Name: Laser-Scanning-Photostimulation von optogenetisch ausgerichteten Vorderhirn-Schaltkreisen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-27T13:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: Erfahren Sie die Laser-Scanning-Photostimulation optogenetisch ausgerichteter Vorderhirn-Schaltkreise. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung funktioneller Topographie und synaptischer Eigenschaften neuronaler Netzwerke in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Diese Arbeit wurde unterstützt durch NIH/NIDCD grant R03 DC 011361, SVM CORP grant LAV3202, NSF-LA EPSCoR grant PFUND86 und ein publication grant von Leica Microsystems (CCL) und NIH/NIDCD grant R01 DC 008794 (SMS).

1. Chirurgie und Injektionen
<ol>
	<li>Anästhesieren Sie Mäuse mit einer intraperitonealen Injektion (22-25 g Nadel empfohlen) von Ketamin (100-120 mg/kg) und Xylazin (7,5-16 mg/kg).
	<ol>
		<li>Beurteilen Sie die Sedierung mit starken Zehenkneifungen, bis keine Reaktionen hervorgerufen werden. Für alle beschriebenen Tierverfahren ist bei Bedarf eine Änderung vorzunehmen, um den lokalen IACUC-Richtlinien zu entsprechen.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Setzen Sie sedierte Mäuse in ein stereotaktisches Gerät ein, indem Sie den Kopf und die Ohren in ihren jeweiligen Halterungen befestigen.
	<ol>
		<li>Schmieren Sie die Augen, bevor Sie das Tier in das stereotaktische Gerät einsetzen, mit einer sterilen Augensalbe.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rasieren Sie die Kopfhaut mit einem Rasierer und sterilisieren Sie den Bereich mit Betadine-Tupfern.</li>
	<li>Schneiden Sie mit einem Skalpell einen Schnitt in der Mittellinie und reflektieren Sie die Haut und die darunter liegenden Muskeln über dem zu injizierenden Bereich.</li>
	<li>Drehen Sie eine Skalpellklinge als Trepan, um eine Kraniotomie über der freizulegenden Region durchzuführen. Alternativ können Sie einen kleinen Bohrer verwenden, der an einem Dremel befestigt ist, um die Kraniotomie durchzuführen.
	<ol>
		<li>Um die Kraniotomie durchzuführen, legen Sie ein Skalpell oder einen Bohrer auf die Oberfläche des Schädels und drehen Sie sich langsam, bis genügend Knochen ausgegraben wurde, um die darunter liegende Pia mater freizulegen.</li>
		<li>Sobald die erste Exkavation erfolgt ist, vergrößern Sie die Kraniotomie mit einer feinen Pinzette, um vorsichtig Knochen von den Rändern zu entfernen.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Füllen Sie eine 1 μl Spritze mit der zu injizierenden Viruslösung (UNC Vector Core).
	<ol>
		<li>Um die Wirksamkeit der Transfektion zu verbessern, bereiten Sie die Viruslösung mit 4 μg/ml Polybren vor.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Senken Sie die Nadel in den zu injizierenden Bereich und infundieren Sie mit einer Spritzenpumpe 200 nl virushaltige Lösung.
	<ol>
		<li>Lassen Sie die Spritze 10 Minuten einwirken, bevor Sie die Nadel zurückziehen.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Nähen Sie die Haut mit nicht resorbierbarem monofilamentem Nylon und bedecken Sie den Schnitt mit antibiotischer Salbe.
	<ol>
		<li>Die Fäden sollten nach 7-10 Tagen gezogen werden.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Injizieren Sie Buprenorphin (0,05-0,1 mg/kg) zur postoperativen Analgesie.</li>
	<li>Lassen Sie die Tiere 14-21 Tage lang postoperativ genesen, um eine angemessene Expression von Kanalrhodopsin zu ermöglichen.</li>
</ol>
2. Vorbereitung von Schichten
<ol>
	<li>Nach der Erholungsphase ist das Tier mit einer Isoflurananästhesie tief zu betäuben, was durch das Fehlen eines Entzugsreflexes bestätigt wird, wenn der Hinterfuß und/oder die Zehen fest eingeklemmt sind.</li>
	<li>Präparieren Sie das Gehirn durch Enthauptung, gefolgt von Mittellinien- und Frontschnitten am Schädel.</li>
	<li>Schälen Sie den Schädel von der Mittellinie ab, um das Gehirn freizulegen.</li>
	<li>Entferne das Gehirn vorsichtig mit einem feinen Spatel, um die Hirnnerven von der Basis des Gehirns zu trennen.</li>
	<li>Legen Sie das präparierte Gehirn schnell in ein kleines 100-ml-Becherglas mit gekühlter, eiskalter künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF; in mM: 125 NaCl, 3 KCl, 1,25NaH2PO4, 1 MgCl2, 2 CaCl2, 25 NaHCO3, 25 Glukose).</li>
	<li>Entfernen Sie das Gehirn aus dem ACSF und legen Sie es auf einen Objektträger, der mit mit ACSF vorbenetztem Filterpapier bedeckt ist.</li>
	<li>Machen Sie mit einer sauberen Rasierklinge einen blockierenden Schnitt des Gehirns in der gewünschten Ausrichtung.</li>
	<li>Befestigen Sie die blockierte Oberfläche des Gehirns mit Sekundenkleber auf der Schnittphase.</li>
	<li>Übertragen Sie die Phase in eine Vibratom-Schneidkammer (bis zum Schneiden im Gefrierschrank aufbewahrt).</li>
	<li>Gießen Sie eiskaltes ACSF in die Schneidkammer.</li>
	<li>Schneiden Sie Gehirnschnitte bei 400-500 μm mit einem vibrierenden Gewebeschneider.</li>
	<li>Die Gehirnschnitte werden in eine Haltekammer mit sauerstoffreichem ACSF überführt und vor dem Experiment mindestens 1 Stunde lang bei 30 °C inkubiert.</li>
</ol>
3. Physiologische Aufzeichnung
<ol>
	<li>Nach der Inkubationszeit wird eine Scheibe in eine Aufnahmekammer auf einem modifizierten Mikroskoptisch überführt.</li>
	<li>Sichern Sie die Scheibe während des Experiments im Bad mit ein paar Fäden aus Nylonfilamenten, die an einem Scheibenhalter aus Platindraht befestigt sind.</li>
	<li>Perfusionieren Sie das Slice ständig mit ACSF.</li>
	<li>Ziehen Sie die Aufzeichnungspipetten auf einen Spitzenwiderstand von 3-6 MΩ, wenn sie mit einer intrazellulären Lösung gefüllt sind, die Folgendes (in mM) enthält: 127 K-Gluconat, 3 KCl, 1 MgCl2, 0,07 CaCl2, 10 HEPES, 2 Na2-ATP, 0,3 Na-GTP, 0,1 EGTA. Die intrazelluläre Lösung sollte einen pH-Wert von 7,3 haben, mit KOH oder Gluconsäure eingestellt werden und eine Osmolalität von 280-290 mOsm aufweisen.</li>
	<li>Unter Verwendung eines standardmäßigen Aufbaus für visualisierte Ganzzellaufzeichnungen wird die Aufnahmepipette in der Nähe des aufzuzeichnenden Neurons platziert, während ein positiver Druckausgeübt wird 22,23.</li>
	<li>Lassen Sie den Überdruck ab, während Sie einen Sog ausüben, um eine Gigaohm-Dichtung zu bilden.</li>
	<li>Wenden Sie einen kurzen Sog an, um die Membran aufzubrechen und eine Aufzeichnung der Ganzzellkonfiguration zu erstellen.</li>
	<li>Zeichnen Sie die Reaktionen von Neuronen entweder in der Spannungs- oder Stromzange auf.</li>
</ol>
4. Laser-Scanning-Photostimulation
<ol>
	<li>Starten Sie die Datenerfassungssoftware und -hardware, die in den vorherigen Berichten23-29. beschrieben wurde.
	Hinweis: Wir haben sowohl Tidelwave25 als auch in jüngerer Zeit Ephus26 Akquisitionsprogramme verwendet, die in Matlab geschrieben und vom Labor von Karel Svboda bei Janelia Farms30 entwickelt wurden. Für eine vollständige Beschreibung der Laser-Scanning-Photostimulation bei Ephus siehe Suter et al.26 und die Schritt-für-Schritt-Anleitung30. 
	Hinweis: Das in diesem Artikel beschriebene Setup ist von dem von Shepherd (2012)23 beschriebenen Setup abgeleitet. Der Laserstrahl wird über ein offenes Strahlsystem von Spiegeln durch die Objektivlinse zum oberen Port des Mikroskops auf die Scheibe geleitet (Abbildung 2).</li>
	<li>Lenken Sie einen kleinen Teil des Lasers auf eine Fotodiode mit einem Mikroskopdeckglas im Lasergang ab und verwenden Sie den Stromausgang dieser Fotodiode, um die Laserintensität während der Experimente zu überwachen.
	<ol>
		<li>Kalibrieren Sie den in der Software aufgezeichneten Fotodiodenstromausgang auf die gemessene Laserleistung in der hinteren Brennebene des Objektivs unter Verwendung eines Leistungsmessers während der Geräteeinrichtung23.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Steuern Sie die Laserleistung, indem Sie ein Rad mit variabler Neutraldichte drehen. Die verwendete Laserleistung schwankte in unseren Experimenten zwischen 25-70 mW (in der hinteren Brennebene).</li>
	<li>Stellen Sie die Länge und das Timing der Laserstimulation ein, indem Sie die Pulsparameter für den Laser und den Shutter ändern. Die Laserstimulation ist in der Regel 2 ms lang.</li>
	<li>Nehmen Sie ein Bild der zu stimulierenden Region mit der Funktion "Video aufnehmen" auf.</li>
	<li>Wählen Sie das Stimulationsgitter entsprechend den gewünschten Abmessungen aus. In der Regel verwenden wir ein 16 x 16 Stimulationsarray mit einem Abstand von 80 μm zwischen benachbarten Reihen und Spalten.</li>
	<li>Überlagern Sie das Mapping-Raster mit dem aufgenommenen Bild und passen Sie den X-, Y- und Grad-Versatz an die gewünschte Position und Ausrichtung an.</li>
	<li>Aktivieren Sie die Funktion "Map", um die Stimulation und Datenerfassung zu starten.</li>
	<li>Nach der Erfassung der photostimulationsevozierten Reaktionen führen Sie die Analyse der kartierten Daten entweder mit dem Offline-Kartenanalyseprogramm in Tidelwave25 oder dem Programm "MapAnalysis" in Ephus26 durch.</li>
</ol>
5. Fixed-Slice-Imaging
<ol>
	<li>Nach der Aufzeichnung wird die Gehirnscheibe über Nacht bei 4 ºC auf 4 % Paraformaldehyd (PFA) in 0,01 M PBS (pH7,4) übertragen.</li>
	<li>Die Scheibe in 30 % Saccharose in 4 % PFA/0,01 M PBS über Nacht bei 4 ºC übertragen.</li>
	<li>50 μm Abschnitte mit einem Kryostaten schneiden und in 0,01 M PBS auffangen.</li>
	<li>Spülen Sie die Abschnitte zweimal bei Raumtemperatur in 0,01 M PBS.</li>
	<li>Montieren Sie die Abschnitte und das Deckglas in einem geeigneten Antifading-Medium.</li>
	<li>Übertragen Sie Schnitte auf das Konfokalmikroskop.</li>
	<li>Fokussieren Sie sich auf den ROI mit weißem Licht.</li>
	<li>Wählen Sie die Wellenlänge, die Bildgröße und die Wiederholung für die Bildaufnahme. Für YFP verwenden wir 514 nm (Ex)/527 nm (Em).</li>
</ol>

<ol><li>Tye, K. M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+investigation+of+neural+circuits+underlying+brain+disease+in+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models.</a> Nat. Rev. Neurosci. 13, 251-266 (2012).</li>
<li>Bernstein, J. G., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+tools+for+analyzing+the+neural+circuits+of+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cog.+Sci%22%5BJournal%5D)">Optogenetic tools for analyzing the neural circuits of behavior.</a> Trends Cog. Sci. 15, 592-600 (2011).</li>
<li>Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetics+in+neural+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Optogenetics in neural systems.</a> Neuron. 71, 9-34 (2011).</li>
<li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Channelrhodopsin-2%2C+a+directly+light-gated+cation-selective+membrane+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 13940-13945 (2003).</li>
<li>Zemelman, B. V., Lee, G. A., Ng, M., Miesenbock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+photostimulation+of+genetically+ChARGed+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Selective photostimulation of genetically ChARGed neurons.</a> Neuron. 33, 15-22 (2001).</li>
<li>Gradinaru, V., Thompson, K. R., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((eNpHR%3A+a+Natronomonas+halorhodopsin+enhanced+for+optogenetic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">eNpHR: a Natronomonas halorhodopsin enhanced for optogenetic applications.</a> Brain Cell Biol. 36, 129-139 (2008).</li>
<li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. M. illisecond-timescale <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nat. Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).</li>
<li>Lanyi, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Halorhodopsin%3A+A+light-driven+chloride+ion+pump%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Rev.+Biophys.+Biophys.+Chem%22%5BJournal%5D)">Halorhodopsin: A light-driven chloride ion pump.</a> Ann. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 15, 11-28 (1986).</li>
<li>Han, X., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple-color+optical+activation%2C+silencing%2C+and+desynchronization+of+neural+activity%2C+with+single-spike+temporal+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Multiple-color optical activation, silencing, and desynchronization of neural activity, with single-spike temporal resolution.</a> PLoS One. 2, (2007).</li>
<li>Zhao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+channelrhodpsin-2+transgenic+mice+for+optogenetic+dissection+of+neural+circuitry+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific channelrhodpsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function.</a> Nat. Methods. 8, 745-755 (2011).</li>
<li>Madisen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+toolbox+of+Cre-dependent+optogenetic+transgenic+mice+for+light-induced+activation+and+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-induced activation and silencing.</a> Nat. Neurosci. 15, 793-802 (2012).</li>
<li>Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+and+application+of+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The development and application of optogenetics.</a> Annu. Rev. Neurosci. 34, 389-412 (2011).</li>
<li>Gradinaru, V., Mogri, M., Thompson, K. R., Henderson, J. M., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+deconstruction+of+parkinsonian+neural+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical deconstruction of parkinsonian neural circuit.</a> Science. 324, 354-359 (2009).</li>
<li>Olsen, S. R., Bortone, D. S., Adesnik, H., Scanziani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gain+control+by+layer+six+in+cortical+circuits+of+vision%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Gain control by layer six in cortical circuits of vision.</a> Nature. 483, 47-52 (2012).</li>
<li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+interrogation+of+neural+circuits%3A+technology+for+probing+mammalian+brain+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Optogenetic interrogation of neural circuits: technology for probing mammalian brain structures.</a> Nat. Protoc. 5, 439-456 (2010).</li>
<li>Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Channelrhodopsin-2-assisted+circuit+mapping+of+long-range+callosal+projections%5BTitle%5D)+AND+%22Na.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections.</a> Na. Neurosci. 10, 663-668 (2007).</li>
<li>Cruikshank, S. J., Urabe, H., Nurmikko, A. V., Connors, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathway-specific+feedforward+circuits+between+thalamus+and+neocortex+revealed+by+selective+optical+stimulation+of+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Pathway-specific feedforward circuits between thalamus and neocortex revealed by selective optical stimulation of axons.</a> Neuron. 65, 230-245 (2010).</li>
<li>Lee, C. C., Lam, Y. W., Sherman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracortical+convergence+of+layer+6+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Intracortical convergence of layer 6 neurons.</a> Neuroreport. 23, 736-740 (2012).</li>
<li>Mancuso, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+probing+of+functional+brain+circuitry%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Optogenetic probing of functional brain circuitry.</a> Exp. Physiol. 96, 26-33 (2011).</li>
<li>Valley, M., Wagner, S., Gallarda, B. W., Lledo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+affordable+LED+arrays+for+photo-stimulation+of+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Using affordable LED arrays for photo-stimulation of neurons.</a> J. Vis. Exp. (57), (2011).</li>
<li>Gong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+Cre+recombinase+to+specific+neuron+populations+with+bacterial+artificial+chromosome+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Targeting Cre recombinase to specific neuron populations with bacterial artificial chromosome constructs.</a> J. Neurosci. 27, 9817-9823 (2007).</li>
<li>Cox, C. L., Sherman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+dendritic+outputs+of+inhibitory+interneurons+in+the+lateral+geniculate+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Control of dendritic outputs of inhibitory interneurons in the lateral geniculate nucleus.</a> Neuron. 27, 597-610 (2000).</li>
<li>Lam, Y. W., Sherman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+by+laser+photostimulation+of+connections+between+the+thalamic+reticular+and+ventral+posterior+lateral+nuclei+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Mapping by laser photostimulation of connections between the thalamic reticular and ventral posterior lateral nuclei in the rat.</a> J. Neurophysiol. 94, 2472-2483 (2005).</li>
<li>Lam, Y. W., Sherman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+organization+of+the+somatosensory+cortical+layer+6+feedback+to+the+thalamus%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">Functional organization of the somatosensory cortical layer 6 feedback to the thalamus.</a> Cereb Cortex. 20, 13-24 (2010).</li>
<li>Shepherd, G. M., Pologruto, T. A., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circuit+analysis+of+experience-dependent+plasticity+in+the+developing+rat+barrel+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Circuit analysis of experience-dependent plasticity in the developing rat barrel cortex.</a> Neuron. 38, 277-289 (2003).</li>
<li>Suter, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ephus%3A+multipurpose+data+acquisition+software+for+neuroscience+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Ephus: multipurpose data acquisition software for neuroscience experiments.</a> Front Neural Circuits. 4, (2010).</li>
<li>Lee, C. C., Sherman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topography+and+physiology+of+ascending+streams+in+the+auditory+tectothalamic+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Topography and physiology of ascending streams in the auditory tectothalamic pathway.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 372-377 (2010).</li>
<li>Lee, C. C., Sherman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+modulators+of+auditory+thalamocortical+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Intrinsic modulators of auditory thalamocortical transmission.</a> Hear Res. , 287-2843 (2012).</li>
<li>Shepherd, G. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShepherd%2C+GM+%22Circuit+mapping+by+ultraviolet+uncaging+of+glutamate%22">Circuit mapping by ultraviolet uncaging of glutamate</a>. , Cold Spring. 998-1004 (2012).</li>
<li>ScanImage, Ephus, and other DAQ software [Internet]. , Janelia Farms. Ashburn (VA). Available from: 
	
 <a target="_blank" href="http://www.ephus.org">http://www.ephus.org</a> (2003).</li>
<li>UNC Gene Therapy Center [Internet]. , University of North Carolina. Chapel Hill (NC). Available from: 
	
 <a target="_blank" href="http://genetherapy.unc.edu/services.htm">http://genetherapy.unc.edu/services.htm</a> (2003).</li>
<li>Optogenetics Resource Center [Internet]. , Stanford University. Stanford (CA). Available from: 
	
 <a target="_blank" href="http://www.stanford.edu/group/dlab/optogenetics">http://www.stanford.edu/group/dlab/optogenetics</a> (2003).</li>
<li>Synthetic Neurobiology Group [Internet]. , MIT. Cambridge (MA). Available from: 
	
 <a target="_blank" href="http://syntheticneurobiology.org">http://syntheticneurobiology.org</a> (2003).</li>
<li>Mutant Mouse Regional Resource Centers [Internet]. , NIH. Bethesda (MD). Available from: 
	 <a target="_blank" href="http://www.mmrrc.org">http://www.mmrrc.org</a> (2003).</li>
<li>GENSAT Brain Atlas [Internet]. , NIH. Bethesda (MD). Available from: 
	 <a target="_blank" href="http://www.gensat.org/cre.jsp">http://www.gensat.org/cre.jsp</a> (2003).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben.
Der Autor (CCL) erhielt ein Publikationsstipendium von Leica Microsystems, das ein Instrument herstellt, das bei dieser Aufnahme dieses Protokolls verwendet wird.

Das beschriebene Protokoll beschreibt einen Ansatz zur in vitro Beurteilung der funktionellen Topographie und Physiologie neuronaler Schaltkreise, der sich nicht auf die Untersuchung von Vorderhirnschaltkreisen, d.h. denen des Thalamus und des Kortex, beschränkt. Mehrere virale Konstrukte für die optogenetische Transfektion wurden der wissenschaftlichen Gemeinschaft zur Verfügung gestellt und sind über den UNC Vector Core leicht erhältlich. Eine Beschreibung der leicht zugänglichen viralen Konstrukte finden Sie im UNC Vector Core31, auf der Ressourcenseite für Optogenetik am Deisseroth Lab an der Stanford University32 und im Boyden Synthetic Neurobiology Lab am MIT33. Varianten dieser Opsine wurden von diesen Labors entwickelt und ermöglichen weitreichende Modi zur Kontrolle der neuronalen Erregbarkeit1,2. Die Beschaffung dieser Vektoren aus dem UNC Vector Core erfordert eine Materialtransfervereinbarung mit den Ursprungslaboren. In diesem Protokoll stellen wir fest, dass die Zugabe von Polybren die Wirksamkeit der Transfektion erhöht. Darüber hinaus ist eine weitere Variable, die die Expression beeinflusst, die postoperative Erholungsphase, bei der wir feststellen, dass ein Zeitraum von mindestens 14 Tagen ausreicht, um eine robuste Expression in den Vorderhirnbahnen von Mäusen zu erhalten.
Für die gezielte Transfektion spezifischer neuronaler Gruppen wurden mehrere Cre-transgene Mauslinien entwickelt, die in Kombination mit "floxierten" umgekehrten offenen Leserahmen-Viruskonstrukten verwendet werden können, die entwickelt wurden11. Mehrere Stämme, die für die neurowissenschaftliche Forschung relevant sind, sind über die Mutant Mouse Regional Resource Centerserhältlich 34. Atlanten von Cre-rekombinase-Expressionsmustern in diesen transgenen Linien werden über die GENSAT-Datenbank35 angeboten. Darüber hinaus bietet Jackson Labs mehrere Cre-transgene Stämme sowie andere an, die Opsine konstitutiv in bestimmten neuronalen Gruppen exprimieren. Ein kritischer Schritt bei der Verwendung dieser Mauslinien besteht darin, die Zeit zu berücksichtigen, die für die Gewinnung und Etablierung einer Zuchtkolonie erforderlich ist, die je nach interessiertem Stamm variieren kann.
Für die Photostimulation haben wir den vom Shepherd Lab an der Northwestern University entwickelten Aufbau verwendet und angepasst, der in einem kürzlich erschienenen Protokollbeschrieben wurde 29. Obwohl dieser Aufbau für die Glutamat-Entkäfigung optimiert ist, ist er auch für die Photostimulation von Channelrhodopsin ohne Modifikation geeignet. Dieser Aufbau ermöglicht eine präzise räumliche Kontrolle und Positionierung der Loci der Photostimulation, was eine Beurteilung der funktionellen Topographie der Kanalrhodopsin-Innervation der aufgezeichneten Neuronen ermöglicht. Obwohl die räumliche Kontrolle durch dieses Verfahren der Photostimulation verbessert wird, ist es kostengünstiger als Verfahren, die eine LED-basierte Feldbeleuchtungverwenden 20. Darüber hinaus ist die Ungleichmäßigkeit des Hirngewebes eine Einschränkung der Optogenetik oder aller Techniken, die eine Manipulation des Lichts beinhalten. In der Praxis spielt dies jedoch selten eine Rolle, da die Ergebnisse meist qualitativ interpretiert werden. Falls ein quantitativer Vergleich zwischen den Gehirnregionen erforderlich ist, kann man immer die maximale Lichtintensität verwenden, um "gesättigte" Reaktionen zu erzielen.
Darüber hinaus haben wir sowohl Tidelwave- als auch Ephus-Softwareprogramme verwendet, die in Matlab geschrieben wurden, um die Laser-Scanning-Photostimulation und Datenerfassung zu steuern25,26. Es wird jedoch empfohlen, dass diejenigen, die ein ähnliches System einrichten, die neuere Ephus-Software26 verwenden, für die Unterstützung über die Entwicklungsseite30 von Janelia Farms verfügbar ist. Ein wichtiger Schritt ist die Entscheidung, welches dieser Softwarepakete verwendet werden soll, da sich ihre Hardwareanforderungen leicht unterscheiden. Darüber hinaus sind die Kartenanalyseprogramme auf die jeweiligen Datenerfassungsprogramme zugeschnitten.
Einige dieser Schritte können modifiziert werden, um sie an die spezielle Einrichtung des Praktizierenden anzupassen. Injektionen von viralen Lösungen können neben einer Spritze auch mit Verabreichungsmechanismen durchgeführt werden, z.B. funktionieren auch Kapillarglaspipetten, die auf Spitzendurchmesser von ~40 μm gezogen werden. Bei Operationen kann eine nichtstereotaktische Kopfhalterung ersetzt werden, wenn solche Koordinaten für die Führung der Injektionen nicht erforderlich sind. Darüber hinaus können ACSF- und intrazelluläre Lösungszusammensetzungen in Abhängigkeit von den besonderen experimentellen Anforderungen verändert werden, z. B. durch Substitution einer intrazellulären Cäsium- oder Intrazellularlösung mit hohem Chloridgehalt zur Isolierung von Hemmströmen. Eine Alternative zur Bildgebung von Expressionsmustern in festen Schichten kann auch in der lebenden Schicht auf einem geeigneten Bildgebungsrigg mit einem Badperfusionssystem durchgeführt werden.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses Protokoll den Behandler in die Lage versetzen wird, die funktionelle Topographie und synaptische Physiologie von Projektionen in vitro zu charakterisieren, was mit Standardmethoden, z. Charakterisierung von Langstreckenprojektionen, die nicht in einem Slice konserviert werden können. Das beschriebene Transfektionsprotokoll kann auf optogenetische In-vivo-Experimente 1-3,12,14 angewendet werden, da der Verabreichungsmechanismus derselbe ist. Obwohl dieses Protokoll die Transfektion von Mäusen beschreibt, können viele der verfügbaren viralen Vektoren verwendet werden, um diese Opsine theoretisch in einer Vielzahl von Säugetierarten zu transfizieren und zu exprimieren, was eine Vielzahl von vergleichenden und speziesspezifischen Studien ermöglicht1-3.

Die ausgeklügelten Schaltkreise des Vorderhirns von Säugetieren stellen eine experimentelle Herausforderung dar, um die funktionellen Rollen seiner miteinander verflochtenen Komponenten zu entschlüsseln. Die Entwirrung dieser Zusammenhänge wurde in jüngster Zeit durch die Entwicklung optogenetischer Methoden zur spezifischen Anregung und Hemmung neuronaler Populationen und ihrer Projektionen unterstützt1-3. Diese Ansätze machen sich die genetisch kontrollierte Expression von Membrankanälen zunutze, die auf Lichtreagieren 4-6. Besonders hervorzuheben ist, dass Channelrhodopsin, ein lichtgesteuerter Ionenkanal, nach optischer Stimulation neuronale Membranen depolarisiert, was zu einer Erregung des exprimierenden Neurons und seiner Projektionen führt4,7. Umgekehrt hyperpolarisiert Halorhodopin, eine lichtgesteuerte Chloridpumpe, die Membran und hemmt so die gezielte Projektion6,8,9. Mehrere Varianten dieser Opsine wurden entwickelt, mehrere Vektoren für die Transfektion und Expression in neuronalen Populationen von Interesse hergestellt und transgene Mauslinien entwickelt, die diese Opsine konstitutiv exprimieren oder eine Cre-Lox-vermittelte Kontrolle ihrer Expression ermöglichen1,2,10,11.
Die Nützlichkeit dieser optogenetischen Methoden und Materialien hat die moderne experimentelle Neurowissenschaft revolutioniert und ermöglicht es, die Rolle spezifischer neuronaler Schaltkreise in der Physiologie und dem Verhalten des Organismus12-15 zu analysieren. Insbesondere können diese Methoden mit Hilfe von in vitro Schnittpräparaten16-20 kraftvoll auf die funktionelle Dissektion von Gehirnschaltkreisen angewendet werden. In diesem Zusammenhang ist einer der Hauptvorteile dieser Methode die Fähigkeit, die Physiologie von Langstreckenprojektionen zu charakterisieren, die schwierig, wenn nicht gar unmöglich in einer dicken Scheibe zu erhalten sind, wie z. B. die kommissuralen Verbindungen zwischen den Gehirnrindenhemisphären16. Darüber hinaus ermöglicht diese Technologie Manipulationen, die mit anderen Methoden nicht möglich sind, wie z.B. die selektive Hemmung von Projektionen mit feiner zeitlicher Präzision unter Verwendung von Halorhodopsin6,8,9. Darüber hinaus ermöglicht die zelltypspezifische Expression dieser Opsine die selektive Stimulation oder Hemmung isolierter Komponenten in einem neuronalen Schaltkreis1,2,11,15,21. Als solche ermöglichen diese neuartigen optogenetischen Werkzeuge eine beispiellose Analyse der neuronalen Beiträge zu Physiologie und Verhalten.
Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Expression von Channelrhodopsin im Gehirn von Mäusen unter Verwendung von Adeno-assoziierten viralen (AAV) Vektoren1,2. Eine spezifische Transfektion von Zielneuronalpopulationen kann unter Verwendung dieses Protokolls durchgeführt werden, mit der geeigneten Auswahl an Promotorkonstrukten oder transgenen Mäusen, die Cre-Rekombinase in den Zielneuronen von Interesse exprimieren, und einem "floxierten" viralen Konstrukt1,11,15,21 (Abbildung 1). Als Beispiele untersuchen wir hier die kortikokortikalen Projektionen zwischen dem primären visuellen Kortex (V1) und dem sekundären visuellen Kortex (V2) sowie die kortikothalamische Projektion der Schicht 6 vom primären somatorsensorischen Kortex (S1) zum ventroposterioren medialen Kern (VPm). Wir kombinieren diese spezifische Expression mit Laser-Scanning-Photostimulation in vitro, um die synaptische Physiologie und funktionelle Topographie zu beurteilen. Der hier vorgestellte Aufbau ermöglicht die präzise räumliche Positionierung und Steuerung der Loci der Photostimulation. Abschließend beschreiben wir die Visualisierung von Expressionsmustern mittels konfokaler Mikroskopie.

<table><tbody><tr><td>Polybrene</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>SC134220</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd 32% ige Lösung</td><td>EMS</td><td>15714</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD</td><td>Vector Labs</td><td>H-1400</td><td></td></tr><tr><td>AAV virale Konstrukte</td><td>UNC Vector Core</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Maus stereotaktische Kopfhalterung</td><td>Stoelting</td><td>51730</td><td></td></tr><tr><td>Nanocool Injektor</td><td>Harvard Gerät</td><td>703040</td><td></td></tr><tr><td>UV-Laser: 355 nm, Nd:YVO4; 1 W;</td><td>DPSS Lasers, Inc</td><td>3500</td><td></td></tr><tr><td>Galvonometer</td><td>Cambridge Scanning</td><td>6210</td><td></td></tr><tr><td>Spiegel</td><td>Cambridge Scanning</td><td>6m2003S-A</td><td></td></tr><tr><td>Halterung</td><td>Cambridge Scanning</td><td>6102103L</td><td></td></tr><tr><td>Kabel</td><td>Cambridge Scanning</td><td>6010-19-120</td><td></td></tr><tr><td>Treiber/Controller</td><td>Cambridge Scanning</td><td>67121-1</td><td></td></tr><tr><td>Shutter - ZM beschichtet (UV-kompatibel)</td><td>Uniblitz</td><td>L23-ZM2</td><td></td></tr><tr><td>Shutter Controller</td><td>Uniblitz</td><td>VMM-D1</td><td></td></tr><tr><td>Stromverstärker</td><td>Stanford Research Systems</td><td>SR570</td><td></td></tr><tr><td>6713 Platine</td><td>National Instruments</td><td>777741-01</td><td></td></tr><tr><td>2110 Break-Out-Box</td><td>National Instruments</td><td>777643-01</td><td></td></tr><tr><td>PCI-MIO-16E-4</td><td>National Instruments</td><td>777383-01</td><td></td></tr><tr><td>BNC-2090</td><td>National Instruments</td><td>777270-01</td><td></td></tr><tr><td>Kabel</td><td>National Instruments</td><td>184749-01</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TCS SP2</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

laser-scanning-photostimulation von optogenetisch ausgerichteten vorderhirn-schaltkreisen

Laser-scanning Photostimulation of Optogenetically Targeted Forebrain Circuits

Das sensorische Vorderhirn besteht aus kompliziert miteinander verbundenen Zelltypen, deren funktionelle Eigenschaften noch nicht vollständig geklärt sind. Das Verständnis der Wechselwirkungen dieser Vorderhirnschaltkreise wurde in jüngster Zeit durch die Entwicklung optogenetischer Methoden zur lichtvermittelten Modulation der neuronalen Aktivität unterstützt. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Untersuchung der funktionellen Organisation von Vorderhirnschaltkreisen in vitro mittels Laser-Scanning-Photostimulation von Channelrhodopsin, das optogenetisch über virale Transfektion exprimiert wird. Dieser Ansatz nutzt auch den Nutzen der Cre-Lox-Rekombination in transgenen Mäusen, um die Expression in bestimmten neuronalen Zelltypen zu beeinflussen. Nach der Transfektion werden die Neuronen physiologisch in Schnittpräparaten mit Hilfe einer Ganzzell-Patch-Clamp aufgezeichnet, um ihre evozierten Reaktionen auf die Laser-Scanning-Photostimulation von Channelrhodopsin-exprimierenden Fasern zu messen. Dieser Ansatz ermöglicht eine Beurteilung der funktionellen Topographie und der synaptischen Eigenschaften. Morphologische Korrelate können durch Abbildung der neuroanatomischen Expression von Kanalrhodopsin-exprimierenden Fasern mittels konfokaler Mikroskopie des lebenden Schnitts oder postfixierten Gewebes erhalten werden. Diese Methoden ermöglichen funktionelle Untersuchungen von Schaltkreisen im Vorderhirn, die konventionellere Ansätze erweitern.

Laser-Scanning-Photostimulation von Projektionen zwischen dem primären visuellen Areal (V1) und dem sekundären visuellen Areal (V2) bei der Maus wurde durchgeführt nach Injektionen von pAAV-CaMKIIa-hChR2(H134R)-EYFP in V1 einer Balb/C-Maus (Abbildung 3Der CaMKIIa-Promotor in diesem viralen Konstrukt ermöglicht die spezifische Expression von Channelrhodopsin-EYFP in exzitatorischen glutamatergen Neuronen.1,15Nach der Herstellung von Schnitten zur physiologischen Ableitung, Expression von Channelrhodopsin-EYFP-Fasern, das heißt Epifluoreszenz des konjugierten EYFP, wurde beim Durchtritt von V1 nach V2 beobachtet (Abbildung 3A). Zusätzlich wurden auch die corticothalamischen Fasern im lateralen Geniculum (LGN) beobachtet (Abbildung 3A). Ganzzell-Patch-Clamp-Aufnahmen von einem Neuron in V2 zeigten EPSCs, die durch lasergestützte Photostimulation von Channelrhodopsin-EYFP exprimierenden Fasern in den tieferen Schichten von V2 ausgelöst wurden (Abbildung 3B).
In einem weiteren Beispiel wurde die Laser-Scanning-Photostimulation der kortikothalamischen Projektionen aus Schicht 6 des primären somatosensorischen Kortex (S1) auf den ventroposterioren Kern (VP) mithilfe dieses Protokolls durchgeführt. Dabei verwendeten wir einen Cre-Lox-Ansatz, um die Expression von Channelrhodopsin gezielt in den Neuronen der Schicht 6 und den betreffenden kortikothalamischen Projektionen anzusteuern. Konkret injizierten wir pAAV-Ef1a-DIO-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-pA in den S1 von B6.Cg-Tg(Ntsr1-cre)GN220Gsat/Mmcd Mäusen (Abbildungen 1 und 4). Diese transgene Mauslinie exprimiert Cre-Rekombinase spezifisch in kortikothalamischen Neuronen der Schicht 621, wodurch nach Transfektion mittels des „gefloxten“ AAV-Konstrukts eine Expression von ChR-YFP ausschließlich in diesen Neuronen erfolgt. Nach der Herstellung von Schnitten konnten Channelrhodopsin-EYFP-Fasern in den Neuronen der Schicht 6 sowie in den Fasern, die zu Schicht 4 und zum VP projizieren, beobachtet werden (Abbildungen 4A und 4B). Die physiologische Aufzeichnung von einem VPm-Neuron mittels Ganzzell-Patch-Clamp zeigte, dass EPSCs durch Laser-Scanning-Photostimulation in der Nähe des aufgezeichneten Neurons ausgelöst werden konnten (Abbildungen 4C und 4D).
Die Morphologie der markierten Fasern ließ sich leichter beurteilen, nachdem physiologische Ableitungen durchgeführt worden waren. Hier schneiden wir erneut (50 μm) Schnittpräparationen mit Channelrhodopsin-EYFP-Expression in kortikothalamischen Neuronen der Schicht 6 (Abbildung 5). Dabei zeigte sich ein feines Muster markierter Fasern, die von Schicht 6 bis in Schicht 4 verliefen, wo sie endeten und sich ausgiebig verzweigten (Abbildung 5A). Zusätzlich wurden kortikothalamische Fasern beobachtet, die in die weiße Substanz eindrangen und sich in Richtung Thalamus zogen (Abbildungen 5A und 5B).
<img alt="Genbearbeitungsdiagramm unter Verwendung von Cre-loxP zur gezielten ChR-YFP-Expression in einem Mausmodell." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50915/50915fig1.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Abbildung 1"> 
Abbildung 1. Schematische Darstellung der gezielten Expression von Channelrhodopsin mittels eines Cre-Lox-Ansatzes. Transgene Mäuse, die Cre-Rekombinase in den interessierenden neuronalen Zellpopulationen exprimieren, werden mit einem „floxed“ Virus injiziert, das Channelrhodopsin, das an ein fluoreszierendes Protein wie YFP fusioniert ist, kodiert. Nach der Transfektion exprimieren nur Neurone, die über Cre-Rekombinase verfügen, Channelrhodopsin-EYFP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50915/50915fig1highres.jpg" target="_blank">Hier klicken, um die Abbildung in größerer Auflösung anzusehen</a>.
<img alt="Laser-Mikroskopie-Diagramm mit Laser-Optik, dichroischem Spiegel, CCD-Kamera und Abtastanordnung." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50915/50915fig2.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Abbildung 2"> 
Abbildung 2. Schematische Darstellung der Photostimulationsanordnung. (A) Diagramm der Laser-Scanning-Photostimulationsanordnung. Der Laserstrahl wird nacheinander durch ein offenes Strahlsystem zu einem Verschluss und einem Neutraldichtefilter (N.D.) gelenkt. Ein Deckglas reflektiert einen Teil des Strahls auf eine Fotodiode, die mit einem Verstärker zur Messung der Laserleistung verbunden ist. Spiegelgalvanometer dienen dazu, den Laserstrahl über eine Scan-Linse zu positionieren, die den Strahl durch eine Seitenöffnung an der Oberseite des Mikroskops leitet. Der Strahl wird dann mithilfe eines dichroischen Spiegels durch das Objektiv nach unten auf das Schnittpräparat gelenkt. Weitere Einzelheiten finden sich bei Lam und Sherman23 und Shepherd29. (B) Beispiel für das Photostimulationsrastermuster im repräsentativen Experiment, das in Abbildung 3 gezeigt wird. Das 16 × 16-Stimulationsraster ist über eine Fotomikrografie des Schnittpräparats gelegt. Ein roter Stern markiert die Position eines Neurons, das mittels Ganzzellen-Patch-Clamp-Aufnahme registriert wurde. Die Position des Laserstrahls wird durch computerisierte Steuerung der Spiegelgalvanometer an jede der 256 Positionen im Stimulationsraster gelenkt. Die Laserpositionen der ersten 5 Stimulationsstellen sind in der Abbildung dargestellt. Die Antworten des aufgezeichneten Neurons auf die Photostimulation an jeder dieser Stellen sind in Abbildung 3 dargestellt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50915/50915fig2highres.jpg" target="_blank">Hier klicken, um die Abbildung in größerer Auflösung anzuzeigen</a>.
<img alt="Neuroimaging-Kartendiagramm; Analyse von LGN, V1, V2 visueller Kortex; Untersuchung neuronaler Verbindungen." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50915/50915fig3.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Abbildung 3"> 
Abbildung 3. Laser-Scanning-Photostimulation kortikokortikaler Projektionen vom primären visuellen Kortex (V1) zum sekundären visuellen Kortex (V2) bei der Maus. (A) Epifluoreszenzbild des Schnittpräparats mit Channelrhodopsin-EYFP-Fasern von V1 nach V2 und zum Nucleus geniculatus lateralis (LGN). Die spezifische Expression von Channelrhodopsin-EYFP in exzitatorischen glutamatergen Neuronen wird durch einen viralen Konstrukt mit dem CaMKIIa-Promotor induziert. (B) Ausgelöste exzitatorische postsynaptische Ströme (EPSCs) in einem Neuron in V2 nach Laser-Scanning-Photostimulation. Der rote Stern markiert die Ableitungsstelle. Maßstäbe: (A) 500 µm, (B) 200 pA, 100 ms. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50915/50915fig3highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um das Bild in größerer Auflösung anzusehen</a>.
<img alt="Schemazeichnung der kortikalen Schichten mit Analyse des VP-Bereichs; zeigt mikroelektrische Aktivität; elektrophysiologische Daten." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50915/50915fig4.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Abbildung 4"> 
Abbildung 4. Laser-Scanning-Photostimulation kortikothalamischer Projektionen vom primären somatosensorischen Kortex (S1) zum ventroposterioren Kern (VP) bei der Maus. (A) Epifluoreszenzbild des Schnittpräparats mit Channelrhodopsin-EYFP-Fasern im S1. (B) Epifluoreszenzbild markierter Fasern im VP. (C) Angeregte exzitatorische postsynaptische Ströme (EPSCs) eines VP-Neurons nach Laser-Scanning-Photostimulation. (D) Darstellung der mittleren EPSCs. Der rote Stern markiert die Ableitstelle. Die框ed traces in (C) entsprechen den框ed Werten in (D). Maßstäbe: (A) 250 µm, (B) 250 µm, (C) 100 pA, 100 ms. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50915/50915fig4highres.jpg" target="_blank">Hier klicken, um das Bild in größerer Auflösung anzusehen</a>.
<img alt="Fluoreszenzmikroskopie, die neuronale Strukturen zeigt, markiert mit grünen Markern; Vergleichsdiagramm." fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50915/50915fig5.jpg" width="500px" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 5"> 
Abbildung 5. Abbildung von Neuronen der Schicht 6, die Channelrhodopsin-EYFP im primären somatosensorischen Kortex (S1) der Maus exprimieren. (A–B) Markierte Neuronen in Schicht 6 und Fasern, die zu Schicht 4 und zur weißen Substanz projizieren. Maßstabsbalken: (A) 250 µm, (B) 250 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50915/50915fig5highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um das Bild in größerer Auflösung anzusehen</a>.

Wir beschreiben eine Methode zur Charakterisierung der funktionellen Topographie und der synaptischen Eigenschaften von Vorderhirnschaltkreisen unter Verwendung eines optogenetischen Ansatzes zur Photostimulation neuronaler Populationen in vitro.

Laser-Scanning-Photostimulation von optogenetisch ausgerichteten Vorderhirn-Schaltkreisen

The sensory forebrain is composed of intricately connected cell types, of which functional properties have yet to be fully elucidated. Understanding the ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, moderne optogenetische Techniken anzuwenden, um gezielt neuronale Bahnen in in-vitro-Schnittpräparaten photo-stimulieren zu können. Dies wird erreicht, indem zunächst Channelrhodopsin in den betreffenden neuronalen Zelllinien exprimiert wird. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, akute Schnittpräparationen der zu untersuchenden Gehirnstrukturen herzustellen.Der nächste Schritt besteht darin, die Antworten von Neuronen in der Schnittpräparation auf die photochemische Stimulation der Kanal- und Stäbchen-Dossin-exprimierenden Fasern aufzuzeichnen. Der letzte Schritt ist die Abbildung der Verteilung der Kanal-Opsin-exprimierenden Neuronen und Fasern. Letztendlich ermöglicht dieser Ansatz die Beurteilung der funktionellen Topographie und synaptischen Eigenschaften neuronaler Schaltkreise mittels laserbasiertem photostimulativen Ansatz an optogenetisch gezielten neuronalen Komponenten.Die Hauptvorteile dieser Technik im Vergleich zu herkömmlichen elektrischen Stimulationsmethoden liegen in der Möglichkeit, gezielt bestimmte neuronale Zelltypen anzusteuern und zu stimulieren sowie deren langreichweitige Projektionen in vitro zu untersuchen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Systemneurowissenschaft zu beantworten, beispielsweise zur funktionalen Organisation komplexer Warzensocken. Bereiten Sie eine Spritze und eine Nadel vor, um die virale Lösung zu injizieren, die vier Mikrogramm pro Milliliter Poly enthält, um die Transfektion zu verbessern.Drücken Sie anschließend 200 Nanoliter der Lösung mittels einer Spritzenpumpe injizieren; zwei bis drei Wochen später wird ein ausreichender Ausdruck von Channelrod Dossin im Schnitt vorliegen. Die Vorbereitung sollte so schnell wie möglich durchgeführt werden. Nach dem Entfernen des injizierten Gehirns, blocken Sie das Gehirn in der gewünschten Orientierung mit einer sauberen Rasierklinge. Befestigen Sie anschließend die blockierte Gehirnfläche mit Sekundenkleber auf der Schneidebühne.Überführen Sie dann das Präparat in eine auf Kälte eingestellte Vibram-Schneidkammer und geben Sie eiskalte A-CSF in die Schneidkammer. Schneiden Sie die Gehirnschnitte mit einem Viome in vier bis 500&nbsp;Mikrometer dicke Abschnitte. Überführen Sie die Gehirnschnitte in eine mit Sauerstoff versorgte Haltekammer und lassen Sie sie mindestens eine Stunde bei 30&nbsp;Grad Celsius inkubieren, bevor Sie mit dem Experiment fortfahren.Wenn Sie bereit sind, das Experiment zu beginnen, überführen Sie den Gehirnschnitt auf die Stufe der elektrophysiologischen Ableitapparatur. Nehmen Sie ein Neuron mit standardmäßigen Ganzzell-Patch-Clamp-Techniken auf. Positionieren Sie die Aufnahmepipette kurz neben dem Neuron, während Sie einen positiven Druck auf die Pipette ausüben.Nach Herstellung des Kontakts mit der Zelle den Druck abbauen und Saugung anwenden, um die Gigaseal-Formation zu erzielen. Anschließend kurz Saugung anwenden, um die Membran zu rupturieren und die Ganzzell-Konfiguration zu erreichen, und Aufnahmen im Spannungs- oder Strom-Klemm-Modus durchführen. Den Laserscanner entweder mit der Tidal-Wave- oder der EFAs-Datenerfassungssoftware betreiben.Die Software muss vor der Verwendung zur Leistungssteuerung des Lasers auf die Fotodiode kalibriert werden. Ein variables Neutraldichter-Rad wird in den Strahlengang eingebracht. Durch Drehen des Rades wird die Laserleistung durch Messung in der hinteren Brennebene angepasst.Die Leistung wird typischerweise zwischen 25 und D Milliwatt eingestellt. Der Pulsparameter des Verschlusses steuert Dauer und Timing der Stimulation in der Software. Ein Bild der zu stimulierenden Region kann mithilfe der Videoaufnahmefunktion erstellt werden.Als Nächstes legen Sie das Stimulationsraster, beispielsweise ein 16 mal 16 Raster mit einem Abstand von 80 Mikron, fest. Anschließend überlagern Sie das Raster mit dem aufgenommenen Bild und passen die XY-Koordinaten sowie den Versatzgrad an, um die Ausrichtung für den Beginn der Stimulation zu optimieren. Aktivieren Sie die Kartenfunktion.Die Daten werden gespeichert und können mit dem Offline-Analyseprogramm in Tidal Wave ausgewertet werden oder mit dem Map-Analyseprogramm in der EFAs-Software. Nach Abschluss der physiologischen Ableitungen am Schnitt kann das Expressionsmuster des mit YFP markierten Kanalopsins dokumentiert werden. Zunächst fixieren Sie den Schnitt über Nacht in 4 % PFA in 0,01 molarer PBS bei vier Grad Celsius.Am nächsten Tag die Schnittprobe in eine 30 %igen Saccharose-4 %igen PFA-Lösung zur kryoschonenden Übernachtung überführen. Am folgenden Tag 50 µm dicke Schnitte der Probe am Kryostaten anfertigen. Die Schnitte mit PBS spülen und mit einem Antifade-Medium für die Bildgebung am konfokalen Mikroskop aufdecken.Nachdem der interessierende Bereich im weißen Licht gefunden wurde, verwenden Sie eine anregende Wellenlänge von 514 Nanometern und eine Emissionswellenlänge von 527 Nanometern. Um den YFPA-Viruskonstrukt abzubilden, der die Expression des Kanalstabs Dobson, EYFP, in anregenden glutamatergen Neuronen antreibt, wurde dieser in den primären visuellen Kortex einer BSY-Maus injiziert.Es wurde virale Expression in Bahnen zwischen der primären und sekundären Sehrinde sowie in den kortikothalamenten Fasern des LGN gefunden. Ganzzell-Patch-Clamp-Aufnahmen von einem mit dem Stern markierten Neuron in der sekundären Sehrinde zeigten ePSCs. Nach lassergestützter photostimulation der Kanäle wurden Rod-Dossin-exprimierende Fasern in den unteren Schichten von V2 beobachtet, die kortikothalamente Projektionen aus Schicht sechs der primären somatosensorischen Rinde darstellen. Der ventrale posteriore Kern wurde mithilfe eines CRE-Lox-Ansatzes untersucht, um Channel-Rod-Dossin in kortikothalamenten Neuronen der Schicht sechs und in deren Projektionen zu exprimieren. Wie erwartet führte die Transfektion eines floxeden AAV-Konstrukts in eine CRE-transgene Maus zur Expression von Channel-Rod-Dossin in den gezielten Neuronen der Schicht sechs und deren Fasern, die sich bis in Schicht vier erstrecken.Bei Kanalstabs-Dobson wurde ebenfalls EYFP-Expression in Fasern beobachtet, die zu VP projizieren, sowie physiologische Ableitungen von einem VP-Neuron. Ganzzell-Patch-Clamp-Aufnahmen zeigten, dass ePSCs nach photostimulatorischer Reizung in der Nähe des aufgezeichneten Neurons ausgelöst werden konnten, das durch den Stern markiert ist. Die Offline-Analyse zeigt die mittlere Antwortamplitude auf photostimulatorische Reizung im VP. In resezierten 50-Mikrometer-Schnitten von kortiko-thalamischen Neuronen der Schicht sechs, die Kanalstabs-Dobson-EYFP exprimieren, zeigte sich ein feines Muster markierter Fasern, die von Schicht sechs zu Schicht vier verlaufen, dort enden und sich ausgiebig verzweigen.Außerdem wurden kortiko-thalamische Fasern beobachtet, die in die weiße Substanz eindringen und zum Thalamus verlaufen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie moderne optogenetische Techniken angewendet werden, um gezielt neuronale Bahnen in in-vitro-Schnittpräparaten photo-stimulieren zu können. Vergessen Sie nicht, dass das Arbeiten mit Lasern äußerst gefährlich sein kann, wenn Sie Kalibrierungsschritte durchführen, die mit diesem Verfahren verbunden sind.Tragen Sie Schutzbrille.

laser-scanning-photostimulation-optogenetically-targeted-forebrain

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Laser-Scanning-Photostimulation von optogenetisch gezielten Hirnrindenkreisläufen

Dieses Papier stellt einen Ansatz der Kombination von Laser-Scanning-Photostimulation mit Ganzkeim Aufnahmen in transgenen Mäusen, die GFP in begrenzten hemmende Neuronen Populationen. Die Technik ermöglicht die umfassende Abbildung und quantitative Analyse der lokalen synaptischen Schaltungen des spezifischen inhibitorischen kortikalen Neuronen.

Mapping hemmende neuronale Schaltungen durch Laser Scanning Photostimulation

Die Entwicklung Optogenetik bietet nun die Mittel zur Stimulierung genau genetisch definierten Neuronen und Schaltungen,...

LWL-Implantation für chronische optogenetische Stimulation des Hirngewebes

Die jüngste Entwicklung der Neurowissenschaften Tools, die Genetik und Optik zu kombinieren, die als "Optogenetik", ermöglicht die Kontrolle über die neuronalen Schaltkreis-Aktivität mit einem beispiellosen Maß an räumlicher und zeitlicher Auflösung. Hier bieten wir ein Protokoll für die Integration von In-vivo-Aufnahme mit optogenetischen Manipulation von genetisch definierte Untergruppen von präfrontalen kortikalen und subicular Pyramidenzellen.

Eine Methode zur High Fidelity optogenetische Kontrolle der Einzelpyramidenzellen<em&gt; In-vivo-</em

Hier beschreiben wir ein Protokoll für optogenetische Manipulation motoneuralen Aktivität, während die Überwachung der Motorleistung (Muskelkontraktion) in...

Optogenetische Störung der neuronalen Aktivität mit Laser Illumination in Semi-intakt<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven in Motion

Optogenetik ist zu einem mächtigen Werkzeug für den Einsatz in verhaltensneurowissenschaftlichen Experimenten geworden. Dieses Protokoll bietet eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für das Design und die Einrichtung von Lasersystemen und bietet ein vollständiges Protokoll für die Durchführung mehrerer und gleichzeitiger optogenetischer In-vivo-Stimulationen, die mit den meisten Verhaltenstestparadigmen von Nagetieren kompatibel sind.

In vivo optogenetische Stimulation des Nager Central Nervous System

Dieses Protokoll beschreibt die Schritte und Datenanalysen, die für eine erfolgreiche Durchführung der optogenetischen funktionellen Magnetresonanztomographie (ofMRT) erforderlich sind. ofMRT ist eine neuartige Technik, die die Hochfeld-fMRT-Auslesung mit optogenetischer Stimulation kombiniert und so eine zelltypspezifische Kartierung funktioneller neuronaler Schaltkreise und ihrer Dynamik im gesamten lebenden Gehirn ermöglicht.

Optogenetische Functional MRI

Dieses Protokoll beschreibt eine Reihe von Methoden, um die zelltypspezifische funktionelle Konnektivität von Ferneingaben aus entfernten Hirnregionen mithilfe optogenetischer Stimulationen in ex vivo Gehirnscheiben zu identifizieren.

In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injektionen für optogenetische Stimulation von Long-Range-Eingängen in Maus Gehirn Scheiben

Mit optogenetischer Manipulation bestimmter neuronaler Populationen oder Hirnregionen kann das Verhalten bei frei beweglichen Tieren mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung verändert werden. Durch den Einsatz verschiedener optogenetischer Werkzeuge in Kombination mit chronisch implantierten optischen Fasern kann eine Vielzahl neuronaler Modulationen und Verhaltenstests durchgeführt werden.

Optogenetische Manipulation der neuronalen Aktivität, um das Verhalten bei frei beweglichen Mäusen zu modulieren

Wie derzeit implementiert, erfordert die Optogenetik bei nichtmenschlichen Primaten die Injektion viraler Vektoren in das Gehirn. Eine optimale Injektionsmethode sollte zuverlässig sein und für viele Anwendungen in der Lage sein, einzelne Stellen beliebiger Tiefe anzuvisieren, die in der postmortalen Histologie leicht und eindeutig identifiziert werden können. Ein Injektionsverfahren mit diesen Eigenschaften wird vorgestellt.

Injektionen von AAV-Vektoren für die Optogenetik in anästhesiertem und wach verhaltendem nicht-menschlichem Primatengehirn

Die hier beschriebenen Methoden skizzieren ein Verfahren, mit dem die Kokain-induzierte Plastizität in einem verhaltensrelevanten Schaltkreis bei Ratten optogenetisch umgekehrt wird. Eine anhaltende niederfrequente optische Stimulation der Thalamo-Amygdala-Synapsen induziert eine langfristige Depression (LTD). In vivo führte eine optogenetisch induzierte LTD bei Kokain-erfahrenen Ratten zu einer anschließenden Abschwächung der Cue-motivierten Drogensuche.

Verwendung von Optogenetik zur Umkehrung der Neuroplastizität und zur Hemmung der Kokainsuche bei Ratten

Hier stellen wir zwei Protokolle für die Aufzeichnung von Mikro-Elektrokortikographie (μEcoG) mit hoher Dichte bei Ratten und Mäusen vor, einschließlich chirurgischer, Implantations- und Aufzeichnungsmethoden. μECoG-Aufzeichnungen werden entweder in Kombination mit laminarer Polytrodenaufzeichnung im auditorischen Kortex der Ratte oder mit optogenetischer Manipulation der neuronalen Aktivität im somatosensorischen Kortex der Maus durchgeführt.

Multiskalige Untersuchungen der kortikalen Prozessierung durch Integration laminarer Polytroden und Optogenetik mit Mikroelektrokortikographie bei Nagetieren

Erfahren Sie die Laser-Scanning-Photostimulation optogenetisch ausgerichteter Vorderhirn-Schaltkreise. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung funktioneller Topographie und synaptischer Eigenschaften neuronaler Netzwerke in vitro.

Laser-Scanning-Photostimulation von optogenetisch ausgerichteten Vorderhirn-Schaltkreisen

Weitere Videos entdecken