Name: Die vollständige und aktualisierte Rädertier Polyculture-Methode für die Aufzucht Erste Fütterung Zebrafisch (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Lernen Sie die Rotifer-Polyculture-Methode zur effizienten Aufzucht von Zebrafischlarven mit Salzwasser-Rotatorien. Diese Technik maximiert Überlebensraten und reduziert Zeit sowie Platzbedarf erheblich.

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Die Pflege und Nutzung von Fischen in diesem Protokoll beschriebenen repräsentativen Ergebnisse generated in voller Übereinstimmung mit den von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee an der Boston Kinderkrankenhaus, Protokoll # 14-05-2673R festgelegten Leitlinien durchgeführt.

1. Rädertier Kultur <ol><li> Grundkomponenten eines Kultursystem mit einem 100 l Kulturgefäß <ol><li> Sammeln Sie alle Komponenten für die Rädertierchen Kultur Setup. Die Rotatorien Kultur Aufbau besteht aus einem Kulturgefäß (CV), um die Rotatorien wachsen; ein ähnliches Gefäß Zuführkopf Rädertierchen (Zuführkopf Kulturgefäß, FCV) aufrecht zu erhalten; ein Rundbrut jar (Feed-Reservoir, FR) für die Lagerung der Algen Futtermischung (AFM); eine Luftzufuhr (AS), um den Lebenslauf, FCV und der FR belüften; eine peristaltische Pumpe mit einem Messtimer (PMT), die Lieferung von Algen Zufuhr in den Lebenslauf und FCV zu steuern; und eine Zahnseide Partikelfilter (FPF), die innerhalb der CV sitzt. HINWEIS: Eine vollständige Liste mit Verbrauchsmaterialien und Komponenten in der Materialliste zur Verfügung gestellt. </li></ol></li><li> Konfiguration <ol><li> Heben die CV und FCV auf einem Ständer oder Tisch, so dass die Kulturen können bequem über eine Ablaufarmatur in einer Sammlung cont geerntet werdenainer (Abbildung 1). Verwenden flexible Luftzufuhrschlauch an den AS zu einer Länge von starren Rohr in jedem Kulturgefäß zu verbinden. Stellen Sie sicher, dass der Schlauch lang genug ist, um Luft in den Boden des CV oder FCV zu liefern. </li><li> Verwenden Sie einen kleinen Leistungsluftleitung, um die AS auf eine Länge von starren Rohrleitung, die auf dem Boden der FR, die die AFM enthält sich zu verbinden. Installieren Sie ein Ventil in jedem Luftlinie um den Luftstrom zu regulieren. Verbinden Sie den FR in die PMT mit Futterförderrohr, und führen Sie den Schlauch von der PMT in ein Loch in der Seite des CV / FCV gebohrt, in der Nähe der Spitze. Abbildung 1. </li></ol></li><li> Anfang <ol><li> Füllen Sie das Kulturgefäß zu 90% des verfügbaren Volumens mit Umkehrosmose (RO). Wenn RO nicht verfügbar ist, verwenden Sie saubere, dechloriert kommunale Wasser; jedoch sollte ein biosecurity Risikobewertung durchgeführt werden, damit keine potentiell pathogenen Organismen im Quellwasser vorhanden sind. HINWEIS: Eine solche Analyse durchgeführt werden kannvon jedem qualifizierten Wasser Prüflabor. </li><li> Dosieren Sie das Kulturgefäß mit Wasser Aquarium Salz in einem Salzgehalt von 15 g / l zu erreichen. Gesetzt den Luftstrom in das Gefäß, so daß sie eine &quot;roll boil&quot; aufrechterhält und dann langsam die gemessene Menge an Salz zu dem Kulturgefäß, bis sie vollständig durch die Belüftung gelöst. Weiterhin Belüften des Wassers für&gt; 1 h, um sicherzustellen, dass sie vollständig mit Sauerstoff angereichert wird. </li><li> Machen Sie das Algenfuttermischung. Bis 3 l sauberem, frischem dechloriert (0 ppm) Wasser mit 100 g NaHCO 3 und 100 g Ammoniakneutralisationsmittel (Natrium hydroxymethylsulfonat). Diese letzte Reagenz bietet den zusätzlichen Vorteil, jede gegen restlichem Chlor aus dem Leitungswasser oder Bleich Rückstände aus Desinfektionskulturtechnik. Es ist entscheidend, um sicherzustellen, daß diese Verbindungen vollständig gelöst. Dann fügen Sie 1 l Algenkonzentrat (Biomasse Trockengewicht ~ 15%). Fügen Sie die Futtermischung an den FR und bei 4 ° C. </li><li> Fügen Sie eine Starterkultur von 5-10000000 <em&gt; Brachionus plicatilis Rädertierchen mit dem CV mit dem belüfteten 15 g / l Salzgehalt Wasser. Wenn die Rotatorien haben während des Transports oder der Lagerung gekühlt worden ist, sollten sie nur langsam (während 30 min oder länger), um die Temperatur des Wassers in dem Kulturgefäß akklimatisiert (25-27 ° C). </li><li> Schalten Sie das PMT und beginnen Pumpen des Algen-Feed in das Rädertierchen Kulturgefäß. Verwendung des Zeitgebers Merkmal der PMT, setzen die Förderrate der Algen Futtermischung, so daß ~ 1,6 ml Algenbeschickungsmischung pro Million Rotatorien in der Kultur pro Tag geliefert. Verteilen der Fütterungen in kleinen Portionen in regelmäßigen Abständen über den Verlauf eines 24-Stunden-Zeitraum; desto häufiger Fütterungen, desto besser. </li><li> Kalibrieren der Fördermenge der Pumpe durch manuelles Einschalten der PMT für einen bestimmten Zeitraum (beispielsweise 1 min) und sammle die Algen, die es während dieser Zeit in einen Messzylinder oder Becherglas pumpt. Zum Beispiel, wenn die PMT Dosen 5 ml von Algen in 1 min, dann wird die Dosisleistung wäre5 ml Algen / min. </li><li> Berechnen Sie die erforderliche tägliche Förderrate durch Multiplikation der Zahl der anwesenden Rädertierchen, in Mio., um 1,6 ml. Zum Beispiel würde ein rotifer Kultur mit einer Populationsgröße von 100 Millionen Rotatorien ~ erfordern 160 ml Futter pro Tag (100 x 1,6 ml). </li><li> Stellen Sie die PMT, um die gesamte tägliche Futterbedarf in regelmäßigen Abständen während einer 24-Stunden-Zeitraum zu dosieren. Zum Beispiel könnte Lieferung einer gesamten täglichen Futtermenge von 160 ml in Portionen zugeführt werden, wenn alle 3 h über einen Zeitraum von 24 h unter Verwendung einer PMT Set mit einer Dosierpumpe Geschwindigkeit von 5 ml / min für 4 min, 8 Mal täglich (5 ml / min x 4 min = 20 ml x 8 Fütterungen = 160 ml). </li><li> Lassen Sie die Kultur für 48 wachsen, bis es die gewünschte Population erzeugt, in der Regel - 72 h vor der Ernte. Bei 24 Stunden nach der Inbetriebnahme, die Zahnseide Partikelfiltern in den Kulturgefäß und beginnen normale Wartung. </li></ol></li><li> Instandhaltung HINWEIS: Die Kultur arbeitet auf einer kontinuierlichen Basis und erfordert routine Wartung, die im Idealfall zur gleichen Zeit jeden Tag durchgeführt werden, in der folgenden Reihenfolge. <ol><li> Füllen Sie den FCV zu 90% der zur Verfügung stehende Volumen mit sauberen, dechloriert frisches Wasser, mit 10 g / l Aquarien Salze dosiert. Sicherzustellen, daß das Wasser gut vermischt, und das gesamte Salz völlig aufgelöst ist. Stellen Sie den Luftstrom in den Behälter, so dass es eine &quot;rollenden kochen&quot; unterhält. Messen Sie den Salzgehalt mit einem Refraktometer und sicherzustellen, dass der Salzgehalt 10 g / l. Es ist kritisch, um dieses Ziel zu erreichen und es nicht zu überschreiten. </li><li> Probieren Sie die Rädertierchen im Lebenslauf: Stellen Sie sicher, dass die Kultur ist gut gemischt, dann sammeln Sie 3 Proben eines 2 - 3 jeweils mit einer Transferpipette oder autopipettor ml, aus verschiedenen Teilen der Kultur. Kombinieren Sie diese Proben in einem Rohr oder Fläschchen praktische Größe (zB 10 ml). </li><li> Transfer 1-2 ml der kombinierten Probe auf eine Petri-Schale, so dass es unter einem Präpariermikroskop visualisiert werden. Prüfen Sie die Qualität der Kultur (Schwimmverhalten derRädertierchen, Gegenwart abgelöst Eier, verunreinigen Protozoen). </li><li> Immobilisieren Rotiferen in dem verbleibenden kombinierten Probe durch Zugabe von 100 ul 50% Lugols Jodlösung auf die Probe. Innerhalb von Sekunden nach der Zugabe der Lugols, beachten Sie die Rädertierchen zum Schwimmen zu stoppen. Nun, leicht zu zählen die Rädertierchen. HINWEIS: Ethanol, verdünnte Bleichmittel, oder Essig kann anstelle von Lugols verwendet werden. Essig (2 Tropfen / 10 ml) hat den Vorteil, dass nicht gefährliche, Stärke nicht zu verlieren bei der Lagerung als Bleich und Jod-Lösungen, und nicht die Herstellung der Rädertierchen Vertrag, so dass die Korona der Zilien und der &quot;Fuß&quot; bleiben ausgefahren und der Tiere natürlicher aussehen. </li><li> Stellen Sie sicher, dass die Probe gut gemischt (immobilisiert Rotatorien schnell absetzen), dann schnell einen ~ 2 ml Teilprobe in einer Plastikpipette und verzichten 1 ml in ein Sedgewick-Rafter Zählen Schieber (20 x 50 1-mm-Quadrate) (Abbildung 2 ). Mit Hilfe eines Sezieren oder zusammengesetzten Mikroskop, zählen Sie die intakte Rädertierchen und die tesamtanzahl Eier auf diese Rotatorien befestigt (Figur 2). Zählen Sie so viel von der Folienbereich wie nötig, um zu zählen ~ 100 Rädertierchen. Berechnen Sie die Anzahl der Rädertierchen pro ml, und notieren Sie diese in einer Tabellenkalkulation oder Logbuch. </li><li> Ernte ~ 30% des Volumens der Rädertierchen im Lebenslauf: Entfernen Sie die Luftversorgung und Zahnseide-Filter, das Ventil zu öffnen langsam an der Unterseite des CV und lassen Sie das Wasser in eine Planktonkollektor mit einer 53 &amp; mgr; m Sieb fließen. Sammeln das Wasser nach der Filterung in einen Eimer oder Drain aus der Unterseite des Kollektors fließt. Verwenden Sie einen sanften bis mäßige Strömung um eine Beschädigung der Rädertierchen. Erlauben nicht den Rädertierchen, um auf dem Bildschirm zu trocknen. </li><li> Aus Gründen der Einheitlichkeit ist es ratsam, das FCV mit einem Standard-Anzahl von Rädertierchen jeden Tag zu schaffen. Daher basierend auf der bekannten CV rotifer Dichte und Erntevolumen, einstellen FCV Gesamtvolumen auf eine konsistente Enddichte zu erreichen (z. B. 1.500 Rotatorien / ml). Fügen Sie die geerntet rotifers an den FCV: Behutsam die Rädertiere übertragen aus der Sammlung Bildschirm mit Hilfe einer Waschflasche mit sauberem Salzwasser gefüllt (10 bis 15 g / l). Kehren Sie die Bildschirm über den FCV und waschen Sie die Rädertierchen in den FCV mit einem sanften Strom von Salzwasser. Starten Sie das PMT zur Einspeisung in den FCV liefern (~ 1,57 ml pro Million Rädertiere pro Tag). </li><li> Scrub die gesamte Innenseite der CV mit einem sauberen, weichen Nylonbürste oder Scheuerpad. </li><li> Stellen Sie eine neue Mischung aus 15 g / L Wasser durch Zugabe der entsprechenden Menge des Salzes zu einer gemessenen Menge an sauberem RO-Wasser in einem 5-Gallonen-Eimer zu ersetzen, das Volumen des Wassers verloren bis zur Ernte. Fügen Sie das Salz in das Wasser in den Eimer und rühren Sie kräftig, bis es vollständig gelöst ist, und dann an den CV hinzuzufügen. </li><li> Mit Hilfe eines Hochdruck-Spray in einer Spüle, spülen Sie die Filterwatte, bis es frei von Abfall, und dann schicken Sie es an die CV. </li><li> Passen Vorschubgeschwindigkeiten von Algen an den CV durch Änderung der Dauer der einzelnen Dosierereignis geliefert, nach dem Tageszahl von Rädertierchen / ml.Verwenden der Berechnungen in Schritt 1.3.8 vorgesehen ist, über die entsprechende Futtermenge zugeführt werden zu bestimmen. </li><li> Etwa 24 Stunden später, wiederholen Sie den Vorgang. Starten durch Ernten der in der FCV (die nicht für den vorherigen Tag wurden benötigt) verbleibenden Rotatorien in der gleichen Weise wie oben beschrieben (Schritte 1.4.2 - 1.4.10). Konzentrieren sie in 2 l frischem, sauberem entchlortes Wasser (5 g / l Salz). Diese können bei 4 ° C als Sicherungsteil gespeichert werden, oder zur späteren Stadien von Fischfutter, das hinaus, was in diesem Protokoll beschrieben. Hinweis: Dieses Protokoll erlaubt bis zu 2 - 3 Tage von reduzierten Kulturpflege (mit normaler automatischer Zuführung), da die Rädertierchen in der CV können Unterlassung der Ernten ohne schwerwiegende Folgen zu tolerieren. </li></ol></li></ol> 2. Polyculture <ol><li> Konfiguration <ol><li> Sammeln Zebrafischembryonen aus einem Laichereignis durch Gießen hervorgebracht Embryonen durch ein Teesieb und dann sanft Spülen mit sterilem fish Wasser (oder einem anderen nicht-kontaminierten Quelle entsprechend aufbereiteter Lösung, zB Embryomedium, E3, etc.) aus einer Waschflasche in Petrischalen. </li><li> Die Embryonen bei 25 inkubieren - 28 ° C in Petrischalen in einer Dichte von 40 - 50 Embryonen pro Schale für 5 Tage. </li><li> Beginnen Sie den polyculture Phase am 5. Tag nach der Befruchtung, oder wenn mehr als 90% der geschlüpften Larven aktiv schwimmen in der Wassersäule. </li></ol></li><li> Impfung <ol><li> In 500 ml Rädertierchen Kultur direkt von der FCV zu einem 3,5 L Kindergarten Tank; Einbeziehung von Rädertierchen Kulturwasser bietet Algen Feed, den Nährstoffgehalt der Rädertierchen in polyculture hält. </li><li> Gießen Sie vorsichtig die Larven aus einer Petrischale in die Kinderstube Tank. Stellen Sie sicher, dass keine Larven in der Schale bleiben. </li><li> Gib 500 ml sauberem, konditioniert Fischwasser aus einem Kreislaufsystem oder dedizierten Wasserquelle zu dem Behälter, um ein Endvolumen von 1 l und eine endgültige s erreichenalinity von 5 g / L. HINWEIS: Dieser Salzgehalt ist kritisch, weil Zebrafischlarven überleben wird negativ beeinflusst, wenn Salzgehalt&gt; 7 g / l und Rädertierchen Überleben wird negativ beeinflusst werden, wenn Salzgehalt &lt;2 g / L. </li></ol></li><li> Polyculture Phase HINWEIS: Die Polykultur Phase sollte für bis zu 4 Tage nach der Inokulation dauern (insgesamt 5 Tage, entsprechend 5-9 Tage nach der Befruchtung). <ol><li> Mindestens einmal pro Tag während dieser Zeit beobachten die Polykultur Tank um sicherzustellen, dass Rädertiere und Fisch anwesend und wachsen. Stellen Sie sicher, dass die Rädertierchen in der gesamten Wassersäule sichtbar sind. Stellen Sie sicher, dass die die fishs sind auch sichtbar in der Wassersäule, Schwimmen unter den Rädertierchen. </li><li> Starten normalen Wasserdurchfluss durch den Tank. Legen Sie einen Bildschirm oder Schallwand über die Ablauföffnung, dass die Larven zu gewährleisten sind nicht aus dem Tank ausgespült. HINWEIS: Am Ende dieser Phase, die Fische groß genug, um größere Beutetiere wie Artemia konsumierenNauplien oder verarbeitet werden Feed-Einträge in einem Größenbereich von 75 bis 125 &amp; mgr; m. HINWEIS: Die rotifer Populationsdynamik innerhalb eines repräsentativen Polykultursystems Tank wurden durch Abtasten gemessen / gezählt Rotatorien vom Tank in der gleichen Weise wie in den Schritten 1.4.2 - 1.4.5. Dies wurde einmal pro Tag ab dem Beginn des Mischkultur Phase durchgeführt, bis sie abgeschlossen war. </li></ol></li></ol>

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</ol>

EG Henry wird von Reed Mariculture, Inc., einem Unternehmen, das Rädertiere, Algen Konzentrate und andere Lieferungen stellt der Aquakultur und Fischhobbymärkten beschäftigt.

Erfolgreiche Umsetzung der Rädertierchen polyculture Verfahren zum Zuführen frühen Larvenzebrafisch erfordert effektive Protokolle für zwei Aufgaben: die Schaffung und Aufrechterhaltung eines kontinuierlichen Rädertierchen Kultursystem, um die Fische zu füttern und das Züchten der ersten Fütterung Zebrafisch-Larven zusammen mit Rädertierchen in der gleichen Tank. Die Einrichtung für eine kontinuierliche salz rotifer Produktionssystem für Laboratorien Zebrafisch zuerst von Lawrence und Mitaut...

Der Zebrafisch (Danio rerio) ist ein herausragender Labortier in einer wachsenden Zahl von wissenschaftlichen Disziplinen verwendet, einschließlich, aber nicht Entwicklungsgenetik, Toxikologie, Verhalten, Aquakultur, Regenerationsbiologie und der Modellierung von vielen menschlichen Erkrankungen 1 begrenzt - 5. Obwohl die Spezies ist relativ einfach im Labor zu erhalten, gibt es eine Anzahl von Management-Herausforderungen mit ihrer Kultur 6 verbunden. Der prominenteste von ihnen ist Larvenaufzucht, vor allem, wenn der Fisch zuerst beginnen zu füttern im Anschluss an Gasblase Inflation 7. Unter normalen, kontrollierten Bedingungen erfolgt diese Entwicklungs Ereignis bei ~ 5 Tage nach der Befruchtung (DPF), mit den folgenden 3-5 Tagen Wachstum besonders kritisch 7. Die zentrale technische Schwierigkeit in dieser Phase ist es, die ernährungsphysiologischen Anforderungen der ersten Fütterung Larven adäquat zu begegnen - Futterteile müssen von geeigneter Größe sein, Digesvereinbar, attraktiv, und auf einem nahezu kontinuierlichen Basis, ohne dass übermäßige Abfälle in Kultivierungstanks. Historisch gesehen hat sich in der Regel durch die Bereitstellung von zahlreichen kleinen Futtermengen, um die Fische in Tanks, zusammen mit Routine Wasseraustausch 8,9 erreicht. Während diese Methoden sind zu einem gewissen Grad erfolgreich, sind sie ineffizient, erfordern einen hohen Arbeitseinsatz, und kehren nur variabel und begrenzten Wachstumsraten und Überlebensrate 10. In der Natur, Zebrafisch-Larven ernähren sich vermutlich in der Wassersäule 11 reichlich kleines Geschenk Zooplankton. Aus diesem Grund larviculture Protokolle, die Live-Feeds, wie Paramecium, Rädertierchen und Artemia übernehmen in der Regel die effizienteste 7. Im Jahr 2010, Top und Co-Autoren gezeigt, dass es möglich war, Larven Zebrafisch in statischen, Brackwasser sowie Salzwasserrädertierchen für die ersten 5 Tage exogene Fütterung 12 wachsen. Dieser Ansatz, der nutzbares die natürliche hohe Produktivität der Rädertierchen Kulturen zu reichlich, sehr nahrhaft Beute belasten das Wasser nicht zu schaffen, die Renditen sehr hohe Larven Wachstum und Überleben mit niedrigen Arbeitseinsatz 12,13. In den letzten Jahren haben immer mehr Labors auf der ganzen Welt Variationen dieses Protokoll anzuwenden sind, und viele jetzt Kultivierung Rädertierchen in einer kontinuierlichen Weise in den Kindergarten-Systeme 14 zu unterstützen. In den vergangenen Jahren wurden Methoden für die beiden Rädertierchen / Zebrafisch polyculture und Rädertierchen Produktion verfeinert und verbessert, um mehr standardisiert und leicht skalierbar sein. Dieser Artikel enthält Schritt-für-Schritt-Anleitungen für 1) stetig und robust Rädertierchen Produktion und 2) die Einrichtung der Rädertierchen / Zebrafisch Polykultursystems verwendet werden, um ein robustes Wachstum der Fische für die ersten 5 Tage von exogenen Zuführung zu unterstützen.

<table><tbody><tr><td>Rotifer Culture Infrastructure</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 L Kulturgefäß</td><td>Aquaneering</td><td>Kundenspezifisches</td><td>Kulturgefäß aus Polycarbonat, konischer Boden, mit Ablassventil</td></tr><tr><td>5 Gallonen Culture Bucket Kit</td><td>Reed Mariculture</td><td>CCS Starter Kit</td><td>Kulturgefäß mit kleinem Volumen für kleine Einrichtungen</td></tr><tr><td>Starre durchsichtige Schläuche 1/2" AD, 36"</td><td>Pentair Aquatic Ecosystems</td><td>16025</td><td>Starre durchsichtige Schläuche für die Luftzufuhr</td></tr><tr><td>Mesh-Rohr</td><td>Pentair Aquatic Ecosystems</td><td>RT444X</td><td>Mesh-Rohrhalterung für Zahnseidenfilter</td></tr><tr><td>Rotifer Floss</td><td>Reed Mariculture</td><td>Rotifer Zahnseide 12" x 42"</td><td>Abscheider für Partikelabfälle</td></tr><tr><td>Peristaltische Dosier-Timer-Pumpe, 5 GPD</td><td>Grainger</td><td>38M003&nbsp;</td><td>Dosierpumpe mit Zeitschaltuhr zum Dosieren von Futter an Rädertierchen</td></tr><tr><td>Peristaltische Dosier-Timer-Pumpe, 1-100 mL/h (für kleinere Kulturen)</td><td>Coral Vue</td><td>Artikelnummer: IC-LQD-DSR</td><td>Dosierpumpe mit Timer zum Dosieren von Futtermitteln an Rädertierchen</td></tr><tr><td>Silikonschläuche&nbsp;</td><td>Cole Parmer</td><td></td><td>Schlauch für die Algenabgabe an Rädertierchenbehälter</td></tr><tr><td>Starre durchsichtige Schläuche " O.D.,36"</td><td>Pentair Aquatic Ecosystems</td><td>16025</td><td>Starre durchsichtige Schläuche für die Luftzufuhr zu Algenpaste</td></tr><tr><td>Starre durchsichtige Schläuche AD, 36"</td><td>Pentair Aquatic Ecosystems</td><td>16025</td><td>Starre durchsichtige Schläuche für die Abgabe von Algen</td></tr><tr><td>Rädertierchen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lebende Rädertierchen Brachionus plicatilis Typ L</td><td>Schilf-Marikultur</td><td>Typ L 5 Millionen</td><td>Rädertierchen-Stammkultur für den Systemstart</td></tr><tr><td>Rädertierfutter</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxymethylsulfonat</td><td>Reed Mariculture</td><td>ClorAm-X&reg; 1lb Wanne</td><td>Ammoniak-Reduzierer für Algenfuttermischung</td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat</td><td>Fisher Scientific</td><td>S25533B pH-Puffer</td><td>für Algenfuttermischung</td></tr><tr><td>Mikroalgenkonzentrat</td><td>Reed Mariculture</td><td>Rotigrow Plus&reg; 1 Liter Beutel</td><td>Ernährungsphysiologisch optimiertes Rädertierchenfutter</td></tr><tr><td>RG Complete</td><td>Reed Mariculture</td><td>RG Complete 6 oz Flasche</td><td>All-in-One-Futter auf Mikroalgenbasis für kleine Kulturen</td></tr><tr><td>Water Preparation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Reef Crystals Reef Salt</td><td>That Fish Place</td><td>198210</td><td>Salz zur Herstellung von Kulturwasser (HINWEIS: Dieser Artikel ist nur ein Beispiel; es können alle schadstofffreien Salzformulierungen verwendet werden).&nbsp;</td></tr><tr><td>Refraktometer</td><td>Pentair Aquatic Ecosystems</td><td>SR6</td><td>zur Messung des Salzgehalts</td></tr><tr><td>Rotifer Culture Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plankton Collectors 12" Durchmesser, 53 Mikrometer</td><td>Pentair Aquatic Ecosystems</td><td>BBPC20</td><td>Maschensieb zum Sammeln von Rädertierchen</td></tr><tr><td>Scrub</td><td>Pads Pentair Aquatic Ecosystems</td><td>SCR-58</td><td>Scheuerpad zum Reinigen des Innenraums von Kulturgefäßen</td></tr><tr><td>Scrub Brush Bucket</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Grainger Supply&nbsp;</td><td>43Y530</td><td>Messlöffel zum Mischen von Kulturwasser</td></tr><tr><td>Brutglas</td><td>Pentair Aquatic Ecosystems</td><td>J30</td><td>Lagerung von Algenfuttermischung</td></tr><tr><td>Lugol' Lösung, verdünnt</td><td>Fisher Scientific</td><td>S99481</td><td>Mittel zur Immobilisierung von lebenden Rädertierchen zum Zählen</td></tr><tr><td>Sedgewick-Rafter Planktonzählobjektträger mit Gitter&nbsp;</td><td>Pentair Aquatic Eco-Systems</td><td>M415</td><td>Zählen von Rädertierchen</td></tr><tr><td>Sonstiges</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Teesieb</td><td>Kitchenworks</td><td>971972</td><td>Wird zum Sammeln von Zebrafischembryonen nach dem Laichen verwendet</td></tr></tbody></table>

die vollständige und aktualisierte &quot;rädertier polyculture-methode&quot; für die aufzucht erste fütterung zebrafisch

The Complete and Updated "Rotifer Polyculture Method" for Rearing First Feeding Zebrafish

Der Zebrafisch (Danio rerio) ist ein Modellorganismus von zunehmender Bedeutung in vielen Bereichen der Wissenschaft. Einer der anspruchsvollsten technischen Aspekte bei der Kultivierung dieser Art im Labor ist die Aufzucht von zuerst fressenden Larven bis zum Jungstadium mit hohen Wachstums- und Überlebensraten. Die zentrale Managementherausforderung dieser Entwicklungsphase besteht darin, den Fischen nahezu kontinuierlich hochnahrhafte Futtermittel zu liefern, ohne die Wasserqualität zu beeinträchtigen. Da Zebrafischlarven gut daran angepasst sind, sich von kleinem Zooplankton in der Wassersäule zu ernähren, sind lebende Beutetiere wie brachionide Rädertierchen, Artemia und Pantoffeltierchen weithin als Futtermittel der Wahl anerkannt, zumindest bis die Fische das Jugendstadium erreichen und in der Lage sind, sich effizient von verarbeitetem Futter zu ernähren. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, bei der frisch geschlüpfte Zebrafischlarven zusammen mit lebenden Salzwasser-Rädertierchen (Brachionus plicatilis) im selben System gezüchtet werden. Dieser Polykulturansatz bietet den Fischen eine nährstoffreiche Lebendfutterquelle "auf Abruf", ohne chemische Abfälle in einem Umfang zu produzieren, der sonst die Leistung beeinträchtigen würde. Da das System sowohl die natürliche hohe Produktivität der Rädertierchen als auch die Verhaltenspräferenzen der Fische nutzt, ist der Arbeitsaufwand für die Wartung gering. Das folgende Protokoll beschreibt ein aktualisiertes, schrittweises Verfahren, das die Produktion von Rädertierchen (skalierbar auf jedes gewünschte Niveau) für den Einsatz in einer Polykultur von Zebrafischlarven und Rädertierchen umfasst, die die maximale Leistung in den ersten 5 Tagen der exogenen Fütterung fördert.

Die hier beschriebene kontinuierliche Rädertierchen Kultursystem ist dynamisch, und es ist normal, Rädertierchen Nummern zu einem geringen Teil im Laufe der Zeit schwanken, wenn Variationen in der täglichen Fütterung und Ernteraten. Die Bevölkerung der Rädertierchen in einem der aktiven Kulturen in den Aquakulturanlagen an der Boston-Kinderklinik, in der oben beschriebenen Weise gehalten wurde, wurde für 30 Tage (Abbildung 3) überwacht. Die Durchschnittskulturdichte in d...

Larven von Zebrafischen sind daran angepasst, sich von Zooplankton zu ernähren. Es ist möglich, diese natürliche Eigenschaft im Labor zu nutzen, indem man zuerst Fische füttert, die im selben System mit lebenden Salzwasser-Rädertierchen gefüttert werden. Diese "Polykultur"-Strategie fördert ein hohes Wachstum und Überleben bei minimaler Arbeit und Störung der Larven.

Die vollständige und aktualisierte &quot;Rädertier Polyculture-Methode&quot; für die Aufzucht Erste Fütterung Zebrafisch

The zebrafish (Danio rerio) is a model organism of increasing importance in many fields of science.  One of the most demanding technical aspects of ...

Das übergeordnete Ziel der Rädertierchen-Polykultur-Methode ist es, die natürliche Produktivität und die biologischen Eigenschaften von Salzwasser-Rädertierchen zu nutzen, um eine Umgebung zu schaffen, die ein schnelles Wachstum und das maximale Überleben der zuerst fressenden Zebrafischlarven fördert. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie den Zeit- und Platzaufwand für die erfolgreiche Aufzucht einer großen Anzahl von Zebrafischlarven für den Einsatz in Forschungsexperimenten drastisch reduziert. Beginnen Sie mit der Wartung der Rädertierchenkultur, indem Sie das Feedout-Kulturgefäß (FCV) zu 90 Prozent mit sauberem, entchlortem Frischwasser füllen, das mit 10 Gramm Aquariensalz pro Liter dosiert ist.Stellen Sie sicher, dass das Wasser gründlich gemischt ist und dass sich das gesamte Salz vollständig aufgelöst hat. Stellen Sie dann den Luftstrom in das Gefäß ein, so dass es ein rollendes Kochen beibehält. Messen Sie den Salzgehalt der Flüssigkeit mit einem Refraktometer.Nehmen Sie als Nächstes eine Probe von den Rädertierchen im Kulturgefäß oder CV.Stellen Sie sicher, dass die Kultur gut vermischt ist. Entnehmen Sie dann drei zwei bis drei Milliliter große Proben mit einer Transferpipette aus verschiedenen Teilen der Kultur und kombinieren Sie die Proben in einem Röhrchen. Geben Sie ein bis zwei Milliliter der kombinierten Probe in eine Petrischale.Visualisieren Sie die Probe unter einem Präpariermikroskop und überprüfen Sie die Qualität der Kultur. Geben Sie 100 Mikroliter 50-prozentige Lugolsche Jodlösung in die Probe, um die Rädertierchen zu immobilisieren und zu zählen. Entnehmen Sie sofort eine zwei Milliliter große Teilprobe mit einer Kunststoffpipette und geben Sie einen Milliliter in einen Sedgewick Rafter Zählobjektträger.Zählen Sie mit dem Präpariermikroskop so viel Objektträgerfläche wie nötig, um bis zu 100 intakte Rädertierchen und die Gesamtzahl der an den Rädertierchen befestigten Eier zu zählen. Berechnen Sie dann die Anzahl der Rädertierchen pro Milliliter für die spätere Verwendung. Leiten Sie die Ernte ein, indem Sie die Luftzufuhr und den Zahnseidefilter entfernen.Öffnen Sie langsam das Ventil an der Unterseite des CV und lassen Sie das Wasser sanft in einen Planktonsammler mit einem 53-Mikron-Maschensieb fließen. Sammeln Sie das Wasser, das aus dem Boden des Auffangbehälters fließt, nachdem es in einen Eimer gefiltert oder abgelassen wurde. Füllen Sie anschließend eine Flasche mit 10 bis 15 Gramm sauberem Salzwasser pro Liter.Drehen Sie das Sieb über das FCV und waschen Sie die Rädertierchen mit einem sanften Strahl Salzwasser in das FCV. Starten Sie den programmierbaren Dosiertimer oder PMT, um den FCV mit Futter zu versorgen. Schrubben Sie dann die gesamte Innenseite des CV mit einem sauberen Scheuerpad.Stellen Sie eine neue Mischung mit 15 Gramm pro Liter in einem Fünf-Gallonen-Eimer her, um das bei der Ernte verlorene Wasservolumen zu ersetzen. Rühren Sie die Lösung kräftig um, bis sich die Mischung vollständig aufgelöst hat. Geben Sie dann die Lösung in den CV.Spülen Sie anschließend den Zahnseidefilter mit einem Hochdruckspray aus.Wenn der Zahnseidefilter frei von Schmutz ist, setzen Sie ihn wieder in den CV ein.Passen Sie die Zuführmengen der Algen an, die an den CV abgegeben werden, indem Sie die Dauer jedes Dosierungsereignisses ändern. Wiederholen Sie den Vorgang nach 24 Stunden und beginnen Sie mit der Ernte der im FCV verbleibenden Rädertierchen. Konzentrieren Sie die Rädertierchen in zwei Litern frischem, sauberem, entchlortem Wasser mit fünf Gramm Salz pro Liter.Diese können bei vier Grad Celsius als Reservevorrat gelagert oder zur Fütterung späterer Fischstadien verwendet werden, die über das in diesem Protokoll beschriebene Maß hinausgehen. Sammle Zebrafischembryonen von einem Laichereignis, indem du die abgelesenen Embryonen durch ein Teesieb gießt. Und dann vorsichtig mit sterilem Fischwasser aus einer Waschflasche in Petrischalen spülen.Sobald alle Embryonen entnommen sind, brüten Sie sie aus. Beginnen Sie die Polykulturphase, wenn mehr als 90 Prozent der geschlüpften Larven aktiv in der Wassersäule nach oben schwimmen. Geben Sie 500 Milliliter der Rädertierchenkultur direkt aus dem FCV in ein 3,5-Liter-Aufzuchtbecken.Gießen Sie dann die Larven vorsichtig aus einer Petrischale in das Aufzuchtbecken. Achten Sie darauf, dass keine Larven in der Schale verbleiben. Geben Sie 500 Milliliter sauberes, konditioniertes Fischwasser aus einer speziellen Wasserquelle in das Aquarium bis zu einem Endvolumen von einem Liter und einem Endsalzgehalt von 5 Gramm pro Liter.Beobachten Sie das Polykulturbecken mindestens einmal täglich, um sicherzustellen, dass die Rädertierchen und Fische vorhanden sind und wachsen. Vergewissern Sie sich, dass die Rädertierchen in der gesamten Wassersäule sichtbar sind. Achten Sie darauf, dass die Fische auch in der Wassersäule sichtbar sind und zwischen den Rädertierchen schwimmen.Es ist wichtig, den Status jedes Tanks täglich zu bewerten, um sicherzustellen, dass sie am Leben sind und mit Rädertierchen schwimmen, die für alle Fischlarven verfügbar sind. Wenn Sie sich vergewissert haben, dass die Rädertierchen und Fische wachsen, beginnen Sie mit dem normalen Wasserfluss durch das Tank. Platzieren Sie abschließend ein Sieb über der Ablassöffnung, um sicherzustellen, dass die Larven nicht aus dem Tank gespült werden.Die typische Leistung einer Rädertierchenkultur wurde über einen Zeitraum von 30 Tagen überwacht und ergab eine mittlere Kulturdichte von 932 Rädertierchen pro Milliliter. Und maximal 1.330 Rädertierchen pro Milliliter. Die Rädertierchenpopulation in einem Polykulturbecken mit Zebrafischen hat eine mittlere Rädertierchendichte von 589,4 Rädertierchen pro Milliliter.Der Mindestwert von 481 Rädertierchen pro Milliliter ist 10-mal besser als in bisher veröffentlichten Arbeiten. Der Zebrafisch zeigte über den Zeitraum von fünf Tagen ein stetiges Wachstum von einer durchschnittlichen Gesamtlänge von 3,9 Millimetern auf 5,4 Millimeter. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Rädertierchen für die Verwendung in einem Polykultursystem kultiviert, das entwickelt wurde, um die Ernährungsbedürfnisse von Zebrafischen zu erfüllen, die zum ersten Mal gefüttert werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Dieses Protokoll beschreibt die regelmäßige Wartung und Pflege, um optimale Bedingungen für die Zebrafisch Haltung beizubehalten. Das Video veranschaulicht das Protokoll, für die Systemwartung, regelmäßige Haltung, Fütterung, Zucht und Aufzucht von Zebrafisch-Larven.

Regelmäßige Pflege und Wartung eines Zebrafisch (<em&gt; Danio rerio</em&gt;) Labor: Eine Einführung

Eine Zebrafischanlage, die für die Zucht und In-vivo-Forschung geeignet ist, wird auf einfache und erschwingliche Weise gebaut. Der Wartungsaufwand ist minimal. Diese Einrichtung ist ideal für studentisches Engagement und unabhängige Forschung.

Bau eines erschwinglichen und einfach zu bauen Zebrafisch Einrichtung

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Zebrafisch wurden vor kurzem als in Vivo Modellsystem verwendet, um DNA-Replikation Timing während der Entwicklung zu studieren. Hier wird detailliert die Protokolle für die Verwendung von Zebrafisch-Embryonen Profil Replikation Timing. Dieses Protokoll kann leicht angepasst werden, um Replikation Timing in einzelnen Zelltypen, Mutanten, Krankheitsmodelle und andere Arten zu studieren.

DNA-Replikation Timing mit Zebrafisch als ein In Vivo Modell-System-Profiling

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Lernen Sie die Rotifer-Polyculture-Methode zur effizienten Aufzucht von Zebrafischlarven mit Salzwasser-Rotatorien. Diese Technik maximiert Überlebensraten und reduziert Zeit sowie Platzbedarf erheblich.

Die vollständige und aktualisierte "Rädertier Polyculture-Methode" für die Aufzucht Erste Fütterung Zebrafisch

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