Technischer Sicht in Modern Jahrringforschung - Wie Dendroökologische und Holz anatomische Herausforderungen zu meistern

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, gut repliziertes und hochaufgelöstes Holz zu erzeugen. Ein anatomischer Datensatz zur Untersuchung der Auswirkungen von Zeit und Umweltfaktoren auf das Wachstum von Bäumen und Sträuchern. Dies wird erreicht, indem eine nicht-newtonsche Flüssigkeit zur Stabilisierung der Pflanzenzellen während der Mikrotomschnitte verwendet wird, was in einem zweiten Schritt eine detaillierte mikroskopische Analyse der Proben ermöglicht.

Die Schliffbilder werden doppelt gefärbt, um die Unterscheidung zwischen verholzten und nicht verholzten Zellen zu erleichtern, und dann werden digitale Bilder der Proben aufgenommen. Letztendlich können automatisierte zellbasierte Analysen des Pflanzenwachstums und damit verbundene Zeitreihenanalysen durchgeführt werden, um die Bewertung der interessierenden holzanatomischen Parameter zu ermöglichen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie dem Senden der Probenbewertung besteht darin, dass bei unseren Techniken die Zellen nicht mit Sägemehl gefüllt werden, was zu viel klarer Qualität der Proben für die Bildanalyse führt.

Darüber hinaus ermöglicht die Zugabe einer Nicht-Newton-Flüssigkeit zu den Zellen während des Schnitts die Vermeidung der zeitaufwändigen Technik, die Probe in Paraffin einzubetten. Die neuen Mikrotome, die wir im Video sehen werden, wurden in unserem Labor unter Einbeziehung von Zentral Lu Netti von den Shang Dubs und Zürich entwickelt. Sie zeichnen sich durch eine hohe Stabilität der Führung aus, die das Schneiden von großen und dichten Proben ermöglicht.

Für die Kernprobenahme von Baumstämmen. Beginnen Sie damit, einen geschärften Inkrementkern senkrecht zur Wachstumsachse des Baumstamms zu platzieren. Drehen Sie dann den Kern ein und verwenden Sie einen Extraktor, um die resultierende Kernprobe aus dem Baum zu entfernen.

Beschriften Sie den Kern mit einer speziellen ID, die mit weichem Bleistift auf der Kernoberfläche markiert ist, und wiederholen Sie den Vorgang auf der gegenüberliegenden Seite des Stiels, wenn alle Proben entnommen wurden. Lagern Sie die beschrifteten Kerne in einem geeigneten Behälter, um sie vor Transportschäden zu schützen. Sobald Sie wieder im Labor sind, montieren Sie die Kernproben in Faserrichtung, aufrecht auf Holzstützbalken mit wasserfestem Holzleim, und lassen Sie sie für die Mikrokernprobenahme trocknen.

Entfernen Sie zunächst mit einem Meißel bei Bedarf einen Teil der Rinde. Platzieren Sie dann eine spezielle Stanzvorrichtung senkrecht zur Wachstumsachse auf dem gerade demonstrierten Stiel und dringen Sie mit einem Hammer etwa zwei Zentimeter tief in das Xylem des Stängels ein. Drehen Sie die Stanzvorrichtung, um den entstandenen Mikrokern im Inneren des Werkzeugs zu brechen.

Entfernen Sie dann den Kern vom Stiel und bewahren Sie ihn in einem beschrifteten Mikrozentrifugenröhrchen auf. Um eine glatte Oberfläche auf einer Kernprobe zu schneiden, fixieren Sie zunächst den interessierenden Inkrementkern im Kernhalter eines neu entwickelten Kernmikrotoms, um ebene Oberflächen auf Kernen über ihre gesamte Ausdehnung zu schneiden. Heben Sie dann den Kern an, bis er die Klinge, die auf einer kugelgelagerten Führung über die Ausdehnung des Kerns befestigt ist, leicht berührt, und ziehen Sie die Klinge, um den ersten Teil der Oberseite des Kerns zu schneiden.

Als nächstes schiebst du das Messer hinter den Kern. Heben Sie den Probenhalter etwa 10 Mikrometer an und wiederholen Sie den Schneidvorgang, bis er etwa ein Drittel des Kerns erreicht hat. Der Durchmesser wird reduziert, was zu einer durchgehenden ebenen Oberfläche führt.

Für eine detaillierte Bildanalyse der anatomischen Struktur der Proben müssen Schliffbilder mit einem anderen Mikrotomtyp angefertigt werden. Befestigen Sie zunächst die Kernprobe von Interesse im Mikrotomhalter des Mikrotoms. Positionieren Sie dann die Mikrotomklinge geführt von der Kugellagerführung und ziehen Sie die Klinge über den Kern.

Schieben Sie die Klinge zurück, um die Probe um 20 bis 30 Mikrometer anzuheben. Ziehen Sie dann die Klinge über die Probe. Wiederholen Sie diesen Vorgang erneut, bis eine durchgehende Oberfläche auf der Oberseite der Probe entsteht.

Bedecken Sie nun mit einem Pinsel die entstandene Oberfläche mit einer Maisstärkelösung. Heben Sie dann die Probe um 15 Mikrometer an und platzieren Sie den Pinsel auf der Oberfläche der Probe. Ziehen Sie die Klingen langsam in Richtung der Probe, beginnen Sie einen dünnen Schnitt unterhalb der Bürste und führen Sie den Abschnitt mit der Bürste auf der Oberfläche der Klinge, wenn der gesamte Abschnitt geschnitten wurde.

Verwenden Sie eine weitere Bürste und Wasser, um das Gewebe von der Klinge zu entfernen, und legen Sie es auf einen Glasobjektträger, um die Unterscheidung zwischen verholzten und nicht verholzten Strukturen zu ermöglichen. Waschen Sie das Glycerin mit einer Pipette mit Wasser ab. Als nächstes bedecken Sie den nassen Bereich mit ein paar Tropfen einer Mischung aus Safran in und Astroblau.

Waschen Sie die Farbstoffe nach fünf Minuten mit Wasser ab und trocknen Sie den Abschnitt sofort mit aufeinanderfolgenden Ethanolbehandlungen aus. Spülen Sie den Abschnitt nach der Behandlung mit dehydriertem Ethanol wiederholt mit 100%xol. Sobald das xol klar bleibt.

Bedecken Sie das Taschentuch mit einem Tropfen 100%iger Kanadabalsam und einem Deckglas, wobei darauf zu achten ist, dass keine Luftblasen entstehen. Legen Sie dann den entstandenen Objektträger zwischen zwei Streifen hitzebeständigen Kunststoff und legen Sie ihn auf eine Metallplatte. Legen Sie ein Gewicht auf die Folie, um den Abschnitt flach zu halten, und stellen Sie die Folie dann in einen Ofen mit 60 Grad Celsius.

Lassen Sie die Folie nach 12 Stunden auf Raumtemperatur abkühlen und entfernen Sie dann das Gewicht und den Plastikstreifen. Reinigen Sie schließlich den Objektträger mit Rasierklingen, um überschüssigen Balsam zu entfernen, indem Sie die vorgestellten Schnitt- und Färbeverfahren befolgen, bevor Sie alle Arten von Proben unterschiedlicher Größe und Form vorbereiten können, natürlich auch durch die Verwendung spezieller Halter, um digitale Bilder der Kernoberflächen für die Gefäßanalyse zu erstellen. Schneiden Sie zuerst die Kernoberflächenebene mit dem Kernmikrotom wie gerade gezeigt und färben Sie die resultierende Oberfläche mit einem Filzmarker schwarz.

Sobald der Farbstoff getrocknet ist, reiben Sie die Kernoberfläche mit weißer Kreide ab und drücken Sie die Kreide anschließend mit einem Finger in die Zellen. Entfernen Sie überschüssige Kreide und legen Sie den Kern auf den Tisch eines binokularen Mikroskops, das mit einer Digitalkamera ausgestattet ist, beginnend auf einer Seite des Kerns. Nehmen Sie nun eine Sequenz von leicht überlappenden Bildern auf, bis die gesamte Oberfläche erfasst ist.

Fügen Sie dann die Einzelbilder zusammen, um ein vollständiges Bild der Kernoberfläche zu erstellen, um digitale Bilder aus den Mikrodias zu erstellen. Legen Sie den Objektträger auf den Mikroskoptisch und wählen Sie die passende Vergrößerung für die zu analysierenden Strukturen. Nehmen Sie schließlich überlappende Bilder der Schnitte auf, die auf den gereinigten Mikroobjektträgern montiert sind, wie gerade für die Kernoberflächenprobe gezeigt, und fügen Sie die Bilder zusammen, um ein vollständiges Bild des Schnitts zu erstellen.

Die Fähigkeit, offene Zellen zu haben, ist ein erster wichtiger Schritt zur Adaption anatomischer dendroökologischer Strukturen in eine Zeitreihenanalyse. Für eine genauere Analyse von Früh- oder Spätholztrachen in Nadelbäumen werden hier qualitativ hochwertige Schliffschliffe benötigt. Mögliche Artefakte wie gebrochene Zellwände müssen vermieden werden.

Das Auftragen einer nicht-newtonschen Flüssigkeit auf die Probe, wie die gerade gezeigte Maisstärkelösung, unterstützt die Stabilität der Zellstruktur. Mikroschnitte ermöglichen eine sicherere Bestimmung der Jahresränge. Dies gilt insbesondere für Nadelbäume, die an ihren natürlichen Grenzen wachsen.

Wie hier zu sehen ist, sind extrem schmale Ringe häufig, aber makroskopisch schwer zu erkennen. Im Extremfall bestehen die Ringe aus einer oder zwei Zellreihen, die unter Umständen nur bei der Verwendung von Schliffen sichtbar sind. Bei der Analyse von Bildern mit hohen Vergrößerungen sind einzelne Zellen sichtbar.

Mit der halbautomatischen Analysesoftware können die Änderungen einzelner Parameter, wie z. B. der Zellwanddicke, für alle im Bild sichtbaren Ringe bestimmt werden, was auf die Notwendigkeit einer erweiterten Zeitreihenanalyse hinweist. Die doppelte Färbung der Schliffbilder ermöglicht die Visualisierung der verschiedenen Stadien der Verholzung. Diese Informationen können dann mit den Umweltdaten der jeweiligen Vegetationsperiode in Beziehung gesetzt werden, um einen detaillierteren Klima-Wachstums-Zusammenhang nach ihrer Entwicklung zu bestimmen.

Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der DRO-Ökologie den Weg, um die verschiedenen anatomischen Parameter von Bäumen und Sträuchern zu erforschen. Die Verwendung dieser Methode reduziert den Zeitaufwand für die Herstellung großer, qualitativ hochwertiger Profile drastisch. Vorsichtsmaßnahmen, wie z. B. das Arbeiten unter einem Abzug und das Tragen von Handschuhen, sollten bei der Durchführung dieses Verfahrens immer getroffen werden.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie gut replizierte und hochaufgelöste Datensätze generieren können, um anatomische Datensätze zur Unterstützung der Zeitreihenanalyse zu verwenden.