Urinausscheidende Fläche Infektion in eine kleine Tiermodell: transurethrale Katheterisierung von männlichen und weiblichen Mäusen

Das übergeordnete Ziel dieses experimentellen Ansatzes ist es, die Immunantwort auf Harnwegsinfektionen zu untersuchen und einen direkten Vergleich zwischen männlichen und weiblichen Tieren zu verhindern. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen der Schleimhautimmunologie zu beantworten, die sich darauf beziehen, wie Männer und Frauen auf Harnwegsinfektionen reagieren. Der Hauptvorteil besteht darin, dass die Infektion über die natürliche Wurzel etabliert wird.

Die Idee zu dieser Methode hatten wir erst, nachdem wir festgestellt hatten, wie oft behauptet wird, dass das Anlegen der Blase bei den männlichen Mäusen unmöglich ist. Obwohl diese Methode Einblicke in Harnwegsinfektionen gibt, kann sie auch auf andere Krankheitsstudien wie Blasenkrebs angewendet werden. Bereiten Sie zunächst für jede Gruppe von Mäusen, die infiziert werden sollen, eine Kanüle für den intravenösen Zugang bei Kindern vor.

Entfernen Sie mit dem eingebauten Federmechanismus jede Kanüle von ihrer Nadel gemäß den Anweisungen des Herstellers. Entsorgen Sie die Nadeln und bewahren Sie nur die intravenöse Kanüle aus Kunststoff auf. Sterilisieren Sie die Katheter in einer Laminar-Flow-Haube für einen UV-Zyklus von ca. 25 bis 30 Minuten.

Nach der Übernachtkultur von uropathogenen E. coli (UPEC) gemäß dem Textprotokoll wird die Bakteriensuspension in einer Tischmikrozentrifuge bei 17.000 g für eine Minute geschleudert und das resultierende Bakterienpellet bei zwei mal 10 bis zur achten KBE pro Milliliter in PBS resuspendiert. Verdünnen Sie nacheinander ein Aliquot der Suspension und legen Sie es gegebenenfalls mit Antibiotika auf den LB-Agar, um das genaue Inokulum für jede Infektion zu bestimmen. Ziehen Sie das bakterielle Inokulum in eine Ein-Milliliter-Spritze und befestigen Sie den Katheter am Ende der Spritze.

Klopfen Sie auf die Spritze, um Luft zu entfernen, und drücken Sie den Kolben, um den toten Luftraum im Katheter zu füllen, bevor Sie mit der Instillation beginnen. Nachdem Sie eine weibliche Maus nach einem genehmigten Protokoll betäubt haben, legen Sie das Tier in Rückenlage und üben Sie mittleren Druck auf den Unterbauch aus, um die Blase vom Urin zu entleeren. Volle Blasen fühlen sich unter der Haut, zwischen den Beckenkämmen, wie eine Erbse an.

Wenn die Blase leer ist, legen Sie mit der nicht dominanten Hand den Daumen auf den Schwanz und einen Finger derselben Hand auf den Bauch der Maus und üben Sie sanften Druck in entgegengesetzte Richtungen aus, um die Maus fest an Ort und Stelle zu halten. Platzieren Sie anschließend die Spitze des Katheters senkrecht zur Maus an der Harnröhrenöffnung und schieben Sie den Katheter dann mit leichtem Druck in die Harnröhre, bis die Nabe auf die Harnröhrenöffnung trifft, während Sie gleichzeitig die Spritze so absenken, dass sie parallel zur Arbeitsfläche ist. Sobald der Katheter an Ort und Stelle ist, ziehen Sie mit einem Finger der nicht dominanten Hand, die auf dem Bauch der Maus ruht, die Bauchhaut sehr sanft in Richtung des Mauskopfes.

Beachten Sie, dass sich die Harnröhrenöffnung nicht bewegt. Wenn sich der Katheter jedoch in der Vagina befindet, bewegt sich das Gewebe nach oben und weg vom Katheter. Geben Sie mit der Nabe des Katheters gegen die Harnröhrenöffnung langsam 15 Mikroliter des bakteriellen Inokulums ab.

Eine langsame Installationsrate minimiert den vesikoureteralen Rückfluss in die Niere. Entfernen Sie langsam den Katheter, um ein Auslaufen zu verhindern. Setzen Sie das Tier dann in Rückenlage in seinen Käfig.

Um männliche Mäuse zu impfen, platzieren Sie zwei Daumenzangen kranial und kaudal an den äußeren Genitalien der Maus. Ziehe die Vorhaut zurück, um den Penis der Drüse vollständig freizulegen. Sobald der Penis nach außen positioniert ist, lassen Sie die Daumenzange los.

Positionieren Sie die Pinzette neu, um den hervorstehenden Penis senkrecht zum Tier zu stabilisieren, und halten Sie das Organ sanft, aber straff. Führen Sie dann den Katheter vorsichtig durch die kleine Öffnung in der Spitze des Harnröhrengangs ein und führen Sie ihn mit einer Pinzette sanft in den Penis, um die Spannung sanft aufrechtzuerhalten. Sobald die Nabe des Katheters auf die Spitze des Penis trifft, geben Sie sehr langsam 50 Mikroliter des Inokulums ab, während Sie die Position des Penis beibehalten.

Notieren Sie die Qualität der Instillation gemäß einem vorgegebenen Instillationsqualitätsfaktor, wie z. B. dem hier gezeigten. Ziehen Sie den Katheter langsam über fünf Sekunden zurück, um ein Auslaufen des Inokulums zu verhindern. Platzieren Sie die Maus in Rückenlage in ihrem Käfig.

Das Tier sollte sich 30 bis 45 Minuten nach der Verabreichung des Anästhetikums zu erholen beginnen. Nachdem Sie Mäuse nach einem genehmigten Protokoll geopfert haben, verwenden Sie 70%Epinal, um den Bauch gründlich zu befeuchten, um die Kontamination durch das Fell zu minimieren. Machen Sie mit einer Schere einen zwei Zentimeter langen Schnitt durch das untere Drittel des Bauches der Maus und entfernen Sie aseptisch die Blase und alle anderen gewünschten Organe.

Übertragen Sie die Organe in fünf Milliliter Polypropylen-Schnappverschlussröhrchen, die einen Milliliter steriles PBS enthalten, und halten Sie alle Proben auf Eis. Mit einem Handhomogenisator homogenisieren Sie die Organe, bis fast kein festes Gewebe mehr übrig ist. Entsorgen Sie glänzendes, beige-weißes Fettgewebe, das sich nicht gut homogenisieren lässt.

Verwenden Sie dann Epinal, gefolgt von PBS, um den Homogenisator zwischen den einzelnen Versuchs- oder Organgruppen zu waschen. Nach der Herstellung von seriellen Verdünnungen der homogenisierten Organsuspension werden die Plattenverdünnungen auf LB-Agarplatten, gegebenenfalls mit Antibiotika, durchgeführt und über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubiert. Um eine Durchflusszytometrie an Blasengewebe durchzuführen, verwenden Sie nach der Isolierung der Blase, wie zuvor in diesem Video gezeigt, eine Schere, um das Gewebe gut zu zerkleinern.

Geben Sie eine gehackte Blase pro Röhrchen mit Verdauungspuffer hinzu. Schütteln Sie dann das Röhrchen, um das gehackte Gewebe im Verdauungspuffer zu waschen, und halten Sie es auf Eis, bis alle Blasen präpariert und zerkleinert sind. Inkubieren Sie die gehackte Blase bei 37 Grad Celsius für 60 bis 75 Minuten und schütteln Sie sie alle 15 Minuten fünf Sekunden lang kräftig mit der Hand.

Wenn das Gewebe ein glasiges, transparentes Aussehen hat, das an nasses Seidenpapier erinnert, ist die Verdauung abgeschlossen. Inaktivieren Sie die Verdauungsenzyme durch Zugabe von zwei bis drei Millilitern eiskaltem Durchflusszytometrie-Puffer und mischen Sie vorsichtig. Legen Sie dann die Röhren auf Eis.

Um eine einzellige Suspension zu gewährleisten und jegliches Bindegewebe zu entfernen, leiten Sie den Inhalt des Röhrchens durch einen 100-Mikrometer-Filter, der in einem konischen 15-Milliliter-Röhrchen platziert ist. Drücken Sie dann mit dem Ende eines Spritzenkolbens vorsichtig das restliche Gewebe durch den Filter. Waschen Sie den Filter mit weiteren zwei Millilitern Durchflusszytometrie-Puffer und bewahren Sie die Proben auf Eis auf.

Anschließend werden die Proben durch Zentrifugation bei 200 mal g und vier Grad Celsius sieben Minuten lang gewaschen. Die Pellets werden in 100 Mikrolitern Durchflusszytometriepuffer mit Fc-Block, verdünnt auf fünf Mikrogramm pro Milliliter, resuspendiert und auf eine runde 96-Well-Bodenplatte gegeben. Nach 10 bis 15 Minuten geben Sie 100 Mikroliter des gewünschten Antikörpercocktails in jede Probe.

Anschließend werden die Proben 30 bis 45 Minuten lang auf lichtgeschütztem Eis inkubiert. Waschen Sie die Proben durch Zentrifugation bei 200 mal g und vier Grad Celsius für sieben Minuten. Zum Schluss resuspendieren Sie die Zellpellets in 200 Mikrolitern Durchflusszytometriepuffer und leiten Sie die Proben durch ein 40-Mikrometer-Zellsieb auf einem Fünf-Milliliter-Polystyrolröhrchen, kurz bevor Sie auf einem Durchflusszytometer entnommen werden.

Diese Abbildung zeigt repräsentative Daten von Mäusen, die 24 Stunden lang infiziert waren. Die bakterielle Belastung war 24 Stunden nach der Infektion zwischen männlichen und weiblichen Mäusen gleich. Um festzustellen, ob sich der Verlust des Inokulums zum Zeitpunkt der Infektion auf die Etablierung der Infektion auswirkte, wurde jede Instillation auf einer Skala von eins bis fünf bewertet, wobei eine am optimalsten war.

Die bakterielle Besiedlung wurde 24 Stunden nach der Infektion festgestellt. Es wurden keine statistisch signifikanten Unterschiede zwischen den KBEs gefunden, die von Tieren mit unterschiedlichen Instillationswerten gewonnen wurden, die durch einen nichtparametrischen Kruskal-Wallis-Test bewertet wurden, bei dem der mittlere Rang jeder Säule mit dem mittleren Rang jeder anderen Säule verglichen und Mehrfachvergleiche mit einem Dunn-Test korrigiert wurden. Daraus kann geschlossen werden, dass suboptimale Instillationen, die zu einem erheblichen Austreten des bakteriellen Inokulums während der Infektion führen, die bakterielle Besiedlung nach 24 Stunden nicht signifikant beeinflussen.

Wichtig ist, dass die Häufigkeit suboptimaler Instillation mit der Praxis abnimmt. Während sich die Anzahl der CD45-positiven Immunzellen, die bei naiven Tieren vorhanden waren, zwischen weiblichen und männlichen Mäusen nicht unterschied, gab es eine statistisch signifikante Zunahme der Infiltration in die Blase infizierter weiblicher Mäuse. Bei der Katheterisierung ist es wichtig, langsame, sanfte Bewegungen zu verwenden.

Mit ihrer Entwicklung hat uns diese Technik geholfen, geschlechtsspezifische Unterschiede in der Immunität in der Blase von männlichen und weiblichen Tieren zu erforschen.