Name: Umwelt Modulationen der Anzahl der Mittelhirn Dopamin-Neuronen in erwachsenen Mäusen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Erfahren Sie, wie Umweltmanipulationen die Anzahl der Mittelhirn-Dopamin-Neuronen bei erwachsenen Mäusen modulieren. Diese Methode untersucht geschlechtsspezifische Paarung und angereicherte Umgebungen.

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Diese Studie wurde durch den Projektzuschuss des National Health and Medical Research Council of Australia (NHMRC) 1022839 unterstützt. AJH ist FT3 Future Fellow (FT100100835 des Australian Research Council (ARC). Das Florey Institute of Neuroscience and Mental Health bedankt sich für die Unterstützung durch den Operational Infrastructure Support Grant der Regierung von Victoria.

HINWEIS: Alle experimentellen Verfahren an Tieren wurden durch die Florey Institut für Neurowissenschaften und psychische Gesundheit Tierethikkommission genehmigt und entsprechen den australischen National Health und Medical Research Council veröffentlichten Verhaltenskodex für die Pflege und Verwendung von Tieren zu wissenschaftlichen Zwecken (7. Auflage, 2004). 1. Umwelt Manipulationen <ol><li> Geschlecht Pairing <ol><li> Verwenden geschlechtsreif (&gt; 8 Wochen alt), bei gleichaltrigen männlichen und weiblichen Mäusen. HINWEIS: Wir verwenden in der Regel C57BL / 6 Mäusen, haben aber die gleichen Ergebnisse mit Swiss-Mäusen in diesem Protokoll hatte. Wir verwenden in der Regel n = 8 Männchen und n = 8 Frauen für jedes Experiment, eingeteilt in n = 2 Stecker-Stecker-Paare (n = 4 Männer), n = 2 Buchse-Buchse-Paare (n = 4 Frauen) und n = 4 Mann-Frau-Paare (n = 4 Rüden und n = 4 Frauen). </li><li> Nach der Ankunft in den Tierhalteeinrichtung, Gruppenhaus die Mäuse nach Geschlecht für&gt; 3 Tage zu akklimatisieren. Hier und throughout das Geschlecht Paarung halten fremde Reize aus der Umwelt (zB Umgebungstemperatur, Licht: Dunkel-Zyklus, Nahrung, Wasser, Handhabung und Reinigung) konstant oder gleichmäßig zu verteilen, um allen Mäusen. </li><li> Jede Maus zufällig ordnet einem Stecker-Stecker-Paar, eine Buchse-Buchse-Paar oder eine Mann-Frau-Paar. Legen Sie jedes Paar in einen sauberen Käfig isoliert (2 Mäuse / Käfig) mit freien Zugang zu Nahrung und Wasser, und einfach zu beherbergen sie auf diese Weise kontinuierlich für 7 Tage. HINWEIS: Routinetierhaltung ist in diesem Zeitraum OK sondern muss gleichermaßen für alle Mäuse verteilt werden. Achten Sie darauf, Paarung von männlichen und weiblichen Geschwistern zu vermeiden. </li></ol></li><li> Umwelt Enrichment <ol><li> Verwenden geschlechtsreif (&gt; 8 Wochen alt), bei gleichaltrigen männlichen oder weiblichen Mäusen. HINWEIS: Wir verwenden typischerweise n = 18 Mäuse pro Experiment in n = 6 / Behandlungsgruppe eingeteilt. </li><li> Nach der Ankunft in den Tierhalteeinrichtung halten sie in Gruppen gehalten in identischen Standard untergebracht (SH) (zB </em&gt; Siehe unten) Bedingungen in dieser Phase für&gt; 3 Tage zu akklimatisieren. Hier und im gesamten Experiment halten fremde Reize aus der Umwelt (zB Umgebungstemperatur, Licht: Dunkel-Zyklus, Nahrung, Wasser, Handhabung und Reinigung) konstant oder gleichmäßig zu verteilen, um allen Mäusen. </li><li> Zur Anreicherung der Umwelt zu beginnen, nach dem Zufallsprinzip jedes Maus an einen der drei Gruppen zu: SH; Laufrad (RW) oder Umwelt angereichert (EE) und platzieren Sie jede Gruppe von Mäusen, die zusammen in einem identischen sauberen Käfig mit freien Zugang zu Nahrung und Wasser. HINWEIS: Hier größeren Rattenhaltekäfige für alle Gruppen, die Messung 27 cm breit, 42 cm lang und 16 cm Tiefe wurden verwendet. <ol><li> Darüber hinaus bieten die folgenden Umweltbedingungen für jede Gruppe: SH, das nur Wurf (Papier Pellets oder Sägemehl) auf dem Boden; RW mit SH + 2 Laufräder; EE aus RW und Spielzeuge (Seile, Leitern, Tunnel und Objekte wie leere Papierrollen und Stücke von Tissue-Papier), mit dem Explore, spielen, klettern, verstecken und Nest. </li><li> Haus sie auf diese Weise kontinuierlich für 14 Tage. HINWEIS: Routinetierhaltung ist in diesem Zeitraum OK sondern muss gleichermaßen für alle Mäuse verteilt werden. </li></ol></li><li> Betreff EE Mäusen zusätzliche &quot;Super-Bereicherung&quot; (SE), indem Sie sie zusammen in einen größeren Käfig mit Roman Spielzeug für 1 Stunde / Tag (gleiche Stunde pro Tag), 5 Tage / Woche. HINWEIS: Hier wird eine 46 cm breit, 69 cm lang und 40 cm tiefe Kunststoffwanne verwendet wurde. <ol><li> Pflegen Neuheit, indem sie eine andere Gruppe von Spielzeug jede Sitzung. Reinigen Sie Spielzeug, das sind an Mäusen mit Seifenwasser und 80% Ethanol, um Gerüche zu entfernen erneut vorgelegt werden. </li><li> Nach jeder SE Sitzung geben die Mäuse auf ihre EE Käfig. Handle SH und RW Mäusen das gleiche wie SE-Mäuse (mit Ausnahme der SE selbst) in diesem Zeitraum (zB entfernen und jedes SH und RW Maus aus und in seinen Käfig). </li></ol></li></ol></li></ol><ol><li> Zubereitung <ol><li> Steriles osmotische Pumpen und Gehirninfusionssets, die im Handel erhältlich sind. Am Tag vor der Implantation unter aseptischen Bedingungen, Prime die Implantate, indem jede Pumpe, Verbindungsrohr und Kanüle mit steriler Arzneimittel oder Vehikel-Lösung (wie in der Anleitung mit den Pumpen geliefert beschrieben). Schließen Sie sie zusammen und Inkubation in steriler Kochsalzlösung über Nacht bei 37 ° C. Inkubieren drogen- und Fahrzeug gefüllte Implantate getrennt um eine Kreuzkontamination zu vermeiden. </li></ol></li><li> Chirurgie. HINWEIS: Je nach Land des Experimentators, werden spezielle Tierversuche Genehmigungen oder Zertifikate erforderlich, um solche Arten von Operationen und postoperative Experimente verfolgen. <ol><li> Sterilisieren Sie alle chirurgischen Geräten und beschäftigen aseptischen Bedingungen in ganz. Anesthetize eine Maus (zB mit 1-2% Isofluran in Luft) und legen Sie sie in einem Sterotaxic Förderturm. Überprüfen Sie die Narkosetiefe während des gesamten Verfahrens und zu verwalten, weiter Betäubung bei Bedarf (zB Fehlen von Gliedmaßen Rückzug auf schädliche Pfote Prise ist ein Hinweis auf eine adäquate Anästhesie). Stellen Sie sicher, die Augen vor Austrocknung durch Schmiermittel Augensalbe geschützt werden und dass die Körpertemperatur der Maus die bleibt während des gesamten Verfahrens normal. </li><li> Machen Sie einen Mittelschnitt durch die Haut ab zwischen den Augen und Finishing 2 cm an der hinteren Kante des Schädels posterior. Blunt die Haut von der darunter liegenden Faszie über den Rücken der Maus zu zerlegen, um eine subkutane &quot;Tasche&quot; groß genug, um bequem zu passen die Pumpe und Verbindungsrohr sobald die Kanüle implantiert ist (das Verbindungsrohr nicht bei Beendigung gebogen werden) zu erzeugen. Kratzen Sie deaktivieren Sie die Blende aus über die Dorsalseite des Schädels. </li><li> Mit einer etwa 1,5 mm Durchmesser Zahn Grat, einen Drilldown in den Schädel zu dem entsprechenden stereotaktischen Koordinaten until eine dünne, flexible Schicht der Knochenreste. Peel diese Schicht entfernt mit feinen Pinzetten (dies vermeidet eine Beschädigung des darunter liegenden harten Hirnhaut und des Gehirns mit dem dentalen Bohrers). Stellen Sie sicher, der Schädel aller Blut- und Knochenfragmente zu reinigen, und dass es keine weiteren Blutungen. </li><li> Mit der Kanüle durch einen Kanülenhalter gehalten wird, setzen Sie die Pumpe und Verbindungsrohr in das Unterhaut &quot;Tasche&quot;, die über die Maus zurück. Als nächstes stellen Sie den Spitze der Kanüle an den entsprechenden stereotaktischen Koordinaten und auf der Oberfläche des Gehirns. Die Kanüle in das Gehirn vorsichtig absenken aber halt ca. 1 mm vor der gewünschten Tiefe. ANMERKUNG: Die restlichen Tiefe wird nach Aufbringen der ersten Schicht aus Dentalacryl ausgehandelt werden. </li><li> Wieder sicher, dass die Oberfläche des Schädels sauber und trocken ist, dann bereiten Sie ein kleines Volumen der zahnärztlichen Acryl und mit einem Zahnstocher, um sie über die gesamte freiliegende Fläche des Schädels zu glätten, einschließlich in den Grat-Loch durch den Schädel um the Kanüle. Bevor der Acryl härtet, senken die Kanülenspitze die verbleibende Tiefe in das Ziel. </li><li> Bereiten weiteres kleines Volumen der Dentalacryl und Schicht dieses über den ersten als auch über dem weißen Kunststoffträger für die Kanüle, um die Kanüle zu fixieren. Wiederholen mit zusätzlichen Schichten aus Acryl, wie notwendig. </li><li> Sobald die Acrylausgehärtet ist, entfernen Sie vorsichtig den Kanülenhalter und schneiden Sie die weiße Kunststoff abnehmbare Registerkarte Kanüle mit einer Skalpellklinge mit einer Butanflamme erhitzt. Schließlich Naht der Haut über das gesamte Implantat geschlossen. </li></ol></li><li> Postoperative Behandlung der Tiere <ol><li> Bewerben Wundsalbe auf die Haut Margen und verwalten eine entzündungshemmende, um der Maus (zB Meloxicam, 3 mg / kg sc). Entfernen Sie die Maus aus dem Rahmen, legen Sie sie unter einer Wärmelampe, und beobachten Sie, bis er wieder zu sich kommt. Sie eine Maus, die Operation, um der Gesellschaft von anderen Tieren unterzogen wurde, bis vollständig erholt nicht zurück. HINWEIS: Experimental Manipulationen wie Geschlecht Paarung und Umwelt Anreicherung begonnen oder wieder aufgenommen am Tag nach der Operation so früh werden. </li><li> Überwachung ihres Körpergewichts, allgemeinen Verhalten und Aussehen täglich. Behandeln Sie Anzeichen einer Infektion (zB Schwellung, Rötung, Eiter) um chirurgische Einschnitte mit topischen Wundsalbe. Gönnen keine Anzeichen Krankheit, Schmerzen, Stress oder Unbehagen (zB Verlust von&gt; 10% des Körpergewichts, sozialer Rückzug, mangelnde Pflege, &quot;Flusen&quot;, Bewegung Dysfunktion, Krampfanfälle) mit systemischen Analgetika und / oder Antibiotika wie nötig. </li><li> Euthanize Mäusen, wenn&gt; 15% Gewichtsverlust oder Symptome einer Krankheit, Schmerzen, Stress oder Unbehagen sind nicht behebbar innerhalb 1 Woche nach Heilbehandlung. </li></ol></li></ol> 3. Hirngewebepräparation, Immunhistochemische Verarbeitung und Stereologie <ol><li> Perfusion <ol><li> Unmittelbar nach ökologischen / Droge Manipulationen, bereiten das Gehirn für die Studie. <br/&gt; Hinweis: In den Experimenten hier berichtet die Anzahl von SNc TH + Neuronen wurden gemessen und in jeder der Behandlungsgruppen. </li><li> Erste verwalten eine Überdosis des Narkosemittels, um die Mäuse zu töten (zB 100 mg / kg ip Natriumpentobarbiton). Einmal betäubt, aber bevor das Herz aufhört zu schlagen, legen Sie die Maus auf den Rücken und Krawatte oder fassen beide Vorderbeine. </li><li> Mit einem Skalpell weggeschnitten die Haut über der Thorax dann durch den Muskel gerade unterhalb des Brustkorbs einschneiden in die Bauchhöhle. Legen Sie eine Klemme an der Schwertfortsatz des Brustkorbs und heben Sie den Brustkorb nach oben und weg von der Leber Freilegung der Membran. </li><li> Schnitt durch die Membran und durch die Rippen seitlich auf beiden Seiten mit großen Scheren, bis der Brustkorb kann über den Kopf, um die Lunge und Herz aussetzen zurückgeklappt werden. Mit einer feinen Schere machen einen kleinen Schnitt im rechten Vorhof als Ausgangspunkt für Blut und Lösungen durchströmt, dann durch die Basis des linken ventri geschnittenkel und legen eine Kanüle nach oben durch den linken Ventrikel, dem linken Atrium und in der Aorta. </li><li> Klemmen Sie die Kanüle an Ort und Stelle dann Pumpe warm (37 ° C) mit Heparin und 0,1 M phosphatgepufferter physiologischer Kochsalzlösung (PBS) durch das Gefäßsystem, bis die Lösung Verlassen des rechten Vorhof ist völlig frei von Blut. Als nächstes wird die Pumpe kaltem (4 ° C) Fixierlösung (wie beispielsweise 4% Paraformaldehyd in PBS) durch das Gefßsystem, bis der gesamte Maus ist gut fixiert. Entfernen Sie das Gehirn und in PBS mit 30% Saccharose für 2-3 Tage, bis das Gehirn sinkt. Hinweis: andere Arten von Gewebe Vorbereitung könnte abhängig von der Expertise in der entsprechenden Labor angewendet werden. </li></ol></li><li> Vorbereitung der im Streubesitz befindlichen Kryoschnitte <ol><li> Schneiden Sie die Serienschnitte durch die Hirnregionen von Interesse und sammeln diese in PBS. HINWEIS: Wir schneiden 40 &amp; mgr; m dicke Schnitte mit Hilfe eines Kryostaten. Andere Arten von Gewebe Schnitte können je nach Know-how in den entsprechende angewendet werdenng Labor. </li></ol></li><li> Immunhistochemie <ol><li> Führen Standard Immunhistochemie für Proteine ​​von Interesse. Abschnitte in 5% normalem Ziegenserum und 0,3% Triton X-100 in PBS bei Raumtemperatur inkubiert für 30 min, dann eine Immunreaktion mit einem polyklonalen Kaninchen-Anti-TH (1: 400) bei 4 ° C für 48 Stunden inkubiert, anschließend polyklonaler biotinylierter Ziege-Anti -rabbit (1: 1000) bei Raumtemperatur für 2 Std. </li><li> Weiter, Inkubation in Avidin-Peroxidase (1: 500) bei Raumtemperatur für 1 h, dann in Kobalt- und Nickel-verstärkten Diamino-benzidin (0,5 mg / ml) bei Raumtemperatur für 18-20 min; für die letzten 3-5 min der Diamino-Benzidin Inkubation Zugabe von Wasserstoffperoxid (0,01%) an Chromogen Ausfällung katalysieren. Dreimal für 10 Minuten jeden Waschabschnitte in PBS vor, nach und zwischen jeder der oben genannten Schritte. </li><li> Montieren Sie die Abschnitte über verkleistert Objektträger, Luft trocknen, dann Nissl-Färbung (neutral rot), entwässern in Alkohol, klar (X-3B) und Deckglas. </li></ol></li><li&gt; Stereologie <ol><li> Schätzen Sie die Gesamtzahl der TH + und TH- SNc (und VTA und LC) Neuronen mit unvoreingenommene stereo Methoden. Stellen Sie sicher, dass die stereologist ist blind für die Behandlung erhalten. Ausschließen Glia auf der Grundlage Soma Durchmesser &lt;5 um und zählen nur jene Zellen, die mit einem sichtbaren Kern. </li><li> Identifizieren Sie die SNc (und VTA und LC) von den räumlichen Positionen der TH + Zellen und anatomischen Landmarken / Grenzen nach den Hirnatlas von Paxinos und Watson 7. Graf TH + Zellen innerhalb einer Zählung Rahmen (55 x 55 &amp; mgr; m = 3025 &amp; mgr; m 2) in regelmäßigen vordefinierten Zeitabständen (x = 140 um, y = 140 um für SNc; x = 100 um, y = 100 &amp; mgr; m für VTA und LC) während jeder Kern in jedem vierten Abschnitt. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Umwelt Manipulationen Die Motivation für die Gestaltung dieser Umwelt Manipulationen (Geschlecht Paarung und Umweltanreicherung) war es, ob die Umwelt zu bestimmen, und / oder das Verhalten von der Umwelt aufgefordert, sich mit den Veränderungen in der Anzahl der Mittelhirn DA Neuronen verbunden. Der Schwerpunkt lag daher auf die Bereitstellung von Umgebungen und stimulierende Verhaltensweisen, die wahrscheinlich im Mittelhirn DA Signal engagieren. Dazu gehörten Paarung mit dem ande...

DArgic Signalisierung von Neuronen im ventralen Tegmentum (VTA) und Substantia nigra pars compacta (SNC) des Mittelhirns wird als wichtig für die Belohnung motiviert kognitive, emotionale und motorische Verhaltensweisen sein. Jedoch verursacht zu viel oder zu wenig Mittelhirn DA Signal viele behindernden Symptome in einer Vielzahl von neurologischen Erkrankungen (zB Parkinson-Krankheit, Aufmerksamkeitsdefizit und Hyperaktivität, Schizophrenie und Drogenabhängigkeit). Medikamente, die erhöhen oder zu verringern DA Signal diese Symptome zu lindern, aber sie produzieren auch Nebenwirkungen zuzuschreiben fehlregulierte Signal und Nebeneffekte. Wirksamkeit von Medikamenten auch lehnt Laufe der Zeit durch kompensatorische Reaktionen des Gehirns. Die Herausforderung besteht daher darin, normale Mittelhirn DA Signal gezielter und physiologische Weise wiederherzustellen, und eine bevorzugte Ansatz ist durch Erhöhung oder Verringerung der Anzahl von Mittelhirn DA Neuronen. Der Nachweis wurde für sev angesammeltrere Jahrzehnte, dass die Expression von Genen und Proteinen in Metabolisierung und Menschenhandel DA und andere Katecholamine in reifen Erwachsenen Zellen beteiligt ist änderbar (in 1 überprüft). Im Mittelhirn, die Zahl der Tyrosin-Hydroxylase immun (TH +, der geschwindigkeitsbestimmende Enzym im DA-Synthese) Neuronen sinkt dann erhöht folgenden Neurotoxin Verwaltung 2,3, während die Zahl der TH immunonegative (TH) Neuronen zeigt das Gegenteil Muster (dh steigt dann ab 3). Dies ist konsistent mit dem Verlust dann der &quot;DA Phänotyp &#39;von einigen Zellen zu gewinnen. Die Anzahl der TH + und TH- SNc Neuronen wurde auch gezeigt, die in gleichen aber entgegengesetzten Richtungen nach verschiedenen Behandlungen, die die elektrische Aktivität der Zellen zu verändern 4,5 ändern. Zum Beispiel Infusion des kleinen Leitwert, Calcium-aktivierten Kalium (SK) Kanalantagonist Apamin in Hirn für 2 Wochen verringert die Zahl der TH + und erhöht (durch die gleiche Menge) die number der TH SNc Neuronen 4,5. Demgegenüber Infusion des SK-Kanalagonisten 1- EBIO erhöht die Anzahl der TH + und verringert (um den gleichen Betrag) die Anzahl der TH- SNc Neuronen 4,5. Ähnliche Veränderungen wurden im Anschluss an eine Vielzahl von Behandlungen Targeting SNc neuronale Aktivität, darunter auch einige, die afferenten Eingänge 4 gezielt zu sehen. Dieser scheinbare Regelung der Anzahl der SNc DArgic Neuronen durch neuronale Aktivität und afferenten Input ergibt sich die Möglichkeit, die Umwelt oder das Verhalten können die Anzahl der SNc Neuronen beeinflussen. Tatsächlich erwachsenen Mäusen zu verschiedenen Umgebungen ausgesetzt sind, mehr oder weniger Mittelhirn (SNC und VTA) TH + -Neuronen, und zumindest einige dieser Umgebungsbedingte Änderungen werden durch die gleichzeitige Blockade der synaptischen Eingangs im Mittelhirn 6 aufgehoben. Die Ziele dieser Mitteilung sind: (1) liefern weitere Details über, wie wir unsere Umwelt Manipulationen und Drogen Infusionen umzusetzen; und (2) liefern weitere Daten unterstützen unsere Behauptung, dass der environment regelt die Anzahl von Mittelhirn DA Neuronen, über Zuflüsse.

<table><tbody><tr><td>Isofluorane</td><td>Baxter Healthcare Pty Ltd, Baxter Drive, NSW 2146, Australien</td><td>AHN3640</td><td></td></tr><tr><td>ALZET Osmotische Pumpe 1002</td><td>DURECT Corporation, Postfach 530 Cupertino, CA 95015-0530</td><td>0004317</td><td></td></tr><tr><td>ALZET Infusionsset für das Gehirn 1</td><td>DURECT Corporation, Postfach 530 Cupertino, CA 95015-0530</td><td>0004760</td><td></td></tr><tr><td>ALZET Kanülenhalter 1</td><td>DURECT Corporation, Postfach 530 Cupertino, CA 95015-0530</td><td>0008860</td><td></td></tr><tr><td>Vertex Monomer Selbsthärtend (dentales Acryllösungsmittel)</td><td>Vertex Dental, Postbus 10, 3700 AA ZEIST, Niederlande</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Vertex Self Curing (dentales Acrylpulver)</td><td>Vertex Dental, Postbus 10, 3700 AA ZEIST, Niederlande</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>METACAM (Meloxicam)</td><td>Troy Laboratories, 98 long Street, smithfield NSW 2164 Australien</td><td>L10100</td><td></td></tr><tr><td>Natrium-Pentobarbiton</td><td>Lethabarb, Virbac, Milperra, NSW, Australien</td><td>571177</td><td></td></tr><tr><td>Normales Ziegenserum-Chemicon-Temecula</td><td>, CA</td><td>S26-Liter-Triton</td><td></td></tr><tr><td>X-100</td><td>Merck Millipore Hauptquartier&nbsp;, 290 Concord Road, Billerica, MA 01821</td><td>1.08603.1000</td><td></td></tr><tr><td>Polyklonales Kaninchen Anti-Tyrosin-Hydroxylase</td><td>Merck Millipore Hauptquartier&nbsp;, 290 Concord Road, Billerica, MA 01821</td><td>AB152</td><td></td></tr><tr><td>Polyklonales biotinyliertes Ziegen-Anti-Kaninchen</td><td>Dako Australia Pty. Ltd., Suite 4, Level 4, 56 Berry street, North Sydney, NSW, Australien 2060</td><td>EO432</td><td></td></tr><tr><td>Avidinperoxidase</td><td>Sigma-aldrich, Castle Hill, NSW 1765 AU</td><td>A3151-1mg</td><td></td></tr><tr><td>Diamino-benzidin</td><td>Sigma-aldrich, Castle Hill, NSW 1765 AU</td><td>D-5637</td><td></td></tr><tr><td>Stereo-Ermittler</td><td>MicroBrightField Bioscience, 185 Allen Brook Lane, Suite 101, Williston, VT 05495</td><td>n/a</td><td></td></tr></tbody></table>

umwelt modulationen der anzahl der mittelhirn dopamin-neuronen in erwachsenen mäusen

Environmental Modulations of the Number of Midbrain Dopamine Neurons in Adult Mice

Lang anhaltende Veränderungen im Gehirn oder &quot;Plastizität des Gehirns&quot; zugrunde liegen, adaptives Verhalten und Gehirn Reparatur nach Krankheit oder Verletzung. Des Weiteren können Wechselwirkungen mit der Umwelt Plastizität des Gehirns induzieren. In zunehmendem Maße wird Forschung versucht zu ermitteln, welche Umgebungen Plastizität des Gehirns vorteilhaft für die Behandlung des Gehirns und Verhaltensstörungen zu stimulieren. Zwei Umwelt Manipulationen beschrieben, die Erhöhung oder Verringerung der Anzahl der Tyrosin-Hydroxylase immun (TH +, das geschwindigkeitsbestimmende Enzym in Dopamin (DA) Synthese) Nervenzellen im erwachsenen Maushirn. Die erste umfasst Paarung männlichen und weiblichen Mäusen zusammen kontinuierlich für 1 Woche, das Mittelhirn TH + Neuronen bei Männern steigt um ca. 12%, verringert jedoch Hirn TH + Neuronen um ca. 12% bei Frauen. Die zweite besteht aus Gehäuse-Mäuse kontinuierlich für 2 Wochen im &quot;angereicherten Umgebungen&quot; (EE), die Laufräder, Spielzeug, Seile, Nistmaterial usw., die icherhöh Mittelhirn TH + Neuronen von ca. 14% bei Männern. Darüber hinaus wird ein Protokoll zur gleichzeitigen Infusion von Medikamenten direkt in das Mittelhirn in diesen Umwelt Manipulationen zur Identifizierung Mechanismen umweltinduzierten Plastizität des Gehirns zugrunde liegenden beschrieben. Beispielsweise ist EE-Induktion größer Hirn TH + -Neuronen durch gleichzeitige Blockade von synaptischen Eingangs auf Mittelhirnneuronen aufgehoben. Zusammen zeigen diese Daten, dass die Informationen über die Umgebung über synaptischen Eingang zum Mittelhirn-Neuronen übertragen, um ein oder aus Ausdruck &quot;DA&quot; Gene zu wechseln. So geeigneten Umweltreize oder Drug-Targeting der zugrunde liegenden Mechanismen, könnte hilfreich sein für die Behandlung von Hirn- und Verhaltensstörungen Ungleichgewichte im Mittelhirn DA in Verbindung gebracht werden (zB Parkinson-Krankheit, Aufmerksamkeits-Defizit-und Hyperaktivitätsstörung, Schizophrenie und Drogenabhängigkeit).

Erwachsene Mäuse diesen Umwelt Manipulationen unterworfen wurden Zahlen Hirn (SNC und VTA), aber nicht LC verändert, TH + -Neuronen und EE sowie gleichzeitige Hirn Infusion von Picrotoxin oder Bicucullin (GABA A-Rezeptor-Antagonisten) aufhebt EE-Induktion größer SNc TH + Neuronen. Diese Daten wurden zuvor in 6 veröffentlicht. Die vorliegenden Daten wurden in Wiederholungsversuchen als Teil dieser früheren Studie durchgeführt zusammengestellt, aber noch nicht an anderer Stelle veröffentlicht. <p...

Dieses Protokoll beschreibt zwei verschiedene Umweltmanipulationen und ein gleichzeitiges Gehirninfusionsprotokoll, um umweltinduzierte Gehirnveränderungen zu untersuchen, die dem adaptiven Verhalten und der Gehirnreparatur bei erwachsenen Mäusen zugrunde liegen.

Umwelt Modulationen der Anzahl der Mittelhirn Dopamin-Neuronen in erwachsenen Mäusen

Long-lasting changes in the brain or &#8216;brain plasticity&#8217; underlie adaptive behavior and brain repair following disease or injury. Furthermore, ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, kontrollierte Umweltbedingungen bereitzustellen, die die Plastizität des Gehirns und Veränderungen im Verhalten bei Mäusen fördern. Dies wird erreicht, indem Mäuse entweder in gemischtgeschlechtlichen Paaren (männlich-weiblich) oder in gleichgeschlechtlichen Kontrollpaaren (männlich-männlich bzw. weiblich-weiblich) untergebracht werden, um die Auswirkungen einer langfristigen Geschlechterkombination auf das Gehirn zu untersuchen. Alternativ können die Tiere auch gemeinsam in Käfigen gehalten werden, die mit verschiedenen Gegenständen zur Erkundung und zum Spielen ausgestattet sind, im Vergleich zu Standardkäfigen, um die Effekte einer Umweltanreicherung auf das Gehirn zu erforschen. Weitere Behandlungen, wie die Verabreichung von Wirkstoffen, können zu diesen Umweltreizen hinzugefügt werden, um die Mechanismen hinter den beobachteten Veränderungen im Gehirn und im Verhalten besser zu identifizieren.Die Ergebnisse zeigen, dass diese Umweltanreicherungen und Behandlungen veränderungen in der Anzahl der dopaminergen Neuronen des Mittelhirns hervorrufen, die von der synaptischen Übertragung durch GABAerge Neuronen im Mittelhirn abhängig sind. Die Umweltanreicherung ist ein Paradigma, das die somatosensorische, motorische und kognitive Stimulation bei Mäusen erhöht. Mithilfe dieses Ansatzes haben Studien eine gesteigerte Neuroplastizität sowie Verbesserungen beim Lernen und Gedächtnis in zahlreichen Krankheitsmodellen nachgewiesen.Die Auswirkungen dieser Technik reichen bis zum Verständnis der Mechanismen der Plastizität des erwachsenen Gehirns, die durch Umwelteinflüsse hervorgerufen wird. Dies ist relevant für die Behandlung vieler Erkrankungen des Gehirns und der Psyche. Wir hatten erstmals die Idee zu dieser Methode, als wir bemerkten, dass die Anzahl der dopaminergen Neurone im Mittelhirn sich verändert, wenn die durch synaptische Eingänge gesteuerte Aktivität der Mittelhirn-Neurone gestört wird.Die visuelle Demonstration der osmotischen Pumpe und der Gehirninfusionskanüle kann entscheidend sein, da sich die Verfahren ansonsten schwer erlernen lassen. Schriftliche Beschreibungen für die Geschlechterpaarung. Gruppenhaltung geschlechtsreifer, altersabgestimmter männlicher und weiblicher Mäuse nach Geschlecht, wobei Verpaarungen aus demselben Wurf vermieden werden. Platziere jedes Tier zufällig als männliche-männliche, weibliche-weibliche oder männliche-weibliche Paarung in einem sauberen Käfig in Isolation mit freiem Zugang zu Futter und Wasser hier und während der gesamten Dauer der Geschlechterpaarung.Halten Sie alle zusätzlichen Umweltreize konstant oder gleichmäßig auf alle Mäuse verteilt und halten Sie die Tiere kontinuierlich sieben Tage lang. Verwenden Sie zur Umweltanreicherung sexuell reife, altersgerechte männliche oder weibliche Mäuse, die zufällig einer von drei Gruppen zugewiesen werden: Standardhaltung, Laufrad oder umweltangereicherte Haltung, und das mindestens drei Tage lang. Belassen Sie sie in diesem Zustand.Bei ad libitum-Zugang zu Futter und Wasser für 14 Tage. Während der Umweltanreicherung sollte der Standardkäfig nur Einstreu enthalten. Das Laufrad sollte Einstreu sowie zwei Laufräder enthalten, und die umweltangereicherte Haltung sollte Einstreu, zwei Laufräder und Spielzeug enthalten.Unterziehen Sie die umweltangereicherten Mäuse einer zusätzlichen Superanreicherung, indem Sie sie täglich eine Stunde lang gemeinsam in einen größeren Käfig mit neuen Spielzeugen bringen. Gleichzeitig kehren Sie die Mäuse an fünf Tagen pro Woche jeweils zur gleichen Tageszeit in ihren umweltangereicherten Käfig zurück. Bewahren Sie nach jeder Sitzung die Neuheit, indem Sie für jede Sitzung eine andere Spielzeugauswahl bereitstellen.Reinigen Sie alle Spielzeuge, die den Mäusen erneut vorgelegt werden sollen, mit Seifenwasser und 80 % Ethanol. Um jegliche Gerüche zu entfernen, tauschen Sie die standardmäßig untergebrachten Gruppen mit Laufrad täglich zur gleichen Zeit und für eine vergleichbare Dauer aus, jedoch ohne Zugabe der zusätzlichen Anreicherungsmaterialien am Tag vor der Implantation. Füllen Sie unter aseptischen Bedingungen gemäß den Herstelleranweisungen jeden sterilen osmotischen Pumpen, Verbindungsrohr und Kanüle mit steriler Wirkstoff- oder Fahrzeuglösung.Verbinden Sie anschließend die Teile miteinander und inkubieren Sie sie am Tag der Operation über Nacht in steriler Kochsalzlösung bei 37 Grad Celsius. Nachdem Sie die Sedierung durch einen Zehenzwicktest bestätigt haben, tragen Sie Augensalbe am Tier auf und legen es in Rückenlage auf eine Wärmematte. Öffnen Sie dann unter aseptischen Bedingungen einen medianen Hautschnitt, beginnend zwei Zentimeter hinter der Hinterkante des Schädels bis zwischen die Augen, und lösen Sie die Haut vorsichtig stumpf vom darunterliegenden Fasziengewebe entlang des Rückens der Maus ab, um eine subkutane Tasche zu bilden, die groß genug ist, um die Pumpe und die Verbindungsleitung bequem aufzunehmen.Reinigen Sie dann die Faszie von der dorsalen Schädeloberfläche und verwenden Sie einen etwa 1,5 Millimeter durchmessenden Zahnbohrer, um bis zu den entsprechenden stereotaktischen Koordinaten in den Schädel hinein zu bohren, bis eine dünne, flexible Knochenlage übrig bleibt. Entfernen Sie diese Schicht vorsichtig mit feiner Pinzette. Sobald der Schädel von Blut und Knochenfragmenten befreit ist und keine weitere Blutung auftritt, platzieren Sie mithilfe eines Kanülenhalters die Pumpe und die Verbindungsleitung in die soeben geschaffene Tasche. Positionieren Sie nun die Kanülenspitze an den entsprechenden stereotaktischen Koordinaten auf der Oberfläche des Gehirns und senken Sie das Schlauchsystem dann vorsichtig bis auf einen Millimeter unterhalb der erforderlichen Tiefe in das Gehirn ab.Stellen Sie sicher, dass die Schädeloberfläche erneut sauber und trocken ist, und verwenden Sie dann einen Zahnstocher, um frisch zubereiteten dentalen Kunststoff gleichmäßig über die gesamte freiliegende Schädelfläche aufzutragen, einschließlich in die Bohrlöcher um die Kanüle herum, bevor der Kunststoff aushärtet. Senken Sie die Kanülenspitze um die verbleibende Tiefe in das Zielgebiet ab. Sobald die Kanüle korrekt positioniert ist, tragen Sie vorsichtig eine zweite Schicht frisch zubereiteten dentalen Kunststoffs auf den Schädel sowie auf den weißen Kunststoffträger zur Fixierung der Kanüle auf, um diese zu sichern.Nachdem sich das Acryl verhärtet hat, den Kanülenhalter vorsichtig entfernen und eine erhitzte Skalpellklinge verwenden, um durch die Kunststoffkanülenlasche zu schmelzen. Anschließend die Haut über dem gesamten Implantat mit einer Naht verschließen. Antiseptische Salbe auf die Hautränder auftragen und dem Tier ein entzündungshemmendes Medikament verabreichen.Entfernen Sie schließlich die Maus aus dem Rahmen. Stellen Sie sie unter eine Wärmelampe und überwachen Sie das Tier, bis es sich vollständig erholt hat. Adulte männliche Mäuse, die sieben Tage lang mit adulten weiblichen Mäusen zusammengehalten wurden, weisen etwa 12 % mehr mittelhirnige TH-positive Neuronen in der SNC-Area auf als Mäuse, die mit Männchen gepaart wurden.Im Gegensatz dazu weisen Weibchen, die mit Männchen gepaart sind, etwa 12 % weniger TH-positive Neuronen im SNC auf als Weibchen, die mit Weibchen gepaart sind. Die Anzahl der TH-positiven Neuronen im SNC und im ventralen Tegmentalareal ist ebenfalls bei adulten männlichen Mäusen erhöht, die 14 Tage lang einer umweltangereicherten Paarung plus Superanreicherung ausgesetzt waren. Bei Tieren mit umweltbedingter Anreicherung plus Superanreicherung und gleichzeitiger Applikation des Fahrzeugmittels wurden etwa 14 % mehr TH-positive SNC-Neuronen beobachtet.Dann zeigen standardmäßig gehaltene Tiere, die mit Vehicle infundiert wurden, sowie Tiere, die einer umweltbereicherten plus Super-Anreicherungs-Haltung mit GABAA-Rezeptor-Antagonisten-Infusion unterzogen wurden, diesen Anstieg jedoch nicht. Bei der Durchführung von Umweltmanipulationen ist es wichtig, Störungen für die Tiere auf ein Minimum zu beschränken, beispielsweise indem Lärm vermieden und Käfigwechsel eingeschränkt werden. Bei der Einrichtung einer angereicherten Umgebung ist es entscheidend, abwechslungsreiches Nestmaterial bereitzustellen und den Nistplatz konstant zu halten, um Stress für die Tiere zu minimieren.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Umwelt erwachsener Mäuse manipulieren kann, um Veränderungen im Gehirn und im Verhalten hervorzurufen. Vergessen Sie nicht, dass die verwendeten Arzneimittel äußerst gefährlich sein können. Tragen Sie daher beim Vorbereiten der osmotischen Pumpen stets Schutzkleidung.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Primäre dissoziiert Mittelhirn Dopamin Zellkulturen erlauben die Untersuchung der präsynaptischen Eigenschaften des Dopamin-Neuronen. Sie können verwendet werden, um Echtzeit-Freisetzung von Dopamin Kinetik und Protein / mRNA-Spiegel von Regulatoren der Dopamin-Exozytose zu überwachen. Hier zeigen wir Ihnen, wie Sie diese Kulturen von Nagetier Neugeborenen zu generieren.

Primäre Dissoziierte Mittelhirn Dopamin Zellkulturen aus Nager Neugeborene

Ein Protokoll zur Durchführung einseitige 6-OHDA Läsionen der mediale Vorderhirnbündel in Mäusen beschrieben. Dieses Verfahren hat eine niedrige Mortalitätsrate (13,3%) mit 89% der überlebenden Tiere mit&gt; 95% Verlust von striatalen Dopamin und 90,63 ± -4,02% ipsiversive Drehvorspannung nach der Seite der Läsion.

Entwicklung eines Einseitig-läsionierten 6-OHDA Mausmodell der Parkinson-Krankheit

Dopamin wird deutlich im Mittelhirn Kerne, die den Zellkörper und Dendriten der Dopamin-Neuronen enthalten geregelt. Hier beschreiben wir eine Dissektion und Probe-Handling-Ansatz, um Ergebnisse zu maximieren, und damit Schlussfolgerungen und Erkenntnisse, auf die Dopamin-Regulierung im Mittelhirn Kerne der Substantia nigra (SN) und ventralen Tegmentum (VTA) bei Nagern.

Umfassende Profilierung der Verordnung Dopamin in der Substantia nigra und ventralen Tegmentum

Bei der Parkinson-Erkrankung und Bewegungsstörungen in der Regel sind empfindlich und zuverlässig Verhaltensstörungen Assays die zum Testen neue potentielle Therapeutika. Hier beschreiben wir eine überschaubare Batterie sensomotorische Tests bei Mäusen, die empfindlich auf unterschiedlichem Grad der Schädigung des nigrostriatalen und nützlich für präklinische Studien sind.

Beurteilung der Sensomotorik in Maus-Modellen der Parkinson-Krankheit

Methoden zur Manipulation und Analyse von NF-kB-abhängige erwachsene Neurogenese beschrieben. Ein detailliertes Protokoll für eine Gyrus dentatus abhängige Verhaltenstest (als das räumliche Muster trenn Barnes Labyrinth) zur Untersuchung der kognitiven Ergebnis in Mäusen dargestellt. Diese Technik sollte auch dazu beitragen, dass Untersuchungen in anderen experimentellen Einstellungen.

Methoden zur Analyse und Modulation von NF-kappaB-abhängigen adulte Neurogenese

Lipoxygenase (LOX) Isozyme können Produkte erzeugen, die Neuroinflammation und Neurodegeneration erhöhen oder verringern können. Eine Gen-Umgebungs-Interaktionsstudie konnte LOX-isozymespezifische Effekte identifizieren. Die Verwendung des 1-Methyl-4-Phenyl-1,2,3,6-Tetrahydropyridin (MPTP)-Modells der Nigrostriatalschäden in zwei LOX-Isozymen-defizienten transgenen Linien ermöglicht einen Vergleich des Beitrags von LOX-Isozymen zur dopaminergen Integrität und Entzündung.

Gen-Umgebung Interaktionsmodelle zur Entlarvung von Störmechanismen bei Parkinson-Krankheit

Dopaminerge Neuronen spielen eine wichtige regulatorische Rolle im Gehirn. Ihr Verlust wird mit der Parkinson-Krankheit in Verbindung gebracht. In diesem Video zeigen wir, wie Primärkulturen von zentralen dopaminergen Neuronen aus embryonalem Mausmesencephalon erzeugt werden können. Solche Kulturen sind nützlich, um die extreme Anfälligkeit dieser Neuronen gegenüber verschiedenen Belastungen zu untersuchen.

Primärkultur von Maus dopaminergen Neuronen

Die Ursachen der Degeneration von dopaminergen Neuronen im Mittelhirn während der Parkinson-Krankheit sind nicht vollständig geklärt. Zellkultursysteme stellen ein wesentliches Werkzeug für die Untersuchung der neurophysiologischen Eigenschaften dieser Neuronen dar. Hier stellen wir ein optimiertes Protokoll vor, das für die in vitro Modellierung der Neurodegeneration verwendet werden kann.

Isolation, Kultur und langfristige Wartung von Primär mesencephalen dopaminergen Neuronen aus embryonalen Nagetier Brains

Synaptosomal Dopamin Aufnahme und Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie dar experimentelle Analysetools, Dopamin Homöostase bei Mäusen durch die Beurteilung der Funktion der Dopamin-Transporter und Dopamin-Spiegel in striatalen Gewebe zu untersuchen, bzw.. Hier präsentieren wir Protokolle zur Messung Dopamin Gewebe Inhalt und die Funktionalität der Dopamin-Transporter zu beurteilen.

Bewertung der dopaminergen Homöostase bei Mäusen durch Verwendung von High-Performance Liquid Chromatography Analyse und Synaptosomal Dopamin-Aufnahme

Dieses Werk stellt eine schrittweise Protokoll für die unparteiischen stereologischen Schätzung der dopaminergen neuronalen Zellzahlen in der Maus Substantia Nigra mit standard-Mikroskopie-Ausrüstung (z. B. einem Lichtmikroskop eine motorisierte Objekttabelle (X, y, z Flugzeug) und Public Domain-Software für die digitale Bildanalyse.

Stereologischen Schätzung der dopaminergen Neuron Nummer in der Maus Substantia Nigra mit dem optischen Plasmafraktionierer und Standard-Mikroskopie-Ausrüstung

Wir haben ein beschleunigtes Social Defeat Stress-Modell für jugendliche C57BL/6-Mäuse entwickelt, das sowohl bei Männchen als auch bei Weibchen funktioniert und eine Exposition während diskreter Jugendperioden ermöglicht. Die Exposition gegenüber diesem Modell führt zu sozialer Vermeidung, aber nur bei einer Untergruppe der besiegten männlichen und weiblichen Mäuse.

Soziales Defeat Stress-Modell für jugendliche C57BL/6 männliche und weibliche Mäuse

Erfahren Sie, wie Umweltmanipulationen die Anzahl der Mittelhirn-Dopamin-Neuronen bei erwachsenen Mäusen modulieren. Diese Methode untersucht geschlechtsspezifische Paarung und angereicherte Umgebungen.

Umwelt Modulationen der Anzahl der Mittelhirn Dopamin-Neuronen in erwachsenen Mäusen

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