Optogenetische Functional MRI

Das übergeordnete Ziel dieses bildgebenden Verfahrens besteht darin, die fMRT mit optogenetischer Stimulation zu kombinieren, um funktionelle neuronale Schaltkreise und deren Dynamik im gesamten lebenden Gehirn zelltypspezifisch abzubilden. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Neurowissenschaften zu beantworten, beispielsweise welche Rolle spezifische Elemente neuronaler Schaltkreise bei der Steuerung der gesamten Gehirnaktivität spielen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie eine zelltypspezifische Stimulation sowie eine vergleichsweise hohe räumliche Auflösung bei der Erfassung der globalen Gehirnaktivität ermöglicht.

Den Ablauf dieses Verfahrens werden Jia Liu und Zhongnan Fang, Doktoranden in meinem Labor, demonstrieren. Nach der Anästhesie des Tieres gemäß der schriftlichen Anleitung rasieren Sie den Kopf mit einem elektrischen Rasierer und führen eine dreifache chirurgische Desinfektion der Haut mit Betadine und einer 70 %igen Ethanol-Spülung durch. Anschließend fixieren Sie den Schädel des Tieres in einer stereotaktischen Vorrichtung.

Verwenden Sie ein Skalpell, um einen 15 bis 20 Millimeter langen medianen Hautschnitt am Kopf durchzuführen. Ziehen Sie die Kopfhaut mit chirurgischen Hämostaten, die am Periost befestigt sind, zurück. Identifizieren Sie die Positionen von Lambda und Bregma am Schädel und positionieren Sie dann den Bohrer über der Region von Interesse (ROI).

Bohren Sie mit einem Zahnarztbohrer eine kleine Kraniotomie über dem Zielareal (ROI), wobei darauf zu achten ist, das Gehirn nicht zu verletzen. Führen Sie langsam eine an eine Mikroliterspritze angeschlossene Nadel durch die Kraniotomie in das Zielareal (ROI) des Gehirns ein. Injizieren Sie anschließend mithilfe eines Mikrospritzpumpenreglers zwei Mikroliter der Vektorlösung in das Zielareal (ROI).

Nach Abschluss der Injektion 10 Minuten warten und dann die Spritze mit einer Geschwindigkeit von 0,5 Millimetern pro Minute langsam entfernen. Nach der Injektion die Oberfläche des Schädels trocknen. Die Koordinaten für die Zielregion bestätigen und das Ferrul-Implantat mit einer Geschwindigkeit von 0,5 Millimetern pro Minute auf die gewünschte Tiefe einführen.

Schließlich befestigen Sie die Ferrulimplantat mit Zahnzement am Schädel. Nachdem der Zahnzement erstarrt ist, verschließen Sie den Einschnitt mit Nähten um die Zahnzementabdeckung herum. Beginnen Sie damit, das faseroptische Patchkabel an eine Laserlichtquelle anzuschließen, und messen Sie die Ausgangsleistung an der Spitze des Barrels des Patchkabels mit einem Leistungsmesser.

Stellen Sie die geeignete Leistungsstufe ein, um die gewünschte Ausgabe an der Spitze des im Gehirn implantierten Lichtwellenleiters zu erzeugen. Verhindern Sie Lichtaustritt aus dem Implantat, indem Sie die Augen des Tieres abdecken. Anschließend platzieren Sie die Spule über dem Kopf des Tieres.

Verwenden Sie eine Ferrulenhülse, um das Glasfaserkabel an der Ferrulenimplantat zu befestigen. Setzen Sie die Halterung mit dem Tier in die Bohrung des Scanners ein. Überwachen Sie während des gesamten Experiments die Atemfrequenz, den Atemzug-CO2-Wert und die Körpertemperatur, indem Sie den künstlichen Beatmungsapparat so einstellen, dass die physiologischen Werte innerhalb der angemessenen Grenzen bleiben.

Schließen Sie BNC-Kabel vom Auslöseport des MRT-Scanners an den Funktionsgenerator an. Wählen Sie eine Positionierungssequenz aus und klicken Sie im Bedienfenster auf „scan“. Klicken Sie auf „continue“, um die Kopfposition des Tieres abzubilden.

Falls das Gehirn nicht im Isocenter liegt, passen Sie die Position des Tierkopfs an und wiederholen Sie die Positionsbestimmung, bis sich das Gehirn im Isocenter befindet. Erstellen Sie ein hochauflösendes anatomisches Bild, um die allgemeine Integrität des Gehirns zu überprüfen und die Lage des optischen Faserimplantats zu bestätigen. Wählen Sie anschließend eine T2-gewichtete Sequenz aus.

Passt die Anzahl der Schichten an und klickt dann auf „scannen“, um die T2-gewichteten hochauflösenden koronaren anatomischen Bilder aufzuzeichnen. Wählt abschließend eine Multischicht-Gradienten-Echo-Sequenz aus und klickt dann auf „weiter“, um das funktionelle Bild aufzuzeichnen. Dieses Protokoll verwendet die optogenetische fMRT, um den motorischen Kortex in einem Tiermodell zu stimulieren.

Diese Aktivierungskarte zeigt aktivierte Voxel im motorischen Kortex und im Thalamus, was auf weitreichende synaptische Verbindungen zwischen diesen Regionen hinweist. Hier wird das signifikante Signal für aktive Voxel im motorischen Kortex und im Thalamus während der optogenetischen Stimulation des motorischen Kortex dargestellt. Die thalamische hämodynamische Antwortfunktion zeigt eine verzögerte Reaktion im Vergleich zur Antwort im motorischen Kortex nach der Stimulation.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Implantationschirurgien und optogenetische funktionelle Magnetresonanztomographien durchführt. Sobald die Methode beherrscht ist, kann dieses bildgebende Verfahren innerhalb von zwei Stunden abgeschlossen werden. Während des Durchführens dieses Verfahrens ist es sehr wichtig, das Tier zu überwachen und seine Physiologie innerhalb der normalen Grenzen zu halten.

Nach dieser Vorgehensweise können ergänzende Methoden eingesetzt werden, beispielsweise Elektrophysiologie, um die zeitliche Dynamik der neuronale Aktivität zu untersuchen, oder Immunhistochemie, um die Expression und Spezifität des Opsins zu überprüfen. Die Entwicklung dieser Technik ebnete Neurologen den Weg, funktionelle Konnektivität in einem intakten, lebenden Gehirn zu erforschen. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit einem MRT-Gerät äußerst gefährlich sein kann.

Es sollten stets Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden, wie zum Beispiel das Halten magnetischer Geräte ausreichend weit entfernt vom Scanner, während dieses Verfahren durchgeführt wird.