Name: Die Montage und Anwendung der Shear Ringe : A Novel Endothelial Modell für Orbital, unidirektional und periodische Strömungs- und Scherspannung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Erfahren Sie die Montage und Anwendung von Shear Rings zur Untersuchung endothelialer Zellen unter periodischer Scherströmung. Diese kostengünstige Methode ermöglicht die Analyse zellulärer Reaktionen auf mechanische Reize.

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Die Autoren möchten die Hilfe von Herrn Christopher Nguyen, Aaron Hunter und der Shreveport Jumpstart, SMART und Biostart Trainingsprogramme sowie die Centenary College of Louisiana Abteilung für Biophysik, Shreveport, LA anzuerkennen.

1. Aufbau von 150 mm Durchmesser Shear Ringe (Abbildung 1) HINWEIS: Shear Ringe können durch Variieren der äußeren und inneren Petrischale Größen vielen verschiedenen Abmessungen zu schaffen konstruiert werden, was zu Vorrichtungen mit unterschiedlichen Gesamtoberflächen, Zellausbeuten und entwickelten Bereiche der Scherkräfte. Dieser Bericht beschreibt eine 150 - mm - Schale mit einer inneren 100 - mm - Schale kombiniert für eine Gesamtoberfläche von 98 cm 2 (Abbildung 2). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/54632/54632fig1.jpg" /> Abbildung 1. Scherringanordnung. Der obere Teil der Figur zeigt einen teilweise montierten Scherring. Injizieren Sie 0,5 ml Methylenchlorid durch die 3 mm Loch mit einer Transferpipette, wenn eine dichte Abdichtung hat sich zwischen den inneren und äußeren Gerichte nicht vollständig ausgebildet. Der Scherring wird durch Aufbringen einer 1 mm dicken Wulst aus Silikonkautschuk-Kleber um den inneren edg dicht verschlossene des oberen Scherring. Der untere Teil der Figur zeigt den montierten Scherring. Das Blau steht für den Bereich von plattierten Endothelzellen. Die äußeren und inneren roten Pfeile , um die Orbitalbewegung des Scherring und Medien innerhalb des Scherring zeigen , wenn sie auf einem Schüttler platziert. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54632/54632fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54632/54632fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/54632/54632fig2.jpg" /> Abbildung 2. Oberflächenmessungen für einen 150 mm Scherring (nicht maßstäblich gezeichnet). Top - Panel zeigt zentrifugale Verschiebung der Flüssigkeit in Richtung Außenring in Reaktion auf Orbitaldrehung. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54632/54632fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54632/54632fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <ol><li> Erstellen Sie eine Scherring Konstruktionsvorlage durch ein Erzeugen150 mm Außenrandprofil in Präsentationssoftware mit einem 100 mm Innendurchmesser in der Mitte des Kreises 150 mm platziert. Drucken Sie die Vorlage auf ein Blatt A4 weißem Papier. </li><li> Pipettieren 10 ml Methylenchlorid (Dichlormethan) in eine 150 mm Petrischale aus Glas. Es ist wichtig, dass die Schale Glas und nicht Polystyrol (oder anderen Vinyl Kunststoff), wie Methylenchlorid, die meisten Kunststoffe solubilisiert und wird verwendet, hier Kunststoffteile zu verbinden. ACHTUNG: Verwenden Sie Handschuhe für alle Konstruktion mit ausreichender Belüftung Kapuze. Methylenchlorid ist ein Kontakt reizend und ist hepatotoxischer. </li><li> Richten Sie ein 150 mm Kunststoff-Petrischale auf die äußere Scherring Vorlage. </li><li> Bohren Sie ein 3 mm Loch in der Mitte einer 100-mm-Schale ein Drehwerkzeug. Entfernen Sie alle Kunststoff-Späne aus der Bohrung hergestellt. </li><li> Während mit einer behandschuhten Hand, invertieren und die obere Kante der 100 mm Petrischale aus dem vorherigen Schritt in den Pool von Methylenchlorid für etwa 3 Sekunden tauchen. </li><li> Transfer die &quot;angefeuchtet&quot; 100-mm-Schale Rand nach unten auf die Mitte einer 150-mm-Schale, sorgfältig Ausrichten der 100-mm-Schale auf die markierte Vorlage. Das Methylenchlorid wird die Kunststoff-Sicherung, die 100 mm und 150 mm-Schalen verbinden. Vorsichtig drehen, um die 100-mm-Schale im Uhrzeigersinn und gegen den Uhrzeigersinn ein paar Mal auf die 150-mm-Schale eine gute Haftung zu gewährleisten. HINWEIS: Achten Sie unbedingt auf die richtige Ausrichtung der inneren Schale in die Mitte der äußeren Schale zu gewährleisten. Exzentrischer Ausrichtung kann in Veränderungen der Scherspannung an verschiedenen Stellen in dem Scherring führen. Es ist darauf zu nicht Methylenchlorid ermöglichen versehentlich während der Platzierung der 100 mm-Schale auf die äußere Schienenabschnitt der 150 mm Petrischale tropfen. Dadurch wird der Kunststoff an der unteren Oberfläche schmelzen, wo Zellen wachsen, eine unebene Oberfläche zu schaffen, die Strömungsstörungen verursachen können. </li><li> Sobald das Methylenchlorid getrocknet ist, drehen die neu gebunden Petrischalen über und sorgfältig die Berührungspunkte inspizieren, um sicherzustellen,eine dichte Abdichtung wurde zwischen den beiden Petrischalen gebildet. </li><li> Wenn eine dichte Abdichtung nicht vollständig gebildet hat, injizieren 0,5 ml Methylenchlorid durch die 3 mm Loch mit einer Transferpipette. Suchen Sie sich die Schale und sanft drehen das Methylenchlorid zu ermöglichen, den Rand zu erreichen. HINWEIS: Wenn zu schnell gedreht wird, kann das Methylenchlorid in den äußeren Teil des 150-mm-Schale verschütten, um die Oberfläche zu verformen, wo Zellen wachsen und den Scherring ruinieren. Undichte Scherringe sind zu verwerfen. </li><li> Abdichtung um das Loch in der 100-mm-Schale durch eine 3 mm Wulst aus Silikongummi Dichtungsmittel aufgebracht wird. </li><li> Mit einem Drehwerkzeug mit einem flachen Schneidkopf ausgerüstet, schneiden Sie die Top-3 cm Teil eines konischen 15 ml Polystyrol-Gewebekulturrohr, so dass mindestens 1 cm des Rohres unter der Kappe. Polieren Sie die Kante des geschnittenen Rohr bis glatt und flach mit der flachen Seite des Schneidkopfes verwendet wird. Entfernen Sie alle Kunststoffspänen hergestellt durch Schleifen. </li><li> Verfolgen Sie die abgeschnitten 15 ml konischen Röhrchen auf dieDeckel des 150-mm-Schale mit einem Marker, von der Kante der Schale von etwa 0,5 cm entfernt. Bohren Sie ein Loch in der gezeichneten Kreis, eine Marge in etwa 1-2 mm vom Rand des Kreises zu verlassen. </li><li> Legen Sie das konische Rohr nach oben über das Bohrloch abgeschnitten. Verwendung einer Transferpipette gelten etwa 250 &amp; mgr; l Methylenchlorid zu den Kanten abgeschnitten des konischen Rohrs die konischen Rohr an dem Deckel 150 mm zu binden. </li><li> Verschließen Sie den 150 mm Deckel auf den 150-mm-Schale durch eine 1 mm dicke Raupe aus Silizium Gummidichtung um den inneren Rand der oberen Petrischale aufgebracht wird. </li></ol> 2. Sterilisation von Shear Ringe <ol><li> Pipette ca. 10 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung in den neu gebildeten Scherring durch den 15 ml konischen Röhrchen Port. Wirbeln um alle Ablagerungen im Inneren des Scherring zu entfernen. Entfernen Sie die phosphatgepufferte Salzlösung mit einer Pasteur-Pipette / Vakuum-Saugvorrichtung. </li><li> Wiederholen Sie den vorherigen Schritt, bis Schmutz entfernt wird. </li><li> Um Sterilize der Scherring, eine Kombination aus einer 70% igen Ethanolspülung mit UV-Bestrahlung. <ol><li> Lösen Sie die belüftete Kappe, pipettieren etwa 10 ml 70% igem Ethanol durch die Zugangsöffnung, und schrauben Sie den Deckel wieder. Drehen und Spiegeln die Scherring mehrfach über, um sicherzustellen, dass die Innenseite des Scherring wird gründlich gewaschen. </li><li> Unter einem Abzug Überschuss 70% Ethanol aspirieren aus. Mit einer Sprühflasche, Spray gründlich die Kappe und Zugangsport mit 70% Ethanol. </li><li> Setzen Sie den Scherring und Kappe unter UV-Strahlung in der Gewebekultur Haube, bis sie vollständig trocken. </li></ol></li><li> Nach dem Trocknen anschrauben und speichern sterilisierten Scherringe die Kappe wieder bei Raumtemperatur verwendet werden, bis in der Zellkultur-Beschichtung. </li></ol> 3. Schubspannung Studies <ol><li> Platte Endothelzellen in sterilisierte Scherringen nach dem Standard-Zellkulturprotokoll typischerweise unter Verwendung eines 1: 4 Aufteilungsverhältnis für transformierte endothelialen Zelllinien. HINWEIS: Ratte retinalen microVascular Endothelzellen wurden kommerziell erhalten. Das menschliche Gehirn-Endothelzellen (hCMEC / D3) Zellen wurden als großzügiges Geschenk von Dr. Pierre-Oliver Couraud (Inserm, Frankreich) zur Verfügung gestellt und wurden in kompletten endothelialen Basalmedium (EBM). </li><li> Lassen Kulturen Einmündung vor dem Beginn der Stromuntersuchungen zu erreichen. Verwenden von 30 ml Gewebekulturmedium (10% fötales Kälberserum, Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium mit 1% Penicillin / Streptomycin / Amphotericin). Ändern Zellkulturmedium alle 3 Tage und aufrechtzuerhalten Zellen bei 37 ° C mit 7,5% CO 2 und 92,5% Raumluft. </li><li> Setzen Sie den Schüttler im Inkubator. Hinweis: Kreisschüttler sind in der Regel schwer (&gt; 10 kg). Setzen Sie den Schüttler auf dem unteren Regal des Inkubators zu Regal Stress und Vibration minimieren. </li><li> Legen Sie die experimentellen Scherringe auf dem Schüttler. Setzen Sie statische Kontrollgruppe Scherringe im selben Inkubator. </li><li> Schätzen Sie die maximale Schubspannung innerhalb des shOhrring mit der Gleichung <img alt="Gleichung 1" src="/files/ftp_upload/54632/54632eq1.jpg" /> woher <img alt="Gleichung 2" src="/files/ftp_upload/54632/54632eq2.jpg" /> für die orbital shaker Dreh der Radius (in cm), <img alt="Gleichung 3" src="/files/ftp_upload/54632/54632eq3.jpg" /> ist die Viskosität des Mediums (in Poise), <img alt="Gleichung 4" src="/files/ftp_upload/54632/54632eq4.jpg" /> ist die Dichte des Mediums (in g / ml), und <img alt="Gleichung 5" src="/files/ftp_upload/54632/54632eq5.jpg" /> ist die Frequenz der Drehung (in Rotation / sec) 24. </li><li> Starten Sie die Dreheinstellung auf dem Schüttler auf die gewünschte Drehzahl (zB 90 Umdrehungen pro Minute), die Scherringe auf dem Schüttler für die gewünschte Dauer der Schubspannung Anwendung zu verlassen (zB 72 h). HINWEIS: Kreisschüttler Wärme erzeugen kann, so dass die Inkubatortemperatur zunächst überwacht werden sollten, um sicherzustellen, 37 ° C während der gesamten Dauer des Experiments beibehalten. Alternativ shören Ringe können in Klimakammern (zB modulare Inkubatorkammer) und dann in einem rotierenden Inkubator übertragen werden. </li><li> Nach Zellschichten wurden für die gewünschte Zeitdauer zu scheren ausgesetzt, Scherringe aus dem Inkubator entfernen. Ziehen Sie den Scherring Deckel ab und Abrufen von Zellen und / oder Medien für die gewünschten Endpunkt untersuchen Analysen (zB Western Blot, Fluoreszenz - aktivierte Zellsortierung, etc.) 25. </li></ol>

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J. Winny Yun hat ein Forschungsstipendium von der Annette Funicello Stiftung. J. Steven Alexander hat Forschungsunterstützung von der Abteilung für Neurologie, LSUHSC-S.

Der Aufbau des Systems Scherring zum Belichten Endothelzellen abzuscheren ist ein einfacher Ansatz Scherspannung Studien durchführen. Dennoch gibt es einige Schritte, die für den Erhalt der überlegenen Scherringe und bessere Ergebnisse kritisch sind. Eine vollständige Abdichtung sollte zwischen dem inneren und dem äußeren Ring zu verhindern Medien aus undichten gemacht werden, die im Widerspruch Scherspannung zwischen den Proben schaffen könnte. Wenn eine vollständige Abdichtung nicht durchgeführt wird, sollte eine mini...

Fluidscherspannung wurde gezeigt , dass endotheliale Genprogramme 1 modulieren - 5 durch Aktivierung von cis-regulatorischen Elemente 6, Histon - Acetyltransferase - Aktivität 7 und Schubspannungsantwortelemente (SSRE) 8. Stress beeinflusst endotheliale Beiträge zur Koagulation durch Modulation Gewebefaktor 9 und Gewebe - Plasminogen - Aktivator (tPA) 10 - Expression scheren. Schubspannung beeinflusst auch die Kontrolle der Angiogenese 11 und Gefäßumbau durch Regulierung PDGF-B - Synthese und Reaktions 8. Die endotheliale abgeleitetes vasoaktiven Mediatoren Adrenomedullin, Endothelin-1, Urotensin II und Relaxin werden auch durch Scherung 12 geregelt. Die Transkription von endothelialen Stickstoffmonoxid-Synthase Produktion und die Produktion von Stickoxid sind beide Scher abhängig 10. Scher steuert auch endothelial ICAM-1 - Expression 13. Strömungsinduzierten Scherspannung kann daher powerfully beeinflussen eine Vielzahl von endothelialen Antworten. Wichtig ist , dass jetzt vaskulären Pulsationen auch eine wichtige Rolle in der Pathophysiologie von sowohl normalen vaskulären Alterungs- und Formen von vaskulärer Demenz 14 und kann sogar dazu beitragen, anderen neurodegenerativen Erkrankungen, wie Multipler Sklerose 15 spielen scheinen. Venöse und arterielle endotheliale Zellen sind inhärent auf diverse hämodynamischen Strömungsmuster in vivo ausgesetzt ist , und viele verschiedene Phänotypen von Endothelzellen kann 16 gezeigt werden. In Abhängigkeit von der Größe und der Periodizität der Strömungs kann Wirkungen auf Endothelzellen umfassen Entzündungszellaktivierung und die Apoptose, die 17,18 Veränderungen in der Gen oder Protein - Expression widerspiegeln. Untersuchungen an endotheliale Zellantworten Phänomene abzuscheren daher durch die Schwierigkeiten kompliziert bleiben in vitro Modellen in der Herstellung , die ausreichend solchen Schermuster erzeugen. Viele verschiedene Experimental Protokolle wurden entwickelt Fluidscherbeanspruchung aufzubringen Zellmonolayern an Endothelzellen. Eines der am häufigsten verwendeten Systeme ist der Parallelplattenflusskammer, die innerhalb der Kammer 19 gleichmäßige laminare Strömung erzeugt - 21. Eine peristaltische Pumpe ist typischerweise verbunden periodischen Strömung zu erzeugen, die Eigenschaften Strömungs rekapitulieren kann typischerweise an verschiedenen Orten in vivo 22 gefunden. Ein weiteres gemeinsames Set-up verwendet die &quot;Kegel-Platte&quot; -Modell, in dem Schubspannung durch die Drehzahl des Kegels 23 bestimmt wird. Beide Systeme und andere Anordnungen, die ähnlich zu ihnen kann sehr mühsam sein, einzurichten und Komponenten erfordern, die relativ teuer und unzugänglich für viele Laboratorien sein kann. Eine andere wesentliche Einschränkung dieser aktuellen Modellen ist die relativ geringe Anzahl an Wiederholungs Studien, die gleichzeitig durchgeführt werden können, die jeweils mit einer relativ geringen Oberfläche. Dies erhöht die Zeit und co<html> mplexity solcher Ansätze. Daher ist es ein ideales Modell, das unidirektionale und periodische Scher induziert könnte sein, wo eine hohe Zahl von Studien Replikaten kann leicht auf, die jeweils mit einer relativ großen Oberfläche eingestellt werden. Darüber hinaus erfordern die oben genannten Modelle eine ziemlich anspruchsvolle Einrichtung, die für viele Anwender unerschwinglich teuer sein kann. Ein Modell, das Fluid-Scher Störungen unter Verwendung von basischen Labormaterialien produzieren kann möglicherweise mehrere Vorteile haben. Eine einfache und sehr wirtschaftliche Verfahren unidirektional, periodische Scherspannung des Auftragens beinhaltet die Platzierung von kreisförmigen Teller auf einem Kreisschüttler 24. Dieses Protokoll ist sehr einfach und kann bis zu erreichen, eine hohe Zahl von Studie repliziert, die jeweils mit einem relativ großen Oberflächenbereich skaliert werden, wie erforderlich. Jedoch sind in der Mitte der Schale befindlichen Zellen auf unterschiedliche Strömungsmuster als Zellen, die entlang des Umfangs freigelegt, gemischten zellulären phänotypischen Reaktion in der gleichen Schale ergibt. _content &quot;&gt; In diesem aktuellen Bericht beschreiben wir den Aufbau und die Verwendung von&quot; Scher Ringe &#39;, unser Modell für Stress unidirektional und periodische Scher zu schaffen. Der Entwurf für den Scherring effektiv Grenzen &quot;gemischten&quot; zellulären Phänotypen schub induziert durch die Strömung zu beschränken Weg innerhalb einer Kreiskulturschale an die Peripherie durch die Platzierung eines inneren Rings. der Aufbau und der Betrieb des Scherring ist einfach und wirtschaftlich und kann leicht eine breite Palette von Kreisschüttler aufzunehmen skaliert werden weit verbreitet Gewebekulturversorgungen. Diese Modell kann in Endothelzellen Experimente angewendet werden unidirektional und periodische Strömungsmuster innerhalb der physiologischen und pathophysiologischen Niveaus zur Verfügung zu stellen.

<table><tbody><tr><td>100 x 20 mm Kunststoff-Gewebekulturschale</td><td>Corning</td><td>430167</td><td>Die Schalen müssen aus Polystyrol</td></tr><tr><td>bestehen 150 x 25 mm Kunststoff-Gewebekulturschale</td><td>Corning</td><td>430599</td><td>Die Schalen müssen aus Polystyrol sein</td></tr><tr><td>150 mm Petrischale aus Glas</td><td>Fisher</td><td>3160150BO</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Polystyrol-Gewebekultur-Kunststoffröhrchen</td><td>Falcon</td><td>352099</td><td></td></tr><tr><td>Methylenchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D65100</td><td></td></tr><tr><td>Silikonkautschuk Dichtstoff</td><td>DAP</td><td>7079808641</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Decon</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>3 ml Transferpipette</td><td>Becton-Dickinson</td><td>357524</td><td></td></tr><tr><td>Drucker Papierschere</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Handschuhe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotationswerkzeug und -set</td><td>Dremel</td><td>4000-6/50</td><td></td></tr><tr><td>Rotationswerkzeug Schneidkopf</td><td>Dremel</td><td>EZ476</td><td></td></tr><tr><td>Rotationswerkzeug Bohrkopf</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>Destillationswasser-Orbitalschüttler<td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>57018-754</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rattennetzhaut mikrovaskuläre Endothelzellen</td><td>Zellbiologika</td><td>RA-6065</td><td></td></tr></tbody></table>

die montage und anwendung der &quot;shear ringe &#39;: a novel endothelial modell für orbital, unidirektional und periodische strömungs- und scherspannung

The Assembly and Application of 'Shear Rings': A Novel Endothelial Model for Orbital, Unidirectional and Periodic Fluid Flow and Shear Stress

Abweichungen von normalen Niveaus und Muster der vaskulären Flüssigkeitsscher spielen eine wichtige Rolle in der Gefäß Physiologie und Pathophysiologie durch adaptive sowie pathologische Veränderungen der endothelialen Phänotyp und die Genexpression zu induzieren. Insbesondere maladaptiven Effekte von periodischen, unidirektionale Strömungs induzierte Scherbeanspruchung kann eine Vielfalt von Wirkungen auf verschiedene vaskuläre Zelltypen auszulösen, insbesondere Endothelzellen. Während mittlerweile Endothelzellen aus verschiedenen anatomischen Herkunft kultiviert worden sind, eingehende Analysen ihrer Reaktionen auf Fluid - Scher wurden durch die relative Komplexität der Schermodelle (zB Parallelplattenflusskammer, Kegel-Platte - Flow - Modell) behindert. Während diese alle guten Ansätze darstellen, sind solche Modelle technisch kompliziert und leiden unter den Nachteilen, einschließlich relativ langwierigen und komplexen Aufbauzeit, niedrige Oberflächenbereiche, Anforderungen für Pumpen und häufig Druck Dicht- und Dichtungen erfordern, Herausforderungen bot die Schaffungh Aufrechterhaltung der Sterilität und die Unfähigkeit, mehrere Experimente auszuführen. wenn ein höherer Durchsatz Modelle von Strömung und Scher jedoch zur Verfügung standen, größere Fortschritte bei der vaskulären endothelialen Scher Reaktionen, insbesondere periodische Scher Forschung auf molekularer Ebene könnte mehr sein, schnell vorangeschritten. Hier beschreiben wir den Aufbau und die Verwendung von Scherringe: a novel, einfach zu montieren und kostengünstig Gewebekultur-Modell mit einer relativ großen Oberfläche, die für eine hohe Zahl von experimentellen Replikate in einer Richtung, periodische Scherspannung Studien leicht ermöglicht auf Endothelzellen.

Hier präsentieren wir repräsentative Ergebnisse aus beiden hCMEC / D3 Gehirn Endothelzellen und retinalen Ratten mikrovaskulären Endothelzellen Monolayern, kultiviert in Scherringen. Nachdem man hCMEC / D3 Gehirn Endothel-Zellmonolayern wachsen in völliger EBM bis zur Konfluenz, die Scherringe wurden 72 Stunden auf einem Schüttler gestellt. Unter Verwendung der Gleichung aus Schritt 3.5, die maximale Schubspannung berechnet <i...

Es ist bekannt, dass verschiedene Niveaus und Muster der Flüssigkeitsscherung die endotheliale Genexpression, den Phänotyp und die Anfälligkeit für Krankheiten modulieren. Wir diskutieren den Aufbau und die Verwendung von "Scherringen": ein Modell, das unidirektionale, periodische Schubspannungsmuster erzeugt. Scherringe sind einfach zu montieren, wirtschaftlich und können hohe Zellausbeuten erzeugen.

Die Montage und Anwendung der &quot;Shear Ringe &#39;: A Novel Endothelial Modell für Orbital, unidirektional und periodische Strömungs- und Scherspannung

Deviations from normal levels and patterns of vascular fluid shear play important roles in vascular physiology and pathophysiology by inducing adaptive as ...

Das übergeordnete Ziel dieses Modells ist es, eine einfache und kostengünstige Methode für In-vitro-Untersuchungen periodischer Flüssigkeitsströmung und Scherbelastung an endothelialen Zellen zu schaffen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen auf dem Gebiet der Endothelzellphysiologie zu beantworten, beispielsweise wie sich periodische Scherbelastung auf Form, Struktur und Funktion endothelialer Zellen auswirkt.Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie ein einfach zusammenzubauendes Zellkulturgerät verwendet, das relativ große Oberflächen für die Beurteilung zellulärer Reaktionen bereitstellt. Diese Prozedur wird von Herrn Luke White, einem Medizinstudenten in meinem Labor, demonstriert. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie Präsentationssoftware verwenden, um eine Scherringschablonenkonstruktion mit einem äußeren Randprofil von 150 Millimeter und einem inneren Durchmesser von 100 Millimeter zu erstellen, der in der Mitte des 150-Millimeter-Kreises positioniert ist.Drucken Sie die Vorlage auf ein A4-Blatt weißes Papier. Arbeiten Sie unter einem Abzug mit ausreichender Belüftung und pipettieren Sie unter Handschuhbenutzung 10 Millimeter Methylenchlorid in eine 15

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Wir beschreiben eine Methode, um unter adhärenten Zellen eine laminare Strömung Schubspannung in einem sterilen kontinuierlichen Kreislauf. Die Zellen "Haftung kann Morphologie durch die transparente Kammer untersucht werden, Proben aus der Schaltung für Metabolit-Analyse und-Zellen nach Scher-Belastung für zukünftige Experimente oder Kultur geerntet wurden.

Parallel-Platten-Flow-Kammer und Continuous Flow Circuit endothelialen Vorläuferzellen unter Laminar Flow Schubspannung Bewerten

Dieser Artikel beschreibt eine vielseitige Methode zur cell-derived Gewebe Ringe durch zelluläre self-assembly erstellen. Glatte Muskelzellen in ringförmige Agarose Brunnen sammeln und Vertrag robust dreidimensionale (3D-) Gewebe innerhalb von 7 Tagen bilden ausgesät. Millimeter-Skala Gewebe Ringe sind förderlich für die mechanische Prüfung und dienen als Bausteine ​​für Gewebe Montage.

Directed Cellular Self-Assembly to Cell-Derived Tissue Ringe für biomechanische Analyse und Tissue Engineering Fabricate

A Mikrokanälen-on-a-Chip-Plattform wurde durch die Kombination von photolithographischen reflowable Photolacktechnik, weiche Lithographie und Mikrofluidik entwickelt. Die endothelialisierten Mikrokanäle Plattform imitiert die dreidimensionale (3D) Geometrie in vivo Mikrogefäßen läuft unter kontrollierten kontinuierlichen Perfusionsfluss, ermöglicht qualitativ hochwertige und Echtzeit-Bildgebung und kann für mikrovaskuläre Forschung angewendet werden.

Verfahren für die Entwicklung von Multi-Tiefe rundem Querschnitt endothelialisierten Mikrokanäle-on-a-Chip

Dieses Manuskript stellt ein Spritzgussverfahren microvessels zu entwickeln, die physiologischen Eigenschaften des Endothels rekapitulieren. Die Mikrofluidik-basierten Prozess erstellt Patent 3D Gefäßnetze mit tailor Bedingungen, wie Durchfluss, zelluläre Zusammensetzung, Geometrie und biochemische Steigungen. Das Herstellungsverfahren und Beispiele für mögliche Anwendungen beschrieben.

Mikrostrukturierung und Montage von 3D-Micro-Ader

ovarian Tumorprogression in einem physiologisch relevanten Modell, mehrzelligen Sphäroiden wurden in einem Mikroeinrichtung unter simulierten Fluidstrom zu studieren. Diese dynamische 3D-Modell emuliert die intraperitoneale Umgebung mit den zellulären und mechanischen Komponenten, bei denen Ovarialkarzinom Metastasen auftreten.

Modellierung Ovarian Cancer Vielzellige Sphäroid-Verhalten in einer dynamischen 3D-Peritoneal Microdevice

Hier ist ein Workflow für die Kultur und Gen Expressionsanalyse von Endothelzellen unter Fluid Schubspannung präsentiert. Enthalten ist eine räumliche Anordnung für die gleichzeitig Gehäuse und Überwachung mehrerer Fluss Kammern in einer kontrollierten Umgebung und die Verwendung einer exogenen Referenz-RNA für die quantitative PCR.

Gen Expressionsanalyse von Endothelzellen ausgesetzt um Stress mit mehreren Parallel-Platte Fluss Kammern Scheren

Das Ziel dieses Protokolls ist es, eine modifizierte parallele Plattendurchflusskammer für die Untersuchung der Echtzeitaktivierung von mechanosensitiven Ionenkanälen durch Scherspannung zu beschreiben.

Elektrophysiologische Aufnahmen von einzelzelligen Ionenströmen unter genau definiertem Scherspannung

Dieses Protokoll beschreibt eine Beschichtungsmethode, um das Wachstum von Endothelzellen auf einen bestimmten Bereich einer 6-Well-Platte für die Scherspannungsanwendung unter Verwendung des Orbitalschüttlermodells zu beschränken.

Segmentierung des Wachstums von Endothelzellen in 6-Well-Platten auf einem Orbitalschüttler für mechanobiologische Studien

Hier bieten wir einen mikrofluidischen Chip und ein automatisch gesteuertes, hocheffizientes Kreislauf-Mikrofluidsystem, das die anfängliche Mikroumgebung der Neovaskularisation rekapituliert und es ermöglicht, Endothelzellen (ECs) durch hohe Luminalscherspannung, physiologischen Transendothelfluss und verschiedene vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktor (VEGF) gleichzeitig zu stimulieren.

Mikrofluidisches Modell zur Nachahmung des ersten Ereignisses der Neovaskularisation

Wir synthetisierten und charakterisierten ein abstimmbares gelatinebasiertes Substrat für die Kultivierung von vaskulären Endothelzellen (ECs) unter relevanten vaskulären Flussbedingungen. Diese biomimetische Oberfläche repliziert sowohl physiologische als auch pathologische Zustände und ermöglicht so die Untersuchung mechanischer Kräfte auf das EC-Verhalten und erweitert unser Verständnis der vaskulären Gesundheit und der Krankheitsmechanismen.

In-vitro-Modell, das die Steifigkeit und den Fluss des Substrats integriert, um die Reaktionen von Endothelzellen zu untersuchen

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um ein mikrofluidisches System herzustellen und zu betreiben, das Endothelzellen synchronisierter oszillatorischer Hyperglykämie und pulsatiler Scherspannung aussetzt. Dieser Ansatz bietet ein physiologisch relevantes In-vitro-Modell zur Untersuchung diabetischer Endotheldysfunktion. Dieses Protokoll ermöglicht die quantitative Messung von oxidativem Stress und den Antworten von Endothelzellen.

Ein mikrofluidisches System zur Modellierung der endothelialen Dysfunktion unter kombinierter physiologischer pulsatiler Scherspannung und oszillatorischer Hyperglykämie

Erfahren Sie die Montage und Anwendung von Shear Rings zur Untersuchung endothelialer Zellen unter periodischer Scherströmung. Diese kostengünstige Methode ermöglicht die Analyse zellulärer Reaktionen auf mechanische Reize.

Die Montage und Anwendung der Shear Ringe : A Novel Endothelial Modell für Orbital, unidirektional und periodische Strömungs- und Scherspannung (Video) | JoVE Journal

Die Montage und Anwendung der "Shear Ringe ': A Novel Endothelial Modell für Orbital, unidirektional und periodische Strömungs- und Scherspannung

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