Ein In-vitro- Enzymatic Assay zur Transcription Hemmung durch Gallium (III) und H messen 3 5,10,15-tris (pentafluorphenyl) Corrole

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, festzustellen, ob potenzielle Anti-Krebs-Verbindungen die Rippen-Nukleinsäure oder die RNA-Transkription hemmen. Dies wird erreicht, indem zunächst RNA-Transkriptionsreaktionen vorbereitet werden, einschließlich potenzieller Inhibitoren. In diesem Experiment werden CHO-Verbindungen, die unterschiedliche zytotoxische Eigenschaften aufweisen, zur Hemmung der RNA-Transkription untersucht und mit bekannten Inhibitoren verglichen. Nach gründlichem Mischen der Reaktionen werden die Reaktionsröhrchen bei 37 Grad Celsius inkubiert und die Aliquote zu den gewünschten Zeitpunkten entnommen.

Als nächstes wird die Gelelektrophorese verwendet, um die relative Hemmung zu beurteilen, da ein Iridiumbromid bei der Bindung von RNA fluoresziert, dunklere Banden im Gel entsprechen höheren RNA-Konzentrationen. Um das Ausmaß der Transkriptionshemmung zu quantifizieren, wird Ultraviolett-, sichtbare oder UV-vs-Spektroskopie durchgeführt. Letztendlich zeigt dieses Video eine einfache Methode zur Bewertung der Eigenschaften von Krebskandidaten.

Durch die Bewertung der Transkriptionshemmung durch Korallen sollten potenzielle Krebsmedikamente auf ihre Fähigkeit zur Hemmung von RNA untersucht werden. Transkription. Menschliche Krebszellen werden häufig von einem einzigen aktivierten Onkogen abhängig, um Überlebensbehandlungen durchzuführen. Die Blockierung der Expression der Onkogene ist wirksam bei der Eliminierung von Krebszellen.

Das hier beschriebene Verfahren zur Hemmung der RNA-Transkription ist ein nützlicher Weg, um potenzielle Kandidaten für Krebsmedikamente zu identifizieren und mehr über ihren Wirkmechanismus zu erfahren. Zu Beginn bereiten Sie das Carole und die Inhibitorverbindungen in einem Verhältnis von 0,01 zu einem molaren Verhältnis von Komplex zu DNA vor. Zu diesem Zweck werden cin d Tripolis, TPFC und Gallium-TPFC und Dimethylsulfoxid in sauberen, getrennten Behältern gelöst.

Die Endkonzentration wird durch Getreideverdünnung mit nukleasefreiem Wasser vor Beginn der Transkriptionsreaktion ermittelt. Bereiten Sie die notwendigen Reagenzien einzeln vor oder kaufen Sie sie bei einem kommerziellen Anbieter. Tauen Sie alle gefrorenen Reagenzien auf Eis auf.

Kombinieren Sie dann die Reagenzien für die Transkriptionsreaktion bei Raumtemperatur, wie im Textprotokoll beschrieben. Mischen Sie gründlich, indem Sie das Röhrchen schnippen oder die Mischung vorsichtig auf und ab pipettieren, bevor Sie die Reaktionsmischung bei 37 Grad Celsius inkubieren. Entfernen Sie anschließend nach jeder Stunde vier Mikroliter-Aliquots aus jeder Reaktion und lagern Sie sie bei minus 20 Grad Celsius, wobei Sie sie je nach Bedarf für die gewünschten Zeitpunkte nach der Transkriptionsreaktion modifizieren.

Reinigen Sie die RNA von den anderen Reaktionskomponenten unter Verwendung der RNA-Spin-Säulen, wie im Textprotokoll beschrieben, um eine Agros-Gel-Elektrophorese durchzuführen, bereiten Sie Trisacetat-, EDTA- oder TAE-Laufpuffer und eine 1000-fache Stammlösung von Etheriumbromid her. Und wie im Textprotokoll beschrieben, tragen Sie bei der Arbeit mit Etheriumbromid immer geeignete Schutzausrüstung, da es giftig ist. Bereiten Sie als Nächstes ein 1%aros-Gel vor, indem Sie 10 Gramm hochreines Agros in einem Liter eines XTAE-Puffers auflösen und das Agros mit einem herkömmlichen Mikrowellenherd schmelzen.

Sobald es auf 50 Grad Celsius abgekühlt ist, fügen Sie einen Milliliter 1000 x Iridiumbromid zur 1%igen Agros-Gellösung hinzu und mischen Sie durch leichtes Schwenken oder durch Invertieren in einem geschlossenen Behälter. Gießen Sie dann die Agrolösung in eine Gelgießplattform und lassen Sie das Gel bei Raumtemperatur erstarren, nachdem das Gel erstarrt ist. Entfernen Sie die Keile aus dem Elektrophoresetank und fügen Sie genügend TAE-Puffer hinzu, um das Gel zu bedecken, bis die Vertiefungen untergetaucht sind.

Vergewissern Sie sich, dass der Füllstand des TAE-Puffers etwa einen Millimeter über dem Niveau des Gels liegt, bevor Sie den Gelkamm entfernen. Um die RNA-Proben für die Gelelektrophorese vorzubereiten, kombinieren Sie einen Mikroliter jeder gereinigten Probe aliquot mit einem Mikroliter Gelladepuffer, der gründlich gemischt wird, indem Sie mit einer Mikropipette auf und ab pipettieren. Laden Sie das Gel mit jeder Probe, indem Sie die Lösung vorsichtig in den Boden jeder Probe pipettieren. Achten Sie darauf, keine Luftblasen zu hinterlassen oder Proben zwischen den Vertiefungen zu vermischen.

Befestigen Sie die Elektroden so, dass die DNA in das Gel in Richtung der positiven Elektrode wandert. Stellen Sie die Spannung auf den gewünschten Pegel ein. Typischerweise ein bis 10 Volt pro Zentimeter Gel.

Ein 23 Zentimeter mal 25 Zentimeter großes Gel bei 250 Volt läuft etwa eine Stunde lang. Ein acht mal acht Zentimeter großes Gel bei 150 Volt läuft etwa 20 Minuten lang. Kleinere RNA-Fragmente laufen mit besserer Auflösung bei höheren Spannungen.

Lassen Sie das Gel so lange laufen, wie es für eine signifikante Trennung zwischen potenziellen RNA-Fragmenten ausreicht, wobei die Migration von Farbstoffen verwendet wird, um den Fortschritt der Trennung zu überwachen. Schalten Sie die Stromversorgung aus, bevor der Farbstoff aus dem Ladepuffer an das Ende des Gelbildes gewandert ist. Die RNA, die unter ultraviolettem Licht wie dem Aheriumbromid steht, fluoresziert, macht ein Bild des Bildes und vergleicht die Fluoreszenzintensitäten der gereinigten RNA unter jeder Bedingung.

Um die RNA-Quantifizierung mittels UV-V-Spektroskopie durchzuführen, geben Sie zwei Mikroliter Wasser auf ein NanoDrop 2000 oder eine ähnliche Maschine und messen Sie den Rohling. Als nächstes werden zwei Mikroliter jeder RNA-Probe nach der Aufreinigung auf das Spektralphotometer gelegt und das ultraviolette sichtbare Licht in einem Wellenlängenbereich von 200 Nanometern bis 800 Nanometern gemessen, falls die Absorption über einer optischen Dichte von eins liegt. Verdünnen Sie die Proben in nukleasefreiem Wasser, um eine optische Dichte von weniger als eins zu erhalten.

Verwenden Sie schließlich eine Grafiksoftware, um die verschiedenen Proben darzustellen und die optische Dichte bei 260 Nanometern zu vergleichen. Die transkribierte RNA wird mit Hilfe der Gelelektrophorese abgebildet. Wenn der Komplex die RNA-Transkription hemmt, wird die Produktion von RNA reduziert und Theban erscheint leichter. Aktin d und Tryptoline zeigen eine deutliche Abnahme der RNA im Vergleich zur Kontrolle, wie sie von diesen seit langem untersuchten Inhibitoren erwartet wird.

Die Gallium-TPFC-Bande hat auch einen sehr niedrigen RNA-Gehalt, während die TPFC-Bande wenig bis gar keine Hemmung zeigt und die gleiche relative Intensität aufweist wie die Kontroll-UV-vs. Messungen wurden für jede Probe durchgeführt. Nach einer vierstündigen RNA-Transkription und einer Aufreinigung mit RNA-Spin-Säulenchromatographie werden hier die Spektren von Wellenlängen von 220 Nanometern bis 350 Nanometern gezeigt.

Drei der vier mit Inhibitoren behandelten Transkriptionsreaktionen ergaben weniger RNA als die Kontroll, wobei Gallium-TPFC-behandelte DNA, die nur ein 14stel so viel RNA transkribierte wie die unbehandelte D-N-A-T-P-F-C-behandelte DNA, keine offensichtliche Hemmung zeigte. Daher ist die Zytotoxizität in Zelllinien, die mit TPFC behandelt wurden, nicht auf eine Hemmung der RNA-Transkription zurückzuführen. Alle Proben haben eine Extinktion von 260 über 280 Nanometern von etwa 2,2, was auf relativ reine Proben hinweist.

Nach diesem Verfahren können andere Variablen in der Reaktion wie Konzentration und Reihenfolge der Zugabe getestet werden, um zusätzliche Fragen wie den Wirkmechanismus zu beantworten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie feststellen können, ob Ihr Anti-Krebs-Wirkstoff die RNA-Transkription hemmt. Vergessen Sie nicht, dass das Bromid äußerst gefährlich für Ihre Gesundheit sein kann.

Tragen Sie immer geeignete persönliche Schutzausrüstung und verwenden Sie niemals Mikrowellenlösungen oder Agros, die Athenbromid enthalten.