Optogenetische Functional MRI

Das übergeordnete Ziel dieses bildgebenden Verfahrens ist es, die F-MRT mit der optogenetischen Stimulation zu kombinieren, um zelltypspezifische Kartierung funktioneller neuronaler Schaltkreise und ihrer Dynamik im gesamten lebenden Gehirn zu ermöglichen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Neurowissenschaften zu beantworten, wie z. B. die Bestimmung der Rolle bestimmter Schaltkreiselemente des Gehirns bei der Steuerung der globalen Gehirnaktivität. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine zelltypspezifische Stimulation und eine relativ hohe räumliche Auflösung des Auslesens der globalen Gehirnaktivität ermöglicht.

Dieses Verfahren wird von Jia Liu und Zhongnan Fang, Doktoranden in meinem Labor, demonstriert. Nachdem Sie das Tier wie im Textprotokoll beschrieben betäubt haben, rasieren Sie den Kopf mit einem Elektrorasierer und führen Sie ein dreifaches chirurgisches Peeling auf der Haut mit Betadin und einer 70%igen Ethanolspülung durch. Als nächstes wird der Schädel des Tieres in einem stereotaktischen Apparat immobilisiert.

Verwenden Sie ein Skalpell, um einen 15 bis 20 Millimeter großen Schnitt in der Mittellinie der Kopfhaut zu machen. Ziehen Sie die Kopfhaut mit chirurgischen Hämostatika zurück, die am Periost befestigt sind. Identifizieren Sie die Lambda- und Bregma-Positionen auf dem Schädel und positionieren Sie den Bohrer dann über dem Bereich of Interest (ROI).

Bohren Sie mit einem Zahnbohrer eine kleine Kraniotomie über den ROI und achten Sie darauf, das Gehirn nicht zu punktieren. Führen Sie eine an der Mikroliterspritze befestigte Nadel langsam durch den Kraniotomie in den ROI im Gehirn ein. Verwenden Sie dann eine Mikrospritzenpumpensteuerung, um zwei Mikroliter der Vektorlösung in den ROI zu injizieren.

Warten Sie nach Abschluss der Injektion 10 Minuten und entfernen Sie die Spritze dann langsam mit einer Geschwindigkeit von 0,5 Millimetern pro Minute. Trocknen Sie nach der Injektion die Oberfläche des Schädels. Bestätigen Sie die Koordinaten für den ROI und setzen Sie das Ferrule-Implantat mit einer Geschwindigkeit von 0,5 Millimetern pro Minute in die Zieltiefe ein.

Zum Schluss befestigen Sie das Ferrule-Implantat mit Zahnzement am Schädel. Nachdem sich der Zahnzement verfestigt hat, versiegeln Sie den Schnitt mit Nähten um die Zahnzementkappe. Beginnen Sie damit, das Glasfaser-Patchkabel an eine Laserlichtquelle anzuschließen, und messen Sie die Leistung an der Spitze des Steckers des Patchkabels mit einem Leistungsmesser.

Stellen Sie die entsprechende Leistungsstufe ein, um die gewünschte Leistung an der Spitze des Glasfaserkabels zu erzeugen, das im Gehirn implantiert ist. Verhindern Sie das Austreten von Licht aus dem Implantat, indem Sie die Augen des Tieres abdecken. Legen Sie dann die Spule über den Kopf des Tieres.

Verwenden Sie eine Aderendhülse, um das Glasfaserkabel an das Ferrule-Implantat zu halten. Setzen Sie die Halterung mit dem Tier in die Bohrung des Scanners ein. Überwachen Sie die Atemfrequenz und den CO2-Gehalt der Atemzeiten sowie die Körpertemperatur während des gesamten Experiments, indem Sie das künstliche Beatmungsgerät so einstellen, dass die physiologischen Werte innerhalb der richtigen Grenzen bleiben.

Verbinden Sie BNC-Kabel vom Triggeranschluss des MRT-Scanners mit dem Funktionsgenerator. Wählen Sie eine Positioniersequenz aus und klicken Sie im Bedienungsfenster auf "Scannen". Klicken Sie auf "Weiter", um die Position des Kopfes des Tieres abzubilden.

Wenn sich das Gehirn nicht im Isozentrum befindet, passen Sie die Position des Tierkopfes an und wiederholen Sie den Positionierungsscan, bis sich das Gehirn im Isozentrum befindet. Erfassen Sie ein hochauflösendes anatomisches Bild, um die Gesamtintegrität des Gehirns zu überprüfen und die Position des Glasfaserimplantats zu bestätigen. Wählen Sie dann eine T2-gewichtete Sequenz aus.

Passen Sie die Anzahl der Schichten an und klicken Sie dann auf Scannen, um die T2-gewichteten hochauflösenden koronalen anatomischen Bilder zu erhalten. Wählen Sie abschließend einen mehrschichtigen Gradienten aus, der als Echosequenz abgerufen wird, und klicken Sie dann auf Weiter, um das Funktionsbild zu erfassen. Dieses Protokoll verwendet optogenetische F-MRT, um den motorischen Kortex in einem Tiermodell zu stimulieren.

Diese Aktivierungskarte zeigt aktivierte Voxel im motorischen Kortex und im Thalamus, was auf weitreichende synaptische Verbindungen zwischen diesen Regionen hinweist. Hier zeigt sich das fette Signal für aktive Voxel im motorischen Kortex und Thalamus während der optogenetischen Stimulation des motorischen Kortex. Die hämodynamische Reaktionsfunktion des Thalamus zeigt eine verzögerte Reaktion im Vergleich zur Reaktion im motorischen Kortex nach der Stimulation.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Implantationsoperationen und optogenetische funktionelle Magnetresonanztomographie durchführt. Einmal gemeistert, kann dieses bildgebende Verfahren in zwei Stunden abgeschlossen werden. Bei diesem Verfahren ist es sehr wichtig, das Tier zu überwachen und seine Physiologie innerhalb der normalen Grenzen zu halten.

Im Anschluss an dieses Verfahren können komplementäre Methoden verwendet werden, wie z. B. die Elektrophysiologie, um die zeitliche Dynamik der Neuroaktivität zu untersuchen, oder die Immunhistochemie, um die Expression und Spezifität des Opsins zu validieren. Die Entwicklung dieser Technik ebnete den Weg für Neurowissenschaftler, die funktionelle Konnektivität in einem intakten, lebenden Gehirn zu untersuchen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit einem MRT-Scanner äußerst gefährlich sein kann.

Vorsichtsmaßnahmen, wie z. B. das Halten von magnetischen Geräten in ausreichendem Abstand zum Scanner, sollten immer getroffen werden, während Sie dieses Verfahren befolgen.