Eine neue Technik zur Erzeugung und Observing Chemilumineszenz in einem biologischen Rahmen

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, ein neues präklinisches, interoperatives, chemilumineszierendes Bildgebungsverfahren anzubieten, das Vorteile gegenüber bestehenden optischen Techniken in Bezug auf Signal-Rausch-Verhältnisse und Nachweisgrenzen bieten kann. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen zu beantworten, die mit herkömmlichen optischen Bildgebungsverfahren in vielen Bereichen der Biowissenschaften nicht zugänglich waren. Die Hauptvorteile dieser Technik bestehen darin, dass sie ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis aufweist und weder sofortiges Licht noch Strahlung benötigt.

Was wir also herausgefunden haben, ist, dass sich die Implikationen dieser Technik aufgrund der hohen Signal-Rausch-Verhältnisse, die diese Technik zu bieten hat, wirklich auf die interoperative Bildgebung mehrerer Krankheitszustände, einschließlich Krebs, erstrecken. Da für diese Technik kein einfallendes Licht benötigt wird, gibt es keine Probleme mit der Absorption des auffallenden Lichts. Darüber hinaus steht ein großer chemischer Werkzeugkasten zur Verfügung, um das chemilumineszierende Kernmolekül zu funktionalisieren.

Bereiten Sie zu Beginn des Verfahrens 100 Mikroliter Standardlösungen von Tris(bypiridin)ruthenium(II)chlorid in Umkehrosmosewasser vor. Kombinieren Sie dann jeden Standard mit 100 Mikrolitern einer 25 millimolaren Lösung von Ammonium-Cer-Nitrat in Umkehrosmosewasser auf einem Objektträger. Öffnen Sie die Biolumineszenz-Reader-Bildgebungssoftware und klicken Sie auf Initialisieren.

Stellen Sie im Bildgebungsmodus sicher, dass Lumineszenz und Foto aktiviert und fluoreszierend deaktiviert sind. Legen Sie die Parameter für die Lumineszenzbelichtungszeit, das Binning, die Blende und den Emissionsfilter fest. Legen Sie die Belichtungszeit, das Binning und die Blende-Parameter für das Foto fest.

Stellen Sie dann die Höhe des Motivs entsprechend der abzubildenden Probe ein. Stellen Sie das Sichtfeld auf B ein, um einen Abstand von 14 Zentimetern zwischen der Kamera und dem Probentisch zu erreichen. Decken Sie den Boden der Bildgebungskammer des Biolumineszenz-Readers im Probentisch mit schwarzem Tonpapier ab.

Legen Sie dann den ersten Objektträger mit dem Tröpfchen der Standardmischung auf den Probentisch, wobei das Tröpfchen mittig im grünen Fadenkreuz des Leuchtkastens liegt. Füllen Sie als Nächstes die Drei-Unzen-Sprühflasche eines speziell angefertigten Verneblers mit der 1:3-Lösung von Triethylamin in einer 50/50-Lösung aus Wasser und Ethanol. Stellen Sie sicher, dass sich keine Luftblasen im Aspirationsrohr befinden.

Platzieren Sie die Verneblerbaugruppe in der Bildgebungskammer, wobei die Sprühdüse auf das abzubildende Tröpfchen gerichtet ist, ohne die Kamerasicht auf das Tröpfchen zu behindern. Stellen Sie sicher, dass der Netzschalter und die Betriebsanzeige des Verneblers eingeschaltet sind, der magnetische Kippschalter ausgeschaltet ist und sich der Netzvernebler und die Kabel der Fernbedienung nicht verheddert haben. Decken Sie Hot Spots wie Markierungen auf der Folie mit kleinen Stücken schwarzem Bastelpapier ab.

Platzieren Sie mindestens 40 Zentimeter des Kabels der Verneblerfernbedienung in der Bildgebungskammer. Schließen Sie die Kammertür vorsichtig, ohne die Verneblerkabel zu quetschen. Klicken Sie in der Gerätesoftware auf Erwerben, aktivieren Sie das automatische Speichern und legen Sie den Pfad der Datendatei fest.

Starten Sie die Bildgebungssequenz. Wenn sich der Verschluss mit einem hörbaren Klicken öffnet, schalten Sie den Vernebler dreimal um, um drei Stöße Triethylaminlösung auf die Probe zu sprühen. Wiederholen Sie den Vorgang mit jedem Standardobjektträger, um die minimal nachweisbare Konzentration des Ruthenium-Bildgebungsmittels zu bestimmen.

Um das In-vivo-Bildgebungsverfahren zu beginnen, bereiten Sie 100 Mikroliter einer Lösung vor, die zwischen 8 und 33 Nanomol Tris(bypiridin)ruthenium(II)chlorid in phosphatgepufferter Kochsalzlösung enthält. Bereiten Sie eine wässrige 25-Millimola-Lösung von Ammonium-Cer-Nitrat vor. Als nächstes injizieren Sie intravenös 100 Mikroliter des Ruthenium-Bildgebungsmittels in die Schwanzvene gesunder Mäuse

Die Mäuse werden 10 Minuten nach der Injektion durch Kohlendioxid-Erstickung getötet. Entfernen Sie die Haut vom Rumpf mit einem Y-Schnitt und entfernen Sie dann den Rippenbogen, um Herz und Lunge freizulegen. Schneiden Sie einen Auslass in den rechten Vorhof und injizieren Sie 20 Milliliter PBS durch eine 24-Gauge-Nadel in den linken Ventrikel.

Schneiden Sie durch die Bauchhaut, um Niere und Leber freizulegen. Wenn es sich bei dem interessierenden Organ um die Leber, die Niere oder die Milz handelt, machen Sie einen sichtbaren Längsschnitt durch das Organ. Bereiten Sie eine neue Bildgebungssequenz in der Biolumineszenz-Reader-Software vor.

Platzieren Sie die Maus für die Bildgebung des gesamten Bauches in der Bildgebungskammer, wobei der offene Bauch zur Kamera und der Kopf zur Rückseite des Instruments zeigt. Zentrieren Sie das interessierende Organ im grünen Fadenkreuz. Waschen Sie die Sprühflasche und die Düse gründlich aus der Verneblerbaugruppe aus und füllen Sie die Flasche dann mit der Ammonium-Cer-Nitrat-Lösung.

Platzieren Sie den Vernebler in der Bildgebungskammer, wobei die Sprühdüse auf die Bildgebungsstelle gerichtet ist. Stellen Sie sicher, dass die Kamera frei ist, sich die Kabel nicht verheddern und sich mindestens 40 Zentimeter des Fernkabels in der Kammer befinden. Schließen Sie die Kammer und starten Sie die Bildgebungssequenz.

Wenn sich der Verschluss mit einem Klick öffnet, schalten Sie den Schalter dreimal um, um drei Stöße des Oxidationsmittels auf die Bildgebungsstelle zu sprühen. Entfernen Sie nach der Bildgebung die Verneblerbaugruppe und spülen Sie die Sprühdüse gründlich aus, um eine Kristallisation des Ammonium-Cernitrats zu verhindern. Für die anschließende Bildgebung und Quantifizierung einzelner Organe nehmen Sie die Maus aus dem Instrument und entfernen die inneren Organe ausgehend von der offenen Körperhöhle.

Schneiden Sie durch die Haut der Hinterbeine, um Muskelgewebeproben zu entfernen. Wenn das interessierende Organ die Leber, Niere oder Milz ist, schneiden Sie das Organ in Längsrichtung in zwei Hälften. Legen Sie dann das Organ auf eine Petrischale oder ein Stück schwarzes Bastelpapier.

Stellen Sie jedes Organ auf die gleiche Weise wie das ganze Tier dar und spülen Sie die Sprühdüse nach jeder Sequenz. Bei diesem Verfahren wurde Mäusen ein bildgebendes Mittel auf Rutheniumbasis injiziert und das Gewebe von Interesse mit einem Oxidationsmittel besprüht, um eine Chemilumineszenz zu induzieren. Die minimal nachweisbare Konzentration des bildgebenden Mittels wurde unter diesen Bedingungen mit 6,9 Pikomolen pro Quadratzentimeter bestimmt.

Chemilumineszenz-in-Weißlicht-Bilder der interessierenden Organe wurden mit einem Biolumineszenz-Reader aufgenommen. Das Chemilumineszenzsignal wurde überwiegend in den Nieren nach intravenöser Injektion beobachtet, was auf eine renale Elimination des hydrophilen Tris(bypiridin)ruthenium(II)kations hinweist. Das Signal-Rausch-Verhältnis des bildgebenden Mittels gegenüber PBS allein betrug 27:1 in den Nieren und 21:1 in der Leber.

Kniekehlenlymphknoten der Maus wurden ebenfalls mit einer subkutanen Injektion einer konzentrierteren Lösung des rutheniumbasierten Bildgebungsmittels untersucht. Die Lymphknoten, die das bildgebende Mittel enthielten, zeigten eine signifikant höhere Ausstrahlung als die Lymphknoten, die nur PBS enthielten. Einmal gemeistert, kann diese Technik in zwei Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, Umgebungslicht auszuschließen und eine Kontamination mit Ruthenium tris bpy zu vermeiden. Nach ihrer Entwicklung wird diese Technik Forschern auf dem Gebiet der biomolekularen Bildgebung den Weg ebnen, um Krankheitszustände wie Krebs bei Mäusen zu erforschen. Obwohl diese Methode Einblicke in Fragen geben kann, die mit herkömmlichen optischen Bildgebungsverfahren nicht zugänglich waren, kann jede Frage, die mit herkömmlichen Techniken untersucht werden könnte, möglicherweise mit Chemilumineszenz beantwortet werden.