Laser-Scanning-Photostimulation von optogenetisch ausgerichteten Vorderhirn-Schaltkreisen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, moderne optogenetische Techniken anzuwenden, um gezielt neuronale Bahnen in in-vitro-Schnittpräparaten photo-stimulieren zu können. Dies wird erreicht, indem zunächst Channelrhodopsin in den betreffenden neuronalen Zelllinien exprimiert wird. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, akute Schnittpräparationen der zu untersuchenden Gehirnstrukturen herzustellen.

Der nächste Schritt besteht darin, die Antworten von Neuronen in der Schnittpräparation auf die photochemische Stimulation der Kanal- und Stäbchen-Dossin-exprimierenden Fasern aufzuzeichnen. Der letzte Schritt ist die Abbildung der Verteilung der Kanal-Opsin-exprimierenden Neuronen und Fasern. Letztendlich ermöglicht dieser Ansatz die Beurteilung der funktionellen Topographie und synaptischen Eigenschaften neuronaler Schaltkreise mittels laserbasiertem photostimulativen Ansatz an optogenetisch gezielten neuronalen Komponenten.

Die Hauptvorteile dieser Technik im Vergleich zu herkömmlichen elektrischen Stimulationsmethoden liegen in der Möglichkeit, gezielt bestimmte neuronale Zelltypen anzusteuern und zu stimulieren sowie deren langreichweitige Projektionen in vitro zu untersuchen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Systemneurowissenschaft zu beantworten, beispielsweise zur funktionalen Organisation komplexer Warzensocken. Bereiten Sie eine Spritze und eine Nadel vor, um die virale Lösung zu injizieren, die vier Mikrogramm pro Milliliter Poly enthält, um die Transfektion zu verbessern.

Drücken Sie anschließend 200 Nanoliter der Lösung mittels einer Spritzenpumpe injizieren; zwei bis drei Wochen später wird ein ausreichender Ausdruck von Channelrod Dossin im Schnitt vorliegen. Die Vorbereitung sollte so schnell wie möglich durchgeführt werden. Nach dem Entfernen des injizierten Gehirns, blocken Sie das Gehirn in der gewünschten Orientierung mit einer sauberen Rasierklinge. Befestigen Sie anschließend die blockierte Gehirnfläche mit Sekundenkleber auf der Schneidebühne.

Überführen Sie dann das Präparat in eine auf Kälte eingestellte Vibram-Schneidkammer und geben Sie eiskalte A-CSF in die Schneidkammer. Schneiden Sie die Gehirnschnitte mit einem Viome in vier bis 500 Mikrometer dicke Abschnitte. Überführen Sie die Gehirnschnitte in eine mit Sauerstoff versorgte Haltekammer und lassen Sie sie mindestens eine Stunde bei 30 Grad Celsius inkubieren, bevor Sie mit dem Experiment fortfahren.

Wenn Sie bereit sind, das Experiment zu beginnen, überführen Sie den Gehirnschnitt auf die Stufe der elektrophysiologischen Ableitapparatur. Nehmen Sie ein Neuron mit standardmäßigen Ganzzell-Patch-Clamp-Techniken auf. Positionieren Sie die Aufnahmepipette kurz neben dem Neuron, während Sie einen positiven Druck auf die Pipette ausüben.

Nach Herstellung des Kontakts mit der Zelle den Druck abbauen und Saugung anwenden, um die Gigaseal-Formation zu erzielen. Anschließend kurz Saugung anwenden, um die Membran zu rupturieren und die Ganzzell-Konfiguration zu erreichen, und Aufnahmen im Spannungs- oder Strom-Klemm-Modus durchführen. Den Laserscanner entweder mit der Tidal-Wave- oder der EFAs-Datenerfassungssoftware betreiben.

Die Software muss vor der Verwendung zur Leistungssteuerung des Lasers auf die Fotodiode kalibriert werden. Ein variables Neutraldichter-Rad wird in den Strahlengang eingebracht. Durch Drehen des Rades wird die Laserleistung durch Messung in der hinteren Brennebene angepasst.

Die Leistung wird typischerweise zwischen 25 und D Milliwatt eingestellt. Der Pulsparameter des Verschlusses steuert Dauer und Timing der Stimulation in der Software. Ein Bild der zu stimulierenden Region kann mithilfe der Videoaufnahmefunktion erstellt werden.

Als Nächstes legen Sie das Stimulationsraster, beispielsweise ein 16 mal 16 Raster mit einem Abstand von 80 Mikron, fest. Anschließend überlagern Sie das Raster mit dem aufgenommenen Bild und passen die XY-Koordinaten sowie den Versatzgrad an, um die Ausrichtung für den Beginn der Stimulation zu optimieren. Aktivieren Sie die Kartenfunktion.

Die Daten werden gespeichert und können mit dem Offline-Analyseprogramm in Tidal Wave ausgewertet werden oder mit dem Map-Analyseprogramm in der EFAs-Software. Nach Abschluss der physiologischen Ableitungen am Schnitt kann das Expressionsmuster des mit YFP markierten Kanalopsins dokumentiert werden. Zunächst fixieren Sie den Schnitt über Nacht in 4 % PFA in 0,01 molarer PBS bei vier Grad Celsius.

Am nächsten Tag die Schnittprobe in eine 30 %igen Saccharose-4 %igen PFA-Lösung zur kryoschonenden Übernachtung überführen. Am folgenden Tag 50 µm dicke Schnitte der Probe am Kryostaten anfertigen. Die Schnitte mit PBS spülen und mit einem Antifade-Medium für die Bildgebung am konfokalen Mikroskop aufdecken.

Nachdem der interessierende Bereich im weißen Licht gefunden wurde, verwenden Sie eine anregende Wellenlänge von 514 Nanometern und eine Emissionswellenlänge von 527 Nanometern. Um den YFPA-Viruskonstrukt abzubilden, der die Expression des Kanalstabs Dobson, EYFP, in anregenden glutamatergen Neuronen antreibt, wurde dieser in den primären visuellen Kortex einer BSY-Maus injiziert.

Es wurde virale Expression in Bahnen zwischen der primären und sekundären Sehrinde sowie in den kortikothalamenten Fasern des LGN gefunden. Ganzzell-Patch-Clamp-Aufnahmen von einem mit dem Stern markierten Neuron in der sekundären Sehrinde zeigten ePSCs. Nach lassergestützter photostimulation der Kanäle wurden Rod-Dossin-exprimierende Fasern in den unteren Schichten von V2 beobachtet, die kortikothalamente Projektionen aus Schicht sechs der primären somatosensorischen Rinde darstellen. Der ventrale posteriore Kern wurde mithilfe eines CRE-Lox-Ansatzes untersucht, um Channel-Rod-Dossin in kortikothalamenten Neuronen der Schicht sechs und in deren Projektionen zu exprimieren. Wie erwartet führte die Transfektion eines floxeden AAV-Konstrukts in eine CRE-transgene Maus zur Expression von Channel-Rod-Dossin in den gezielten Neuronen der Schicht sechs und deren Fasern, die sich bis in Schicht vier erstrecken.

Bei Kanalstabs-Dobson wurde ebenfalls EYFP-Expression in Fasern beobachtet, die zu VP projizieren, sowie physiologische Ableitungen von einem VP-Neuron. Ganzzell-Patch-Clamp-Aufnahmen zeigten, dass ePSCs nach photostimulatorischer Reizung in der Nähe des aufgezeichneten Neurons ausgelöst werden konnten, das durch den Stern markiert ist. Die Offline-Analyse zeigt die mittlere Antwortamplitude auf photostimulatorische Reizung im VP. In resezierten 50-Mikrometer-Schnitten von kortiko-thalamischen Neuronen der Schicht sechs, die Kanalstabs-Dobson-EYFP exprimieren, zeigte sich ein feines Muster markierter Fasern, die von Schicht sechs zu Schicht vier verlaufen, dort enden und sich ausgiebig verzweigen.

Außerdem wurden kortiko-thalamische Fasern beobachtet, die in die weiße Substanz eindringen und zum Thalamus verlaufen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie moderne optogenetische Techniken angewendet werden, um gezielt neuronale Bahnen in in-vitro-Schnittpräparaten photo-stimulieren zu können. Vergessen Sie nicht, dass das Arbeiten mit Lasern äußerst gefährlich sein kann, wenn Sie Kalibrierungsschritte durchführen, die mit diesem Verfahren verbunden sind.

Tragen Sie Schutzbrille.