Laser-Scanning-Photostimulation von optogenetisch ausgerichteten Vorderhirn-Schaltkreisen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, moderne optogenetische Techniken anzuwenden, um gezielte neuronale Signalwege in in vitro Schnittpräparationen zu photostimulieren. Dies wird erreicht, indem zunächst das Kanalstäbchen Dossin in den interessierenden neuronalen Zelllinien exprimiert wird. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, akute Schnittpräparationen der relevanten zu untersuchenden Gehirnstrukturen vorzunehmen.

Der nächste Schritt besteht darin, die Reaktionen von Neuronen in der Schnittpräparation als Reaktion auf die Photostimulation des Kanals, des Stäbchens Dossin, das die Fasern exprimiert, aufzuzeichnen. Der letzte Schritt besteht darin, die Verteilung der Kanal-Opsin-exprimierenden Neuronen und Fasern abzubilden. Letztendlich ermöglicht dieser Ansatz eine Beurteilung der funktionellen Topographie und der synaptischen Eigenschaften neuronaler Schaltkreise mittels Laserscanning-Photostimulation von optogenetisch ausgerichteten neuronalen Komponenten.

Die Hauptvorteile dieser Technik gegenüber herkömmlichen elektrischen Stimulationsmethoden sind die Möglichkeit, bestimmte neuronale Zelltypen gezielt zu stimulieren und ihre weitreichenden Projektionen in vitro zu untersuchen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der systemischen Neurowissenschaften zu beantworten, wie z.B. die funktionelle Organisation komplexer Warsockets. Bereiten Sie eine Spritze und eine Nadel vor, um die Viruslösung zu injizieren, die vier Mikrogramm pro Milliliter Poly enthält, um die Transfektion zu verbessern.

Dann injizieren Sie 200 Nanoliter der Lösung mit der Spritzenpumpe, zwei bis drei Wochen später gibt es eine ausreichende Expression der Kanalstab-Dossin-Scheibe. Die Vorbereitung sollte so schnell wie möglich erfolgen Nach der Entnahme des injizierten Gehirns wird mit einer sauberen Rasierklinge ein Block des Gehirns in der gewünschten Ausrichtung hergestellt. Befestigen Sie anschließend die blockierte Oberfläche des Gehirns mit Sekundenkleber auf der Schnittphase.

Bringen Sie dann die Bühne in eine gefrorene, gekühlte Vibram-Schneidkammer und gießen Sie eiskaltes A CSF in die Schneidkammer. Schneiden Sie die Gehirnabschnitte mit einem Viom in vier bis 500 Mikrometer dicke Abschnitte. Bringen Sie die Gehirnschnitte in eine sauerstoffhaltige Haltekammer und lassen Sie sie mindestens eine Stunde lang bei 30 Grad Celsius inkubieren, bevor Sie mit dem Experiment fortfahren.

Wenn Sie bereit sind, mit dem Experiment zu beginnen, übertragen Sie die Gehirnscheibe auf die Bühne des elektrophysiologischen Aufzeichnungs-Rigs. Nehmen Sie ein Neuron mit den Standardtechniken der Ganzzell-Patch-Clamp auf. Positionieren Sie die Aufzeichnungspipette kurz am Neuron, während Sie positiven Druck auf die Pipette ausüben.

Nachdem der Kontakt mit der Zelle hergestellt wurde, lassen Sie den Druck ab und saugen Sie, um die Giga-Dichtung zu bilden. Wenden Sie dann einen kurzen Sog an, um die Membran für die Konfiguration der gesamten Zelle zu durchbrechen, und machen Sie Aufnahmen im Spannungs- oder Stromklemmenmodus. Betreiben Sie den Laserscanner entweder mit der Datenerfassungssoftware tidal wave oder EFA.

Die Software muss vor der Verwendung auf die Fotodiode kalibriert werden, um die Leistung des Lasers zu steuern. In seinem Weg wird ein Rad mit variabler Neutraldichte platziert. Durch Drehen des Rades wird die Leistung des Lasers durch Messung in der hinteren Brennebene angepasst.

Die Leistung ist typischerweise auf 25 bis D Milliwatt eingestellt. Der Pulsparameter des Shutters steuert die Länge und den Zeitpunkt der Stimulation in der Software. Ein Bild der zu stimulierenden Region kann über die Grab-Video-Funktion erstellt werden.

Stellen Sie als Nächstes das Stimulationsgitter ein, z. B. ein 16 x 16 Raster mit einem Abstand von 80 Mikrometern. Überlagern Sie dann das Raster mit dem aufgenommenen Bild und passen Sie die XY-Koordinaten und den Grad des Versatzes an, um die Ausrichtung zum Starten der Stimulation zu optimieren. Aktivieren Sie die Kartenfunktion.

Die Daten bleiben erhalten und können mit dem Offline-Analyseprogramm in Tidal Wave analysiert werden, oder sie können mit dem Kartenanalyseprogramm in der EFAs-Software analysiert werden. Nach Abschluss der physiologischen Aufzeichnungen auf der Scheibe kann das Expressionsmuster von YFP-markiertem Kanal-Opsin dokumentiert werden. Fixieren Sie die Scheibe zunächst über Nacht in 4%PFA in 0,01 molaren PBS bei vier Grad Celsius.

Übertragen Sie die Scheibe am nächsten Tag in eine 30%ige Saccharose-4%PFA-Lösung, um sie über Nacht zu schützen. Schneiden Sie am nächsten Tag 50 Mikrometer große Abschnitte der Scheibe auf einem Kryostaten. Spülen Sie die Scheiben in PBS ab und montieren Sie sie für die Bildgebung mit einem Anti-Fade-Medium am Konfokalmikroskop.

Nachdem Sie den interessierenden Bereich im weißen Licht gefunden haben, verwenden Sie eine exzitatorische Wellenlänge von 514 Nanometern und eine Emissionswellenlänge von 527 Nanometern. Abbildung des viralen YFPA-Konstrukts, das die Expression des Kanalstäbchens Dobson, EYFP, steuert. In exzitatorischen glutamatergen Neuronen wurden in den primären visuellen Kortex einer BSY-Maus injiziert.

Die virale Expression wurde in Spuren zwischen dem primären und dem sekundären visuellen Kortex und in den kortiko-thalamischen Fasern der LGN-Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnung von einem Neuron im sekundären visuellen Kortex gefunden, das durch den Stern markierte e PSCs markiert wurde. Nach der Laserscanning-Photostimulation des Kanals exprimiert der Stäbchen Dossin Fasern in den unteren Schichten von V zwei kortiko-thalamische Projektionen aus der sechsten Schicht des primären somatosensorischen Kortex. Der ventrale hintere Kern wurde unter Verwendung eines CRE-LAX-Ansatzes untersucht, um Kanal-Stäbchen-Dossin in Cortico-Thalamus-Neuronen der sechsten Schicht zu exprimieren, und in ihren Projektionen führte die Transfektion durch ein beflocktes a a V-Konstrukt in eine CRE-transgene Maus erwartungsgemäß zu einer Kanal-Stäbchendosin-Expression in den Ziel-Neuronen der sechsten Schicht und deren Fasern, die sich bis zur vierten Schicht erstreckten.

Die Expression von Kanalstäbchen Dobson und EYFP wurde auch in Fasern beobachtet, die auf physiologische Aufzeichnungen eines VP-Neurons projiziert wurden. Die Verwendung von Ganzzell-Patch-Clamp zeigte, dass e PSCs nach Photostimulation in der Nähe des aufgezeichneten Neurons, das durch den Stern markiert ist, hervorgerufen werden konnten. Die Offline-Analyse zeigt die mittlere Reaktionsamplitude auf Photostimulation in VP Resektionierten 50-Mikrometer-Scheiben von Cortico-Thalamus-Neuronen der sechsten Schicht, die den Kanal Rodin EYFP exprimieren, zeigten ein feines Muster markierter Fasern, die von Schicht sechs nach Schicht vier verlaufen, wo sie enden und sich großflächig verlagern.

Darüber hinaus wurde beobachtet, dass Cortico-Thalamusfasern in die weiße Substanz eindringen und sich in Richtung Thalamus bewegen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie moderne optogenetische Techniken anwenden können, um gezielte neuronale Signalwege in In-vitro-Schnittpräparaten zu photostimulieren. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Lasern äußerst gefährlich sein kann, wenn Sie die mit diesem Verfahren verbundenen Kalibrierungsschritte durchführen.

Tragen Sie eine Schutzbrille.