Die Montage und Anwendung der "Shear Ringe ': A Novel Endothelial Modell für Orbital, unidirektional und periodische Strömungs- und Scherspannung

Das übergeordnete Ziel dieses Modells ist es, eine einfache und kostengünstige Methode für In-vitro-Studien zur periodischen Flüssigkeitsströmung und Scherspannung an Endothelzellen zu entwickeln. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Endothelzellphysiologie zu beantworten. Zum Beispiel, wie sich periodische Scherung auf die Form, Struktur und Funktion von Endothelzellen auswirkt.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie ein einfach zusammengesetztes Gewebekulturgerät verwendet, das relativ große Oberflächen für die Bewertung zellulärer Reaktionen bietet. Dieses Verfahren wird von Herrn Luke White, einem Medizinstudenten in meinem Labor, vorgeführt. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie mit Hilfe der Präsentationssoftware eine Schabel-Konstruktionsschablone mit einem Außenkantenprofil von 150 Millimetern und einem Innendurchmesser von 100 Millimetern erstellen, die in der Mitte des 150-Millimeter-Kreises platziert wird.

Drucken Sie die Vorlage auf ein weißes A4-Blatt Papier. Unter einem Abzug mit ausreichender Belüftung und mit Handschuhen pipettieren Sie 10 Millimeter Methylenchlorid in eine 150 Millimeter große Petrischale aus Glas. Es ist wichtig, dass die Schale aus Glas besteht, da Methylenchlorid die meisten Kunststoffe auflöst.

Richten Sie eine 150 Millimeter große Petrischale aus Kunststoff auf der äußeren Scherschablone aus. Bohren Sie mit einem rotierenden Werkzeug ein drei 3-Millimeter-Loch in die Mitte einer 100-Millimeter-Schale. Entfernen Sie alle Kunststoffspäne, die bei der Bohrung entstanden sind.

Während Sie die 100-Millimeter-Petrischale mit einer behandschuhten Hand halten, drehen Sie die Oberkante der Schale um und tauchen Sie sie für etwa drei Sekunden in das Methylenchloridbecken. Lassen Sie überschüssiges Methylenchlorid von der 100-Millimeter-Schale abtropfen und übertragen Sie dann den benetzten Schalenrand schnell nach unten auf die Mitte der 150-Millimeter-Schale. Richten Sie die 100-Millimeter-Schüssel vorsichtig auf der markierten Schablone aus.

Drehen Sie die 100-Millimeter-Schüssel einige Male vorsichtig im Uhrzeigersinn und gegen den Uhrzeigersinn, um eine gute Haftung auf der 150-Millimeter-Schüssel zu gewährleisten. Sobald das Methylenchlorid getrocknet ist, drehen Sie die neu gebundenen Petrischalen um und inspizieren Sie sorgfältig die Kontaktpunkte. Wenn sich keine dichte Versiegelung gebildet hat, injizieren Sie 0,5 Milliliter Methylenchlorid mit einer Transferpipette durch das 3-Millimeter-Loch

Nimm die Schale und drehe sie vorsichtig, damit Methylenchlorid den Rand erreichen kann. Nachdem Sie sichergestellt haben, dass sich eine dichte Abdichtung zwischen den beiden Petrischalen gebildet hat, versiegeln Sie das Loch in der 100-Millimeter-Schale, indem Sie eine 3-Millimeter-Raupe Silikonkautschuk-Dichtmittel auftragen. Schneiden Sie mit einem rotierenden Werkzeug, das mit einem flachen Schneidkopf ausgestattet ist, den oberen 3 Zentimeter großen Teil eines 15 Millimeter großen Conocole-Polystyrol-Gewebekulturröhrchens ab und lassen Sie mindestens einen Zentimeter des Röhrchens unter der Kappe.

Verwenden Sie die flache Seite des Schneidkopfes, um die Kante des geschnittenen Rohrs glatt und flach zu polieren. Entfernen Sie alle Kunststoffspäne, die beim Schleifen entstanden sind. Mit einem Marker das abgeschnittene 15-Milliliter-Concole-Röhrchen etwa 0,5 Zentimeter vom Rand der Schale entfernt auf den Deckel der 150-Millimeter-Schale aufzeichnen.

Bohren Sie ein Loch in den gezeichneten Kreis und lassen Sie einen Rand von etwa ein bis zwei Millimetern vom Rand des Kreises entfernt. Legen Sie die abgeschnittene conocole Rohrspitze über das Bohrloch. Tragen Sie mit einer Transferpitette etwa einen Viertelmilliliter oder 250 Mikroliter Methylenchlorid auf die abgeschnittenen Kanten des Conocole-Rohrs auf, um das Conocole-Rohr an den 150-Millimeter-Deckel zu binden.

Versiegeln Sie abschließend den 150-Millimeter-Deckel auf der 150-Millimeter-Schale, indem Sie eine ein Millimeter dicke Raupe aus Silikonkautschuk-Dichtstoff um den Innenrand der oberen Petrischale auftragen. Es wird ein Schema eines zusammengebauten Abreißrings gezeigt. Das Blau stellt die Fläche der plattierten Endothelzellen dar.

Die äußeren und inneren roten Pfeile zeigen die Orbitalbewegung des Scherrings und des Mediums im Inneren des Scherrings an, wenn es auf einem Orbitalschüttler platziert wird. Bereiten Sie sich auf die Sterilisation vor, indem Sie etwa 10 Millimeter PBS durch den 15-Milliliter-Conocole-Schlauchanschluss in den neu gebildeten Scherring pipettieren. Schwenken Sie herum, um Schmutz im Inneren des Scherrings zu entfernen.

Entfernen Sie das PBS mit einer Pasteur-Pipette und einem Vakuumsauger. Wiederholen Sie die PBS-Wäsche, bis alle Rückstände entfernt sind. Zur Sterilisation des Scherrings wird eine Kombination aus einer 70%igen Ethanolspülung und UV-Bestrahlung verwendet.

Schrauben Sie die belüftete Kappe ab, pipettieren Sie etwa 10 Milliliter 70%iges Ethanol durch die Zugangsöffnung und schrauben Sie die Kappe wieder auf. Drehen und wenden Sie den Abziehring mehrmals, um sicherzustellen, dass die Innenseite des Abziehrings gründlich gewaschen wird. Unter einer Gewebekulturhaube das überschüssige 70%ige Ethanol ansaugen.

Sprühen Sie mit einer Sprühflasche die Zugangsöffnung und den Deckel gründlich mit 70 % Ethanol ein. Legen Sie anschließend den Scherring und die Kappe unter UV-Strahlung in die Gewebekulturhaube, bis sie vollständig getrocknet sind. Sobald der Scherring trocken ist, schrauben Sie die Kappe wieder auf.

Lagern Sie die sterilisierten Scherringe bei Raumtemperatur, bis sie für die Zellkulturbeschichtung verwendet werden. Zur Vorbereitung einer Scherspannungsstudie werden zunächst Endothelzellen in sterilisierten Scherringen nach dem Standard-Zellkulturprotokoll plattiert. Lassen Sie die Kultur Konfluenz erreichen, bevor Sie mit den Flow-Studien beginnen.

Wenn die Zellen die Konfluenz erreicht haben, platzieren Sie die experimentellen Scherringe auf einem Orbitalschüttler, der auf dem unteren Regal im Inkubator platziert wird, um die Spannung und Vibrationen des Regals zu minimieren. Platzieren Sie die Scherringe der statischen Kontrollgruppe im selben Inkubator. Lassen Sie die Scherringe für die gewünschte Dauer der Scherspannungsanwendung auf dem Schüttler.

Nachdem die Zellschichten für die gewünschte Zeit der Scherung ausgesetzt waren, entfernen Sie die Scherringe aus dem Inkubator. Ziehen Sie den Scherringdeckel ab und entnehmen Sie die Zellen und/oder Medien für die gewünschte Endpunktanalyse. Beachten Sie, dass die Untersucher nach dem Öffnen der Scherringe mit verschiedenen Methoden Zellen und Medium für die Analyse entnehmen können.

Dargestellt sind repräsentative Ergebnisse des Auftretens von humanen CMEC D3 Brain Endothelzell-Monoschichten in Scherringen nach 48 Stunden periodischer Flüssigkeitsscherung oder statischer Exposition: Es wurde beobachtet, dass die Ausrichtung der Kultur nicht immer parallel zu der durch die Pfeile angezeigten Strömungsrichtung verläuft. Einige Reaktionen auf periodische Scherung sind in Monoschichten von retinalen mikrovaskulären Endothelzellen der Ratte zu sehen. 72 Stunden periodische Flüssigkeitsscherung in den Scherringen führten zu einer signifikanten Verringerung des Adhäsionsmoleküls der Thrombozyten-Endothelzellen im Vergleich zur Beta-Aktin-Beladungskontrolle.

Einmal gemeistert, können mehrere Scherringe in etwa drei Stunden konstruiert werden, wenn es richtig ausgeführt wird. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die innere Schale sorgfältig mit der äußeren Schale auszurichten, da sich zwischen ihnen eine dichte Abdichtung bildet. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Scherringe als einfache Methode zur Durchführung von In-vitro-Studien zur periodischen Flüssigkeitsströmung und Scherspannung an Endothelzellen konstruiert und verwendet. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Methylenchlorid gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen, wie z. B. das Arbeiten unter einem Abzug, immer getroffen werden sollten, wenn Sie Schritte ausführen, die dies erfordern.