneln, was zeigte, dass der Prozess funktionieren würde. Ein Techniker aus meinem Labor, Marines, führte die Durchführung durch. Nach der Isolierung der CD34-Zellen aus peripheren mononukleären Blutzellen gemäß den Anweisungen im Textprotokoll beginnen Sie mit der Kultivierung der CD34-Zellen, indem Sie die CD34-Zellen in CD34-Medium resuspendieren und anschließend die Zellen in eine 24-Loch-Platte mit drei mal 10 hoch fünf Zellen pro Vertiefung in einem Milliliter Medium einsäen.Nach einer Inkubation für 24 Stunden in einem Gewebekultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid sammeln Sie die schwebenden Zellen und zentrifugieren die Zellsuspension bei Raumtemperatur mit 110 × g. Entsorgen Sie dann den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in frischem CD34-Erhaltungsmedium. Säen Sie eine neue 24-Well-Platte mit jeweils 1 × 10⁵ Zellen pro Well in einem Milliliter Medium aus, inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius in einem Inkubator mit 5 % Kohlendioxid für fünf zusätzliche Tage und erneuern Sie alle zwei Tage die Hälfte des Mediums.Unter vorsichtigem Absaugen der oberen Hälfte des Überstandes, während sich die CD34-Zellen wie hier am fünften Tag gezeigt am Boden der Vertiefungen befinden. Nach dem Ansäen sammeln Sie die CD34-Zellen ein, zentrifugieren diese bei 170 × g für 10 Minuten bei Raumtemperatur, verwerfen den Überstand, resuspendieren die Zellen wie zuvor und säen eine neue 24-Well-Platte mit je 1 × 10⁵ Zellen pro Vertiefung in einem Milliliter Medium aus. Danach tauen Sie ein CytoTune iPS Sendai-Reprogrammierungs-Kit auf.Indem man zunächst die Unterseiten der Röhrchen 10 Sekunden lang in ein Wasserbad von 37 Grad Celsius eintaucht und sie anschließend vollständig bei Raumtemperatur auftaut. Die Röhrchen kurz zentrifugieren und auf Eis stellen. Bereiten Sie die Sendai-Virus-Mischung vor, indem Sie das auf dem Zertifikat der Analyse für die entsprechende Charge angegebene empfohlene Volumen jedes aufgeführten Virus miteinander mischen. Es wird eine Multiplizität der Infektion von 15 empfohlen. Geben Sie die Sendai-Virus-Mischung in jedes Brunnen mit CD34-Zellen. Mischen Sie anschließend die Ansätze durch vorsichtiges Schütteln der Platte.Inkubieren Sie die Zellen 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius in einem Inkubator mit 5 % Kohlendioxid. Beobachten Sie die Transduktionseffizienz. Achten Sie darauf, dass Zellaggregate und Sphären wie die hier gezeigten Hinweise auf eine erfolgreiche Transduktion sind.Anschießend die Zellen im Zellkulturgehäuse fünf bis sieben Tage lang inkubieren, bis angeheftete Zellen erscheinen und eine Konfluenz von 30 bis 50 % erreichen, wie hier alle zwei Tage gezeigt. Ersetzen Sie die Hälfte des Mediums, indem Sie vorsichtig die obere Hälfte des Mediums in eine andere Vertiefung übertragen. Falls Zellsphären in die neue Vertiefung übertragen werden, fügen Sie eine gleiche Menge frisches Medium hinzu.Überprüfen Sie die Konfluenz der Zellen mit dem umgekehrten Mikroskop. Wenn die Zellen 30 bis 50 % konfluent sind, saugen Sie den Überstand ab und heben Sie ihn auf. Geben Sie dann ein Milliliter neuronales Progenitor-Medium in jede Vertiefung, um eine Backup-Platte unter Verwendung der Sphäroide im Überstand anzulegen. Zentrifugieren Sie den aufbewahrten Überstand bei 170 × g für 10 Minuten. Saugen Sie danach den Überstand ab und resuspendieren Sie das Pellet in neuronalem Progenitor-Medium. Plazieren Sie es in einer mit Matrigel beschichteten 24-Loch-Platte. Wie zuvor sollte das Medium in jeder Zellkulturplatte im Wechsel alle zwei Tage gewechselt werden, bis die Zellen eine Konfluenz von 60 bis 80 % erreichen, was gewöhnlich nach einer Woche der Fall ist. Sobald die Zellen die erforderliche Konfluenz erreicht haben, entfernen Sie den Überstand durch Absaugen und geben Sie je einen Milliliter neuronales Stammzellmedium hinzu.Dissociieren Sie anschließend die Zellen mit einem Zellabstreifer, gefolgt von sehr vorsichtigem Pipettieren. Überführen Sie danach die Zellen aus einem der Wells der 24-Well-Platte in ein Well einer 6-Well-Platte.Fügen Sie einen weiteren Milliliter Medium in die Vertiefung hinzu und, nachdem Sie den Vorgang für alle Vertiefungen wiederholt haben, stellen Sie die 6-Loch-Platte in den 37 °C warmen 5 % Kohlendioxid-Inkubator. Wechseln Sie alle zwei Tage das gesamte Mediumvolumen, bis die Zellen eine Konfluenz von 60 % erreichen, danach dissoziieren und passagieren Sie die Zellen im Verhältnis 1 zu 3, wie gerade gezeigt, um einen Teil der undifferenzierten neuralen Stammzellen einzufrieren. Bereiten Sie zunächst das Stammzell-Einfriermedium vor, indem Sie 20 % Dimethylsulfoxid oder DMSO zum neuronalen Stammzellmedium hinzufügen und es auf Eis stellen.Dissociieren Sie anschließend die Zellen in der Sechs-Well-Platte unter Verwendung eines Zellabstreifers und vorsichtigem Pipettieren. Heben Sie eine Aliquot aus der Suspension für eine Zellzählung beiseite und zentrifugieren Sie die Zellen dann 10 Minuten bei Raumtemperatur mit 170 × g. Während die Zellen zentrifugiert werden, zählen Sie die Zellen in der beiseitegelegten Suspension unter Verwendung eines Hämocytometers oder eines automatischen Zellzählgeräts und berechnen Sie das Volumen an Medium, das erforderlich ist, um eine Zellkonzentration von 1 × 10⁶ Zellen pro Milliliter zu erreichen.Nachdem der Spinndurchlauf beendet ist, den Überstand verwerfen und das Pellet in neuronalem Stammzellmedium bei einer Konzentration von einer mal zehn hoch sechs Zellen pro Milliliter resuspendieren. Anschließend ein gleiches Volumen Gefriermittel hinzufügen, fünf mal zehn hoch fünf Zellen in einem Volumen von einem Milliliter per Pipette in ein Kryoröhrchen überführen und die Zellen gemäß den Herstelleranweisungen in einem Gefäß für das Einfrieren gefrieren. Wenn die neuronalen Stammzellen in der 6-Loch-Platte eine Konfluenz von 80 % erreicht haben, lösen Sie sie mithilfe eines Gummipolicen ab und dissoziieren Sie sie durch vorsichtiges Pipettieren.Vereinigen Sie die Zellsuspension in einem sterilen Reagenzglas. Zählen Sie die Zellen mithilfe eines Hämozytometers oder eines automatischen Zellzählgeräts und stellen Sie die Konzentration der Zellsuspension auf 1 × 10⁵ Zellen pro Milliliter mit Neuralstammzellmedium ein. Pipettieren Sie anschließend je ein Milliliter der Zellsuspension auf einen mit Poly-D-Lysin und Laminin beschichteten Deckglaser in einer Vertiefung einer 24-Loch-Platte, nachdem Sie den Vorgang für die gewünschte Anzahl an Vertiefungen wiederholt haben.Inkubieren Sie wie zuvor für 24 Stunden. Nach Ablauf der Inkubationszeit saugen Sie das Medium ab und ersetzen es durch neuronales Differenzierungsmedium. Inkubieren Sie zwei Wochen bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid, wobei das Medium zweimal pro Woche gewechselt wird.Die neuronalen Stammzellen sollten vollständig differenziert sein, wie hier gezeigt, und für nachgeschaltete Anwendungen wie Immunfluoreszenzfärbungen bereitstehen. Die ersten beiden Bilder zeigen, dass neuronale Stammzellen Nestin und SOX2 exprimieren. Während das dritte Bild demonstriert, dass OCT4 nicht exprimiert wird, dient DAPI als nuklearer Marker und die Maßstabsleiste repräsentiert 200 Mikrometer.Nach Durchführung des im Video beschriebenen Differenzierungsprotokolls exprimieren die differenzierten Neuronen den neuronalen Marker Beta-Tubulin-3. Die humanen neuralen Stammzellen können zudem in gliale Zellen differenziert werden. Bei Differenzierung in Astrozyten exprimieren die Zellen den astrozytären Marker GFAP.Schließlich sind in diesem Bild die Zellen zu Oligodendrozyten differenziert und exprimieren den Oligodendrozyten-Marker O vier. Sobald die Technik beherrscht ist, kann die Erzeugung induzierter humaner neuraler Stammzellen aus peripherem Blut innerhalb von etwa drei Wochen durchgeführt werden.Wenn korrekt durchgeführt, könnten die neuronalen Stammzellen weiter zu Neuronen differenziert werden und die Methode könnte den langwierigen und komplizierten Prozess der iPS-Zellgenerierung umgehen und nach ihrer Entwicklung eine einfache Möglichkeit bieten, patientenspezifische neuronale Kulturen zu erzeugen. Dieser Technikweg eröffnet Forschern auf dem Gebiet der Neurowissenschaften die Möglichkeit, Zellkulturmodelle einzelner Zellen für verschiedene neurologische Erkrankungen zu erforschen, die genetische Unterschiede bei spezifischen Erkrankungen – insbesondere aus Proben einzelner Patienten – möglicherweise besser widerspiegeln könnten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Wir haben ein Protokoll zur Induktion von Neuroblasten direkt von pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen unter bestimmten Bedingungen mit kleinen Molekülen, die Ableitung von einem großen Angebot an humanen neuronalen Vorläuferzellen und neuronalen Zelltypen in sich entwickelnden ZNS für neuronale Reparatur ermöglicht gepflegt eingerichtet.

Effiziente Ableitung von humanen neuronalen Vorläuferzellen und Neuronen aus pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen mit Small Molecule Induction

Hier zeigen wir, ein einfaches und effektives Protokoll für die Herstellung von menschlichen IPSCs 3-4 ml peripheres Blut unter Verwendung eines einzigen lentiviralen Vektors Umprogrammierung. Reprogrammierung von leicht verfügbaren Blutkörperchen verspricht die Nutzung von iPS-Technologie, indem sie Zugang zu einem breiteren Forschungsgemeinschaft beschleunigen.

Generation of Human induzierten pluripotenten Stammzellen aus dem peripheren Blut mit dem STEMCCA Lentivirusvektor

Dieses Video zeigt die Reprogrammierung von mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMNCs) in induzierte neurale Stammzellen (iNSCs) unter Verwendung des Sendai-Virus. Das Sendai-Virus ist ein nicht-integrierendes Virus, das ein effizientes und sicheres Vehikel für die Reprogrammierung von Zellen bietet.

Generierung von induzierten neuralen Stammzellen (iNSCs) aus mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMNCs): Ein auf dem Sendai-Virus basierendes Verfahren zur Umprogrammierung von PBMNCs in iNSCs

Dieses Video zeigt die direkte Reprogrammierung von genetisch veränderten hämatopoetischen Vorläuferzellen in neuronale Stammzellen. Transkriptionsfaktoren, die von hämatopoetischen Vorläuferzellen exprimiert werden, lösen eine Kaskade von molekularen Ereignissen aus, die ihre Umwandlung erleichtern. Weitere spezifische Medien werden verwendet, um induzierte neuronale Stammzellen zu selektieren und zu züchten.

Direkte Reprogrammierung von hämatopoetischen Vorläuferzellen in neurale Stammzellen

Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen bietet faszinierende Perspektiven für die Ableitung von autologen Transplantaten. Allerdings Progression durch einem pluripotenten Zustand und mühsame Wieder Differenzierung noch behindert klinischen Übersetzung. Hier beschreiben wir die Ableitung der erwachsenen menschlichen Fibroblasten und deren direkte Umsetzung in induzierten neuronalen Vorläuferzellen und die nachfolgende Differenzierung in neuronale Abstammungen.

Ableitung von Adult menschlichen Fibroblasten und deren direkte Umwandlung in Erweiterbar neuronalen Vorläuferzellen

Dieses Protokoll beschreibt die effiziente Induktion von hämogenem Endothel und multipotenten hämatopoetischen Vorläuferzellen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen durch die erzwungene Expression von Transkriptionsfaktoren.

Direkte Induktion von Hemogenic Endothel und das Blut durch die Überexpression von Transkriptionsfaktoren in der Personal pluripotenten Stammzellen

Wir schlagen ein Protokoll zur Reprogrammierung von mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) in induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) vor. Durch das Plattieren der transduzierten Blutzellen auf matrixbeschichtete Platten mit Zentrifugation werden iPS-Zellen erfolgreich aus schwimmenden Zellen induziert. Diese Technik schlägt ein einfaches und effektives Reprogrammierungsprotokoll für Zellen wie PBMCs und CBMCs vor.

Induzierte pluripotente Stammzellen Erzeugung von Blutzellen mit Sendai-Virus und Zentrifugation

Dieses Protokoll beschreibt eine detaillierte Methode zur effizienten Erzeugung integrationsfreier iPSCs aus menschlichen adulten peripheren Blutzellen. Durch die Verwendung von vier oriP/EBNA-basierten episomalen Vektoren zur Expression der Reprogrammierungsfaktoren KLF4, MYC, BCL-XL oder OCT4 und SOX2 können Tausende von iPS-Kolonien aus 1 ml peripherem Blut gewonnen werden.

Die Erzeugung von Integration freien induzierte pluripotente Stammzellen aus menschlichen peripheren einkernigen Blutzellen Mit Episomale Vektoren

Das Protokoll stellt die Reprogrammierung von peripheren mononukleären Blutzellen vor, um neuronale Stammzellen durch Sendai-Virusinfektion zu induzieren, Differenzierung von iNSCs in dopaminerge Neuronen, Transplantation von DA-Vorstufen in die einseitig Parkinson-Mausmodelle und Bewertung der Sicherheit und Wirksamkeit von iNSC-abgeleiteten DA-Vorstufen für die PD-Behandlung.

Generierung induzierter neuronaler Stammzellen aus peripheren mononukleären Zellen und Differenzierung zu dopaminergen Neuronenvorstufen für Transplantationsstudien

Hier stellen wir ein Protokoll zur präzisen Bildung hämogenen Endothelaus aus menschlichen pluripotenten Stammzellen in einem feeder- und xenofreien Zustand vor. Diese Methode wird breite Anwendungen bei der Modellierung von Krankheiten und beim Screening auf therapeutische Verbindungen haben.

Hämogene Endotheldifferenzierung von humanen pluripotenten Stammzellen in einem feeder- und xenofreien definierten Zustand

Hier stellen wir ein Protokoll zur immunphenotypischen Charakterisierung und Zytokin-induzierten Differenzierung von Nabelschnurblut abgeleitet CD34+ hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen zu den vier myeloischen Linien vor. Die Anwendungen dieses Protokolls umfassen Untersuchungen über die Wirkung von myeloischen Krankheitsmutationen oder kleinen Molekülen auf die myeloische Differenzierung der CD34+ Zellen.

Panmyeloische Differenzierung von humanem Cordblood abgeleitet CD34+ hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzellen

Erfahren Sie die direkte Induktion neuronaler Stammzellen aus CD34-positiven hämatopoetischen Vorläuferzellen aus peripherem Blut. Diese Methode ermöglicht die effiziente Generierung von Neuronen, Astroglia und Oligodendrozyten für die regenerative Medizin.

Direkte Induktion von humanen neuralen Stammzellen aus peripherem Blut hämatopoetischen Vorläuferzellen

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