Name: Eine neue Technik zur Erzeugung und Observing Chemilumineszenz in einem biologischen Rahmen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Erfahren Sie eine neue intraoperative Chemilumineszenz-Technik mit Ruthenium-Komplex für verbesserte Bildgebung in biologischen Systemen. Diese Methode bietet höhere Signal-Rausch-Verhältnisse ohne einfallendes Licht.

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Die Autoren danken Prof. Jan Grimm und Herrn Travis Shaffer für ihre hilfreichen Diskussionen und Herrn David Gregory für die Bearbeitung des Manuskripts. Die technischen Dienstleistungen der MSK Animal Imaging Core Facility, die zum Teil durch den NIH Cancer Center Support Grant P30CA008748-48 unterstützt werden, werden dankbar gewürdigt. Die Autoren danken den NIH (K25 EB016673 und R21 CA191679, T.R. und 4R00CA178205-02, B.M.Z.), dem MSK Center for Molecular Imaging and Nanotechnology (T.R.), der Tow Foundation (B.C.) und der National Science Foundation Integrative Graduate Education and Research Traineeship (IGERT 0965983 am Hunter College for B.C. und T.M.S.) für ihre großzügige Unterstützung. Die in dieser Veröffentlichung berichtete Forschung wurde von der King Abdullah University of Science and Technology finanziell unterstützt.

Ethik - Erklärung: Alle in vivo Tierversuchen wurden nach einer genehmigten Protokoll und unter den ethischen Richtlinien des Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSK) Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) ausgeführt beschrieben. 1. Aufbau eines Vernebelungsgerät <ol><li> Bringen Holzteil A (12,5 x 2,5 x 1,8 cm 3) aufrecht im Zentrum von Teil B (12,7 x 10,7 x 1,8 cm 3) mit zwei Schrauben (4 x 25 mm 2). Befestigen Holzteil C (11 × 2,5 × 1,8 cm 3) in der Mitte des Teils A (12,5 x 2,5 x 1,8 cm 3) mit einer Schraube, so dass ein Teil C (11 x 2,5 x 1,8 cm 3) noch bewegt werden. Siehe Abbildung 1. </li><li> Bohren Sie zwei Löcher durch die untere Spitze der Sprühflasche Auslöser einer Kunststoff 3 Unzen Mini Sprayer (D), und drücken Sie eine Edelstahlstange (10 cm von 1/16 &quot;Stahl) (E) durch zwei Schleifen zu bilden, eine auf entweder Seite des Auslösers. </li&gt; <li> Wickeln Sie den unteren Teil der Sprühflasche mit Klebeband (F) die Kabelbinder ein Abrutschen zu verhindern. Bringen Sie die Sprühflasche Holzteil C (11 x 2,5 x 1,8 cm 3) unter Verwendung der beiden Kunststoff - Kabelbinder (28 cm) (G). </li><li> Schneiden Sie das 011-Servomotor (I) aus, und schließen Sie sie mit den losen Kabel der Servosteuerung (H). Befestigen Sie dann den Servomotor an die Spitze der Holzteil A (12,5 x 2,5 x 1,8 cm 3) unter Verwendung von Klebeband. </li><li> Bringen Sie einen Bleistift (J) an den Servomotorhebel mit der Büroklammer (K). Dicht verbinden mit Klebeband die äußersten Teile des Stiftes an den Stahlstab Schleifen Kunststoff abgedeckt Twist Drähte (L) und befestigen Sie die Enden auf dem Bleistift. </li><li> Schneiden Sie die Servomotor-Steuereinheit des Magnetkabelstecker (M) und bringen Sie ihn an die Lautsprecherkabel (N) ab. Dann kleben Sie das Servomotor - Steuereinheit zu Holzteil B (12,7 x 10,7 x 1,8 cm 3). Schneiden Sie ein w1 Kabel mit Magnet Anschlüsse in zwei Hälften und heften sich an das lose Ende des Kupfer s ein Teilpeaker Kabel (1 m). Schließen Sie den (magnetisch) i2 Kippschalter und p1 Leistung der zur Verfügung stehenden w1 Kabel und einer 9V-Batterie. </li></ol> 2. Empfindlichkeit Bestimmung der Methode <ol><li> In einem 1,5 - Mikrozentrifugenröhrchen ml, werden die Lösungen von [Ru (bpy) 3] Cl 2 bei der Umkehrosmose Wasser (100 &amp; mgr; l) in Mengen von 260 &amp; mgr; g (347 nmol), 52 &amp; mgr; g (69 nmol), 26 &amp; mgr; g (34 nmol) , 5 ug (6,9 nmol), 3 &amp; mgr; g (3,5 nmol), 520 ng (694 pmol), 260 ng (347 pmol), 52 ng (69 pmol), 26 ng (34 pmol), 5 ng (6,9 pmol), und 3 ng (3,5 pmol). </li><li> Mischungs 100 ul jeder [Ru (bpy) 3] Cl 2 Lösung mit 100 ul einer wässrigen Lösung von Ammonium - Cernitrat ((NH 4) 2 Ce (NO 3) 6) in Wasser (25 mM) auf einem Mikroskop - Objektträger. </li><li> Stellen Sie den Erwerb in der Biolumineszenz Leser, indem Sie die Imaging - Software zu initialisieren. <ol><li> Melden Sie sich in das Benutzerprofil in und suchen die acquisition Bedienfeld. Klicken Sie auf &quot;Initialisieren&quot; und warten, bis das Gerät bereit ist. </li><li> Suchen Sie nach &quot;Imaging-Modus&quot; und stellen Sie sicher, &quot;Luminescent&quot; und &quot;Photograph&quot; werden überprüft und, dass &quot;Fluorescent&quot; nicht markiert ist. </li><li> Ändern &quot;Belichtungszeit&quot; Einstellung für &quot;Luminescent&quot; bis 20 s. Legen Sie die übrigen Einstellungen für &quot;Luminescent&quot; wie folgt: &quot;Binning&quot;: Medium; &quot;F / Stop&quot;: 1; und &quot;Emission Filter&quot;: Open. HINWEIS: Die Belichtungszeiten benötigen nach der Instrumentierung und experimentellen Einstellung angepasst werden, verwendet werden, falls abweichend von der dargestellten Einrichtung. </li><li> Für &quot;Photograph&quot;, verwenden Sie die folgenden Einstellungen: &quot;Belichtungszeit&quot;: Auto; &quot;Binning&quot;: Medium; und &quot;F / Stop&quot;: 8. Stellen Sie den &quot;Betreff Höhe&quot; gemäß Abbildung target.Look für das &quot;Field of View&quot; Dropdown-Menü. Die Grundeinstellung ist &quot;C&quot; Wechseln Sie zu &quot;B&quot; (14 cm Abstand zwischen der cAmera und Probentisch). </li></ol></li><li> Stellen Sie den Vernebler, indem Sie einen Objektträger auf einem Blatt aus schwarzem Tonpapier auf dem Boden der Imaging - Kammer platziert es aus dem Oxidationsmittel zu schützen. Mischen Sie einen 100 μLdroplet von [Ru (bpy) 3] Cl 2 -Lösung mit 100 &amp; mgr; l einer wässrigen Lösung von (NH 4) 2 Ce (NO 3) 6. Beobachten Sie das grüne Feld Fadenkreuz. <ol><li> Legen Sie die abzubildenden Objekt auf dem schwarzen Tonpapier, so dass der Bereich von Interesse ist in der Mitte des grünen Fadenkreuz-Licht-Box angezeigt auf der Probenbühne. Bereiten Sie den Vernebler durch die Kunststoff-Sprühflasche aus dem Holzbock lösen. Füllen Sie eine Lösung von Triethylamin (1: 3 in Wasser / Ethanol) in seine Kunststoffbehälter und bringen es auf den Holzbock. </li><li> Setzen Sie den Vernebler in der Biolumineszenz Leser und stellen Sie sicher, dass das Netzkabel aus dem Vernebler Kabel ist nicht angeschlossen. Stellen Sie sicher, dass der Netzschaltereingeschaltet ist, ist der Kippschalter ausgeschaltet und die rote LED leuchtet Setzen Sie den Vernebler, so dass der Spritzstrom wird auf den Bereich von Interesse auf dem Imaging-Objekt gerichtet, während die Sicht nach Behinderung von der Kamera auf das Motiv Bildgebung zu minimieren durch die Sprühdüse Kopf. </li><li> Legen Sie kleine, schwarze Stücke Tonpapier über eventuelle Hot - Spots (zB weiße Flecken auf mikroskopische Dias oder Injektionsstellen) , um sie vor Spritzwasser zu schützen. Legen Sie mindestens 40 cm des Zerstäubers Remote-Kabel innerhalb der Imaging-Kammer, so dass es nicht mit dem abzubildenden Objekt, dem Vernebler oder die magnetische Türverriegelung nicht stört. Schließen Sie das Abbildungssystem Tür. HINWEIS: Das Fadenkreuz wird Größe ändern auf der Grundlage der &quot;Field of View&quot; Einstellung in &quot;Bild Wohnen&quot;; stellen Sie sicher, dass diese auf &quot;B&quot; gesetzt. </li></ol></li><li> ein Bild erwerben, indem Sie die Bildsequenz zu initiieren. Klicken Sie auf &quot;Erwerben&quot; im &quot;Acquisition Systemsteuerung&quot;. Auf der ersten Bildgebungs sequrenz, ermöglichen automatisches Speichern, wenn ein Datenordner gewünscht (empfohlen) und wählen. Ignorieren Sie die &quot;Edit Imaging Labels&quot; Dialog bis zum Ende der Sequenz. HINWEIS: Die Steuerungssoftware zeigt das Gerät die Aktionen Schritt-für-Schritt in Echtzeit. Nach der Messung der Vorbereitung und der Probentisch in die rechte Position bewegt, öffnet er den Kameraverschluß und zählt die Messzeit. Die Verschlussöffnung kann auch durch ein Klickgeräusch von der Maschine erzeugten hören. </li><li> Da der Verschluss öffnet, Spray drei Ausbrüche von einer Lösung von Triethylamin (1: 3 in Wasser / Ethanol, 0,24 ± 0,04 ml pro Burst-Spray) durch den Kippschalter dreimal Schalt Chemilumineszenz zu erzeugen. HINWEIS: Die Probenbühne während der Messung bewegt. Lassen Sie genug (mindestens 40 cm) Kabel im Inneren des Gerätes, dies zu ermöglichen. Stellen Sie sicher, dass die Lösung durch den Vernebler versprüht werden kann durch das Steigrohr angestrebt werden, und dass es keine Luftblasen in das Rohr. Haben mehrere Ersatz batteries für den Zerstäuber bereit, falls erforderlich. </li></ol> 3. In - vivo - Bildgebung nach systemischer intravenöser Injektion <ol><li> In einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, Herstellung von 100 &amp; mgr; l phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) Lösung zwischen 8 und 33 nmol [Ru (bpy) 3] Cl 2 enthält. Bereiten einer wäßrigen Lösung von (NH 4) 2 Ce (NO 3) 6 in Wasser (25 mM) zur gleichen Zeit. </li><li> Intravenös injizieren 100 ul [Ru (bpy) 3] Cl 2 in die Schwanzvene von gesunden Mäusen (n = 5). </li><li> Euthanize die Mäuse 10 min nach der Injektion über CO 2 Erstickung. <ol><li> Entfernen Sie die Haut mit einem Y-Schnitt aus dem Rumpf, entfernen Sie dann den Rippenbogen in einer U-Form das Herz und die Lungen zu belichten. Perfundieren die Mäuse durch einen Auslass in dem rechten Vorhof Schneiden und Injizieren 20 ml PBS durch eine 24 Gauge - Nadel in den linken Ventrikel 18. Vorsichtig durch den Bauch geschnittenHaut und der Niere und der Leber aus. Schneiden in Längsrichtung durch die Organe einen sichtbaren Schnitt zu erstellen. </li></ol></li><li> Stellen Sie den Erwerb wie in Schritten von 2,3 bis 2,6, mit den folgenden Änderungen beschrieben. <ol><li> Nach gründlichem den Vernebler Kunststoffbehälter Waschen, füllen Sie es mit einer Lösung von (NH 4) 2 Ce (NO 3) 6 in Wasser (25 mM) anstelle von Triethylamin. HINWEIS: Es ist wichtig , um gründlich die Verneblerdüse nach jedem Gebrauch gründlich, da kristallisieren (NH 4) 2 Ce (NO 3) 6 kann die Sprühdüse nach mehreren Verwendungen zerstören. </li></ol></li><li> Verwenden Sie die ganze Tier oder Organproben für die Bildgebung. <ol><li> Für ganze Bauch Bildgebung, positionieren Sie die Maus Karkasse mit dem offenen Bauch die Kamera und den Kopf nach auf der Rückseite des Geräts zeigt. Das Organ Center abgebildet (zB Leber oder Niere) im grünen Licht - Box Fadenkreuz werden. </li><li> Foder einzelne Organ Bildgebung und Quantifizierung, entfernen Sie die Maus aus dem Abbildungsinstrument und stecken Sie es nach unten. Ausgehend von dem bereits geöffneten Körperhöhle, auszuschneiden die inneren Organe (zB Niere, Leber, Lunge, Muskel, Milz, Gehirn und Herz). Schnitt durch das Hinterbein Haut Muskelgewebe auszuschneiden. Öffnen Sie vorsichtig den Schädel mit einem Skalpell das Gehirn auszuschneiden. <ol><li> Wenn das interessierende Organ Leber, Niere oder Milz, schneiden alle Organe in der Hälfte der Länge nach, legen jedes Organ auf einer Petrischale oder ein Stück schwarzes Tonpapier. </li></ol></li><li> Befolgen Sie die Anweisungen in den Schritten 2,3-2,6 um die relative Emission des chemolumineszenten Tracer für die einzelnen Organe herzustellen. </li></ol></li></ol> 4. In - vivo - Imaging von Lymphknoten <ol><li> Herstellung von 10 &amp; mgr; l einer PBS - Lösung , enthaltend 80 nMol [Ru (bpy) 3] Cl 2. Bereiten einer wäßrigen Lösung von (NH 4) 2 Ce (NO 3) 6 in water (25 mM) zur gleichen Zeit. </li><li> Injizieren Sie 10 ul der Lösung subdermally in die Hinterpfote von gesunden Mäusen (n = 5). Als Negativkontrolle, injizieren die kontralaterale Pfote mit 10 &amp; mgr; l reinem PBS. Opfern , um die Mäuse über CO 2 Ersticken 15 Minuten nach der Injektion. Entfernen Sie die Haut an beiden Hinterbeinen, die Lymphe Kanäle zu belichten bis in die Kniekehlen-Lymphknoten. </li><li> Stellen Sie den Erwerb wie in Schritt 3.4 beschrieben. </li><li> Entfernen Sie die poplitealen Lymphknoten von beiden Hinterbeinen, schneiden sie in zwei Hälften, und sprühen sie mit Oxidationsmittel auf einer Petrischale, wie zuvor beschrieben (Schritt 3.5.3), zum Zwecke der Quantifizierung. </li></ol>

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<li>Bœuf, G., et al. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/262418715_Encapsulated_RutheniumII_Complexes_in_Biocompatible_PolyDL-lactide-co-glycolide_Nanoparticles_for_Application_in_Photodynamic_Therapy">Encapsulated Ruthenium(II) Complexes in Biocompatible Poly(d,l-lactide-co-glycolide) Nanoparticles for Application in Photodynamic Therapy.</a> ChemPlusChem. 79 (1), 171-180 (2014).</li>
<li>Loizidou, M., Seifalian, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanotechnology+and+its+applications+in+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Brit.+J.+Surgery%22%5BJournal%5D)">Nanotechnology and its applications in surgery.</a> Brit. J. Surgery. 97 (4), 463-465 (2010).</li>
<li>Barry, N. P. E., Sadler, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+for+Metals+in+Medicine%3A+How+Nanotechnology+May+Help+To+Shape+the+Future%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Challenges for Metals in Medicine: How Nanotechnology May Help To Shape the Future.</a> ACS Nano. 7, 5654-5659 (2013).</li>
<li>Hasan, K., Bansal, A. K., Samuel, I. D. W., Roldán-Carmona, C., Bolink, H. J., Zysman-Colman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+the+Emission+of+Cationic+Iridium+%28III%29+Complexes+Towards+the+Red+Through+Methoxy+Substitution+of+the+Cyclometalating+Ligand%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Tuning the Emission of Cationic Iridium (III) Complexes Towards the Red Through Methoxy Substitution of the Cyclometalating Ligand.</a> Nat.Sci. Rep. 5, 1-15 (2015).</li>
<li>Truong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemiluminescence+detection+with+water-soluble+iridium%28III%29+complexes+containing+a+sulfonate-functionalised+ancillary+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Chemiluminescence detection with water-soluble iridium(III) complexes containing a sulfonate-functionalised ancillary ligand.</a> Analyst. 139 (22), 6028-6035 (2014).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Hier haben wir eine Technik vorgestellt, die optisch der Lage ist, durch einen chemolumineszierenden Reporter erstellt Gewebe über die Emission von Photonen abzugrenzen. Im Gegensatz zu anderen, etabliert, Technologien 4, 5, 6, 7, 8, 9, dieses chemilumineszierende Reportersystem verwendet eine Abbildungssonde , die nicht-rad...

In den letzten Jahrzehnten haben die Imaging-Technologien die Art und Weise revolutioniert, die Ärzte diagnostizieren und Überwachung von Krankheiten. Diese bildgebenden Verfahren, wurden jedoch weitgehend auf Ganzkörperbildgebungssysteme, wie Positronenemissionstomographie (PET), Single-Photon-Emissions-Computertomographie (SPECT), Computertomographie (CT) und Magnetresonanztomographie (MRI). Besondere Aufmerksamkeit wurde auf Krebs bezahlt und technologischen Durchbrüche haben Bildgebung stark die Art und Weise verbessert, dass diese Krankheit diagnostiziert und behandelt wird. Trotz dieser Fortschritte gibt es einen Ort, an dem diese Imaging-Technologien einfach nicht passen: der OP. Während Ganzkörperbildgebungstechniken in der chirurgischen Planung helfen können, fehlt ihnen typischerweise räumliche Auflösungen hoch genug Ärzte in Echtzeit , um festzustellen , ob alle Tumorgewebe entfernt wurde oder Gewebe Resttumor bleibt bei den operativen Margen 1 versteckt. Stellt sicher, dass keine infiltrativenTumorränder hinter ist links eine der wichtigsten operativen Ziele und Chirurgen müssen einen Drahtseilakt zwischen strengen und vorsichtigen Gewebsresektion gehen. Wenn zu viel entfernt wird, sind unerwünschte Nebenwirkungen für den Patienten verstärkt; wenn zu wenig entfernt wird, werden die Rezidivrate 2 erhöht, 3. Daher ist es entscheidend, eine genaue Tumorränder zu beschreiben, und wir glauben, dass chemolumineszierende intraoperative Bildgebung kann helfen, die Genauigkeit der Identifikation von Tumorgrenzen zu verbessern, indem Chirurgen sichtbar zu machen bösartigem Gewebe zu helfen, die sonst unentdeckt mit etablierten Techniken bleiben könnte. Es gibt viele Imaging-Technologien derzeit für eine mögliche Verwendung als intraoperativen Bildgebungssysteme untersucht. Dazu gehören β- und γ-Strahlung emittierenden Sonden 4, optische Fluoreszenz 5, Raman - Spektroskopie 6 </sup&gt;, 7 und Cherenkov Lumineszenz 8, 9. Bis heute jedoch keine von diesen als klinische Standardtools etabliert geworden. Optische Fluoreszenz-Bildgebung hat sich bisher die vielversprechendsten dieser Techniken zu sein und ist deshalb die erforscht. Während es bereits ein wertvolles Werkzeug für viele Anwendungen gezeigt worden ist, ist es nicht ohne Einschränkungen. Tatsächlich ist ihr Hauptnachteil der Hintergrundfluoreszenz von Natur aus autofluoreszenten biologischem Gewebe erzeugt. Dieser Hintergrund autofluoreszierenden Signal ist ein Produkt der Anregung von dem umgebenden Gewebe, zusätzlich zu dem Fluorophor, von der externen Lichtquelle zur Erzeugung eines Fluoreszenzsignals erforderlich ist. Aus praktischer Sicht kann diese Autofluoreszenz führen möglicherweise zu niedrigen Signal-zu-Rausch-Verhältnisse, die die Nützlichkeit dieser Technologie im Operationsraum begrenzen. Der DirektorVorteil der Chemilumineszenz-Bildgebung über Fluoreszenz-Bildgebung ist, dass kein Anregungslicht notwendig ist. Als Ergebnis gibt es keine Hintergrundautofluoreszenz. In Chemilumineszenz Bebilderung wird die Anregungsenergie chemisch statt erzeugt. Dieses Verfahren erzeugt keine unbeabsichtigte Signaluntergrund und somit zu höheren Signal-zu-Rausch-Verhältnis führen kann. Dies könnte dazu führen letztlich in die genauere und präzise Erkennung von operativen Margen. Etwas überraschend hat sich der Nutzen dieses Ansatzes als intraoperativen Bildgebungstechnik unerforscht 10 geblieben. Tatsächlich ist das nächste Beispiel dieser Technik die Oxidation von Luminol durch Myeloperoxidase in Mäusen , 11, 12, 13. Chemilumineszenter biomedizinischen Bildgebung ist daher ein ziemlich unerforschtes Gebiet der Forschung, die folgende Vorteile bieten könnte: (1) minimale Autofluoreszenz, was zu einem niedrigen Hintergrundsignal mit hallogher Signal-zu-Rausch-Verhältnisse; (2) abstimmbaren Wellenlängen des chemolumineszenten Emissionen im Bereich vom sichtbaren bis zum nahen Infrarot; und (3) funktionalisierbarer chemolumineszenten Komplexe , die, wenn sie mit Linker - Technologien kombiniert und Biomoleküle gezielt , die bereits existieren, 14 Zugriff auf ganze Bibliotheken von gezielten molekularen Bildgebung Sonden liefern. Diese Proof-of-Principle-Studie zeigt die potentielle Nützlichkeit von Chemilumineszenz-Bildgebung in der biomedizinischen Einstellung eines Ruthenium-basierte Bildgebungsmittel verwendet wird. Die chemolumineszenten Eigenschaften dieser Verbindung sind gut untersucht, mit Untersuchungen aus der Zeit der Mitte der 1960er Jahre 15. Bei chemischer Aktivierung erzeugt das Mittel Licht bei etwa 600 nm 16, die für medizinische Abbildungszwecke gut geeignet ist. Die Aktivierungsenergie wird durch eine Redox - Reaktion zur Verfügung gestellt , die in einen angeregten Zustand-was dazu führt , eine Lebensdauer von 650 ns in Wasser 17 -foll hatdurch die Erzeugung von Photonen bei Entspannung der angeregten Zustand zu verdanken. Durch die Verwendung eines speziell gestalteten Fern Vernebler, konnten wir die Verbindung , die sowohl ex vivo und in vivo zu detektieren. Die Ergebnisse der anfänglichen Experimente sind sehr vielversprechend, was auf eine weitere Untersuchung dieser Technologie.

<table><tbody><tr><td>Holzteil A (12,5 x 2,5 x 1,8 cm)</td><td> Woodcraft</td><td>131404</td><td>Schneiden Sie aus einer 3/4" x 24" x 30" Birkensperrholzplatte</td></tr><tr><td>Holzteil B (12,7 x 10,7 x 1,8 cm)</td><td>Woodcraft</td><td>131404</td><td>Schneiden Sie aus einer 3/4" x 24" x 30" Birkensperrholzplatte</td></tr><tr><td>Holzteil C (11 x 2,5 x 1,8 cm)</td><td>Woodcraft</td><td>131404</td><td>Schneiden Sie aus einer 3/4" x 24" x 30" rdquo; Birkensperrholzblech</td></tr><tr><td>Schrauben (4 & x 25 mm)</td><td>Screwfix</td><td>79939</td><td></td></tr><tr><td>Harmon Face Values 3 oz Mini-Sprühgerät</td><td>Bed, Bath and Beyond</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Edelstahlstange (10 cm aus 1/16" Stahl)</td><td>Metals Depot Int. Inc.</td><td>2192</td><td></td></tr><tr><td>Bleistift Classic HB</td><td>Papermate</td><td>58592</td><td></td></tr><tr><td>Büroklammer</td><td>Office Depot</td><td>221720</td><td></td></tr><tr><td>Lautsprecherkabel</td><td>RCA Inc.</td><td></td><td></td>AH1650SN</tr><tr><td>Energizer 9V Alkaline</td><td>Batterie Energizer Holdings Inc.</td><td>EN22</td><td></td></tr><tr><td>Hitech HS-82MG Mikro-Servomotor, 3,4 kg/cm Abtriebsdrehmoment @ 6V</td><td>Hitech RCD USA Inc.</td><td>32082S</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Firma</td><td>Katalognummer</td><td>Bemerkungen</td></tr><tr><td>28 cm Kunststoff-Kabelbinder</td><td>General Electric Inc.</td><td>50725</td><td></td></tr><tr><td>Klebeband</td><td>3M Inc.</td><td>3939</td><td></td></tr><tr><td>littleBits mit 1 Draht</td><td>littleBits Inc.</td><td>w1 Draht</td><td></td></tr><tr><td>littleBits p1 Leistung</td><td>littleBits Inc.</td><td>p1 Stromversorgung</td><td></td></tr><tr><td>littleBits i2 Kippschalter</td><td>littleBits Inc.</td><td>i2 Kippschalter</td><td></td></tr><tr><td>littleBits 011 Servo</td><td>littleBits Inc.</td><td>011 Servo</td><td></td></tr><tr><td>20 cm kunststoffummantelte Drahtbindebinder</td><td>Four Star Plastics</td><td>71TIE8000</td><td></td></tr><tr><td>Tris(2,2&prime;-bipyridyl)dichloruthenium(II)-hexahydrat</td><td>Sigma-Aldrich Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> 224758 <tr><td>Ammonium-Cer(IV)-nitrat</td><td>Sigma-Aldrich Inc.</td><td>22249</td><td></td></tr><tr><td>Isofluoran</td><td>Baxter Healthcare</td><td>1001936060</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PBS1</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2854</td><td></td></tr><tr><td>Triethylamin</td><td>Sigma-Aldrich Inc.</td><td>T0886</td><td></td></tr><tr><td>Wasser</td><td></td><td></td><td>Das Wasser wurde mit einem Milipore Mili-Q (R &ge; 18 M&Omega;)</td></tr><tr><td>Weibliche nackte (gezüchtete) Mäuse</td><td>Jackson Laboratories</td><td>1929</td><td>Alter 5 - 6 Wochen</td></tr><tr><td>Stamm C57BL/6J&nbsp; &nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NU/J männliche Mäuse bei&nbsp;</td><td>Jackson Laboratories</td><td>2019</td><td>Alter 6 &ndash; 8 Wochen</td></tr><tr><td>IVIS 200 Biolumineszenz-Lesegerät</td><td>Caliper Live Science</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Live Image 4.2 Software</td><td>Perkin-Elmer</td><td>128165</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger</td><td>ThermoScientific</td><td>4951PLUS4</td><td></td></tr></tbody></table>

eine neue technik zur erzeugung und observing chemilumineszenz in einem biologischen rahmen

A Novel Technique for Generating and Observing Chemiluminescence in a Biological Setting

Intraoperative bildgebende Verfahren haben das Potenzial, chirurgische Eingriffe sicherer und effektiver zu machen; aus diesen Gründen halten solche Techniken schnell Einzug in den Operationssaal. Hier stellen wir einen neuen Ansatz vor, der eine Technik nutzt, die für die intraoperative Bildgebung noch nicht erforscht wurde: die Chemilumineszenz-Bildgebung. Bei dieser Methode wird ein Chemilumineszenz-Reporter auf Rutheniumbasis zusammen mit einem speziell angefertigten Vernebelungssystem verwendet, um ex vivo- oder in vivo-Bilder mit hohen Signal-Rausch-Verhältnissen zu erzeugen. Der auf Ruthenium basierende Reporter erzeugt Licht, nachdem er einer wässrigen Oxidationslösung und einer Rereduktion im umgebenden Gewebe ausgesetzt wurde. Diese Methode hat es uns ermöglicht, Reporterkonzentrationen von nur 6,9 pmol/cm2 zu detektieren. In dieser Arbeit präsentieren wir einen visuellen Leitfaden für unsere Proof-of-Concept-In-vivo-Studien mit subdermalen und intravenösen Injektionen bei Mäusen. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass diese Technologie ein vielversprechender Kandidat für die weitere präklinische Forschung ist und letztendlich zu einem nützlichen Werkzeug im Operationssaal werden könnte.

Der Vernebler in Protokoll Abschnitt 1 kann aus leicht erhältlichen Materialien zu geringen Kosten konstruiert werden. Es ist beabsichtigt , der Reduktions- / Oxidationsmittel in einem Biolumineszenz - Lesegerät (1) ein Einsatz für Fern ausgelöst werden Aufsprühen. Unser Design ermöglicht den sicheren Betrieb des Zerstäubers innerhalb des Biolumineszenz-Lesegerät bei einem 14 cm Abstand von der Linse. Kein Beschlagen oder Verschwimmen der Linse wurde während der Operatio...

Dieses Protokoll beschreibt eine neue intraoperative Bildgebungstechnik, die einen Rutheniumkomplex als Quelle für Chemilumineszenz-Lichtemission verwendet und dadurch hohe Signal-Rausch-Verhältnisse während der in vivo-Bildgebung erzeugt. Die intraoperative Bildgebung ist ein expandierendes Gebiet, das die Art und Weise, wie chirurgische Eingriffe durchgeführt werden, revolutionieren könnte.

Eine neue Technik zur Erzeugung und Observing Chemilumineszenz in einem biologischen Rahmen

Intraoperative imaging techniques have the potential to make surgical interventions safer and more effective; for these reasons, such techniques are ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, ein neues präklinisches, interoperatives, chemilumineszierendes Bildgebungsverfahren anzubieten, das Vorteile gegenüber bestehenden optischen Techniken in Bezug auf Signal-Rausch-Verhältnisse und Nachweisgrenzen bieten kann. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen zu beantworten, die mit herkömmlichen optischen Bildgebungsverfahren in vielen Bereichen der Biowissenschaften nicht zugänglich waren. Die Hauptvorteile dieser Technik bestehen darin, dass sie ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis aufweist und weder sofortiges Licht noch Strahlung benötigt.Was wir also herausgefunden haben, ist, dass sich die Implikationen dieser Technik aufgrund der hohen Signal-Rausch-Verhältnisse, die diese Technik zu bieten hat, wirklich auf die interoperative Bildgebung mehrerer Krankheitszustände, einschließlich Krebs, erstrecken. Da für diese Technik kein einfallendes Licht benötigt wird, gibt es keine Probleme mit der Absorption des auffallenden Lichts. Darüber hinaus steht ein großer chemischer Werkzeugkasten zur Verfügung, um das chemilumineszierende Kernmolekül zu funktionalisieren.Bereiten Sie zu Beginn des Verfahrens 100 Mikroliter Standardlösungen von Tris(bypiridin)ruthenium(II)chlorid in Umkehrosmosewasser vor. Kombinieren Sie dann jeden Standard mit 100 Mikrolitern einer 25 millimolaren Lösung von Ammonium-Cer-Nitrat in Umkehrosmosewasser auf einem Objektträger. Öffnen Sie die Biolumineszenz-Reader-Bildgebungssoftware und klicken Sie auf Initialisieren.Stellen Sie im Bildgebungsmodus sicher, dass Lumineszenz und Foto aktiviert und fluoreszierend deaktiviert sind. Legen Sie die Parameter für die Lumineszenzbelichtungszeit, das Binning, die Blende und den Emissionsfilter fest. Legen Sie die Belichtungszeit, das Binning und die Blende-Parameter für das Foto fest.Stellen Sie dann die Höhe des Motivs entsprechend der abzubildenden Probe ein. Stellen Sie das Sichtfeld auf B ein, um einen Abstand von 14 Zentimetern zwischen der Kamera und dem Probentisch zu erreichen. Decken Sie den Boden der Bildgebungskammer des Biolumineszenz-Readers im Probentisch mit schwarzem Tonpapier ab.Legen Sie dann den ersten Objektträger mit dem Tröpfchen der Standardmischung auf den Probentisch, wobei das Tröpfchen mittig im grünen Fadenkreuz des Leuchtkastens liegt. Füllen Sie als Nächstes die Drei-Unzen-Sprühflasche eines speziell angefertigten Verneblers mit der 1:3-Lösung von Triethylamin in einer 50/50-Lösung aus Wasser und Ethanol. Stellen Sie sicher, dass sich keine Luftblasen im Aspirationsrohr befinden.Platzieren Sie die Verneblerbaugruppe in der Bildgebungskammer, wobei die Sprühdüse auf das abzubildende Tröpfchen gerichtet ist, ohne die Kamerasicht auf das Tröpfchen zu behindern. Stellen Sie sicher, dass der Netzschalter und die Betriebsanzeige des Verneblers eingeschaltet sind, der magnetische Kippschalter ausgeschaltet ist und sich der Netzvernebler und die Kabel der Fernbedienung nicht verheddert haben. Decken Sie Hot Spots wie Markierungen auf der Folie mit kleinen Stücken schwarzem Bastelpapier ab.Platzieren Sie mindestens 40 Zentimeter des Kabels der Verneblerfernbedienung in der Bildgebungskammer. Schließen Sie die Kammertür vorsichtig, ohne die Verneblerkabel zu quetschen. Klicken Sie in der Gerätesoftware auf Erwerben, aktivieren Sie das automatische Speichern und legen Sie den Pfad der Datendatei fest.Starten Sie die Bildgebungssequenz. Wenn sich der Verschluss mit einem hörbaren Klicken öffnet, schalten Sie den Vernebler dreimal um, um drei Stöße Triethylaminlösung auf die Probe zu sprühen. Wiederholen Sie den Vorgang mit jedem Standardobjektträger, um die minimal nachweisbare Konzentration des Ruthenium-Bildgebungsmittels zu bestimmen.Um das In-vivo-Bildgebungsverfahren zu beginnen, bereiten Sie 100 Mikroliter einer Lösung vor, die zwischen 8 und 33 Nanomol Tris(bypiridin)ruthenium(II)chlorid in phosphatgepufferter Kochsalzlösung enthält. Bereiten Sie eine wässrige 25-Millimola-Lösung von Ammonium-Cer-Nitrat vor. Als nächstes injizieren Sie intravenös 100 Mikroliter des Ruthenium-Bildgebungsmittels in die Schwanzvene gesunder Mäuse.Die Mäuse werden 10 Minuten nach der Injektion durch Kohlendioxid-Erstickung getötet. Entfernen Sie die Haut vom Rumpf mit einem Y-Schnitt und entfernen Sie dann den Rippenbogen, um Herz und Lunge freizulegen. Schneiden Sie einen Auslass in den rechten Vorhof und injizieren Sie 20 Milliliter PBS durch eine 24-Gauge-Nadel in den linken Ventrikel.Schneiden Sie durch die Bauchhaut, um Niere und Leber freizulegen. Wenn es sich bei dem interessierenden Organ um die Leber, die Niere oder die Milz handelt, machen Sie einen sichtbaren Längsschnitt durch das Organ. Bereiten Sie eine neue Bildgebungssequenz in der Biolumineszenz-Reader-Software vor.Platzieren Sie die Maus für die Bildgebung des gesamten Bauches in der Bildgebungskammer, wobei der offene Bauch zur Kamera und der Kopf zur Rückseite des Instruments zeigt. Zentrieren Sie das interessierende Organ im grünen Fadenkreuz. Waschen Sie die Sprühflasche und die Düse gründlich aus der Verneblerbaugruppe aus und füllen Sie die Flasche dann mit der Ammonium-Cer-Nitrat-Lösung.Platzieren Sie den Vernebler in der Bildgebungskammer, wobei die Sprühdüse auf die Bildgebungsstelle gerichtet ist. Stellen Sie sicher, dass die Kamera frei ist, sich die Kabel nicht verheddern und sich mindestens 40 Zentimeter des Fernkabels in der Kammer befinden. Schließen Sie die Kammer und starten Sie die Bildgebungssequenz.Wenn sich der Verschluss mit einem Klick öffnet, schalten Sie den Schalter dreimal um, um drei Stöße des Oxidationsmittels auf die Bildgebungsstelle zu sprühen. Entfernen Sie nach der Bildgebung die Verneblerbaugruppe und spülen Sie die Sprühdüse gründlich aus, um eine Kristallisation des Ammonium-Cernitrats zu verhindern. Für die anschließende Bildgebung und Quantifizierung einzelner Organe nehmen Sie die Maus aus dem Instrument und entfernen die inneren Organe ausgehend von der offenen Körperhöhle.Schneiden Sie durch die Haut der Hinterbeine, um Muskelgewebeproben zu entfernen. Wenn das interessierende Organ die Leber, Niere oder Milz ist, schneiden Sie das Organ in Längsrichtung in zwei Hälften. Legen Sie dann das Organ auf eine Petrischale oder ein Stück schwarzes Bastelpapier.Stellen Sie jedes Organ auf die gleiche Weise wie das ganze Tier dar und spülen Sie die Sprühdüse nach jeder Sequenz. Bei diesem Verfahren wurde Mäusen ein bildgebendes Mittel auf Rutheniumbasis injiziert und das Gewebe von Interesse mit einem Oxidationsmittel besprüht, um eine Chemilumineszenz zu induzieren. Die minimal nachweisbare Konzentration des bildgebenden Mittels wurde unter diesen Bedingungen mit 6,9 Pikomolen pro Quadratzentimeter bestimmt.Chemilumineszenz-in-Weißlicht-Bilder der interessierenden Organe wurden mit einem Biolumineszenz-Reader aufgenommen. Das Chemilumineszenzsignal wurde überwiegend in den Nieren nach intravenöser Injektion beobachtet, was auf eine renale Elimination des hydrophilen Tris(bypiridin)ruthenium(II)kations hinweist. Das Signal-Rausch-Verhältnis des bildgebenden Mittels gegenüber PBS allein betrug 27:1 in den Nieren und 21:1 in der Leber.Kniekehlenlymphknoten der Maus wurden ebenfalls mit einer subkutanen Injektion einer konzentrierteren Lösung des rutheniumbasierten Bildgebungsmittels untersucht. Die Lymphknoten, die das bildgebende Mittel enthielten, zeigten eine signifikant höhere Ausstrahlung als die Lymphknoten, die nur PBS enthielten. Einmal gemeistert, kann diese Technik in zwei Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, Umgebungslicht auszuschließen und eine Kontamination mit Ruthenium tris bpy zu vermeiden. Nach ihrer Entwicklung wird diese Technik Forschern auf dem Gebiet der biomolekularen Bildgebung den Weg ebnen, um Krankheitszustände wie Krebs bei Mäusen zu erforschen. Obwohl diese Methode Einblicke in Fragen geben kann, die mit herkömmlichen optischen Bildgebungsverfahren nicht zugänglich waren, kann jede Frage, die mit herkömmlichen Techniken untersucht werden könnte, möglicherweise mit Chemilumineszenz beantwortet werden.

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Research

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Bioengineering

Biotechnik

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