Das Auslösen Zellstress und Tod unter Verwendung von herkömmlichen UV-Laser konfokale Mikroskopie

Das übergeordnete Ziel dieses Zellablationsansatzes ist es, einzelne Zellen in Zellkulturen oder in lebenden Tieren selektiv zu belasten oder abzutöten. Diese Methode ermöglicht es den Forschern, das Schicksal einer einzelnen sterbenden Zelle und die Reaktion von Zellen wie Mikroglia und Astrozyten auf die umgebende Ablationsstelle zu untersuchen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass einzelne Zellen präzise anvisiert werden können, und dass dies mit einem normalen konfokalen Mikroskop erreicht werden kann, das mit einem 405-Nanometer-Laser ausgestattet ist.

Wir verwenden den Zebrafisch als Modellsystem, um neurodegenerative Erkrankungen wie die Motoneuronenkrankheit oder die frontotemporale Demenz zu untersuchen. Die Visualisierung des Todes eines Motoneurons und der daraus resultierenden Folgen bietet eine hervorragende Möglichkeit, die dynamischen Prozesse bei Krankheiten besser zu verstehen. Unser Ansatz, zellulären Stress dosisabhängig zu verursachen, ermöglicht eine detaillierte Charakterisierung zellulärer Interaktionen.

Zum Beispiel die Beseitigung von Mikroglia nach dem Tod von Menschen. Diese Methode gibt zwar Einblicke in die Krankheitsmechanismen eines lebenden Organismus, kann aber auch in Kultur in isolierten Zellen in ähnlicher Weise angewendet werden. Nachdem Sie männliche und weibliche transgene Linien für die Paarung gemäß dem Textprotokoll eingerichtet haben, verwenden Sie ein Teesieb aus Plastik, um die Embryonen nach erfolgreichem Laichen zu sammeln, indem Sie das Aquarienwasser abseihen.

Spülen Sie die Eier dann mit Eiwasser ab und geben Sie sie in Eiwasser in eine Petrischale. Untersuchen Sie die Embryonen unter einem Lichtmikroskop, um die Befruchtung zu bestimmen. Dann befruchtete Eier bei 28 Grad Celsius ausbrüten.

Wenn die Embryonen zwei bis fünf Tage nach der Befruchtung oder DPF erreicht sind, legen Sie sie unter ein Fluoreszenz-Verbindungsmikroskop und untersuchen Sie die Embryonen auf eine geeignete Fluorophor-Expression. Trennen Sie dann den hell etikettierten Fisch zum späteren Einbetten in eine frische Schüssel mit Eiwasser. Um Zebrafische in Agarose einzubetten, bereiten Sie eine Anästhesielösung vor, indem Sie vier Gramm MS 222 pro Liter tropfenweise in eine Petrischale mit Eiwasser geben.

Bereiten Sie eine Brühe mit niedrigschmelzender Agarose und Eiwasser vor und aliquotieren Sie es in 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Legen Sie ein Aliquot in einen 38 bis 40 Grad Celsius heißen Heizblock und lassen Sie es äquilibrieren. Für Bildgebungszeiten von mehr als vier Stunden pipettieren Sie etwa 300 Mikroliter Agarose entlang des inneren Kreises einer Schale mit Glasboden, um einen Donut-förmigen Kreis mit einer kleinen Öffnung in der Mitte herzustellen.

Um den Zebrafisch für die Mikroskopie in Agarose zu montieren, ziehen Sie nach der Betäubung des Fisches gemäß dem Textprotokoll mit einer verstellbaren Pipette eine Larve auf und lassen Sie sie auf den Boden der Spitze sinken. Lassen Sie die Larve in einem minimalen Volumen Flüssigkeit in die vorgewärmte Agarose fallen. Dann ziehen Sie den Fisch mit Agarose auf und geben ihn schnell in eine zuvor vorbereitete 35-Millimeter-Schale mit Glasboden.

Positionieren Sie das Tier oder mehrere Tiere unter einem Präpariermikroskop mit einem handelsüblichen Pinsel auf der Seite, so dass Körper und Schwanz flach sind. Lassen Sie den eingebetteten Fisch 10 bis 15 Minuten ruhen, bis die Agarose fest ausgehärtet ist. Verwenden Sie dann etwa zwei Milliliter Eiwasser mit Tricain, um die 35-Millimeter-Petrischale vorsichtig aufzufüllen.

Platzieren Sie die Petrischale mit einer eingebetteten Larve auf dem konfokalen Mikroskoptisch und fokussieren Sie mit Hellfeldbeleuchtung und 40-facher Vergrößerung auf die dorsale Seite des Rückenmarks des Tieres. Wechseln Sie zu einer geeigneten Fluoreszenzeinstellung und visualisieren Sie die interessierende Struktur, um zu bestätigen, dass alle Bildgebungsparameter für die nachfolgende Ablation erforderlich sind. Um die Dicke der Struktur für die UV-Laserablation zu bestimmen, verwenden Sie den Z-Antrieb, um die Ober- und Unterseite der interessierenden Struktur zu überprüfen, indem Sie manuell nach oben und unten fokussieren.

Zeichnen Sie die Z-Ebene, die abgetragen werden soll, manuell auf. Zum Beispiel die Mitte der Zelle. Um eine Laserablation durchzuführen, starten Sie den FRAP-Assistenten, indem Sie auf das Dropdown-Menü oben im Software-Menü klicken.

Bestimmen Sie im neuen Fenster die Bildparameter für den Ablationsansatz, indem Sie das Format, die Scangeschwindigkeit und die Mittelwertbildung auswählen. Wenn die Z-Ebene für die Ablation noch nicht ausgewählt wurde, drücken Sie die Live-Taste und fokussieren Sie durch die Probe, bis die fluoreszierende Struktur oder die gewünschte Z-Ebene, die abgetragen werden soll, scharf ist. Sobald die allgemeinen Bildparameter eingestellt sind, greifen Sie auf den Schritt Bleichen zu, um die spezifischen Ablationskomponenten zu steuern.

Aktivieren Sie dann den 405-Nanometer-Laser, indem Sie ihn für das Bleichverfahren aktivieren. Verwenden Sie anschließend die Option Vergrößern, um die Bleichintensität bei ausgewähltem ROI zu maximieren, indem Sie das Scanfeld reduzieren und so die Verweilzeit maximieren. Wählen Sie einen oder mehrere ROIs für die Ablation aus, indem Sie eines der Zeichenwerkzeuge im Bildaufnahmefenster verwenden.

Zielen Sie zum Beispiel mit dem kreisförmigen Zeichenwerkzeug von etwa vier bis acht Mikrometern auf den Axonhügel. Nachdem Sie den ROI festgelegt haben, wählen Sie die Schaltfläche Zeitverlauf und bestätigen Sie die Anzahl der Zyklen, in denen die ROIs gescannt und abgetragen werden. Wählen Sie je nach Wunsch die Rahmen Pre-Bleach und Post-Bleach, um kurz vor und unmittelbar nach dem Bleaching-Prozess einen Überblick über das Gesamtbild zu erhalten.

Diese Einstellungen ermöglichen Forschern mehrere Verfeinerungsebenen. Durch die Anpassung der Laserleistung, der Scangeschwindigkeit, der Zeilenmittelwertbildung, der Größe des interessierenden Bereichs und der Wiederholungen bietet diese Technik ein hohes Maß an Freiheit, um Stress oder Tod in einzelnen Zellen zu verursachen. Nachdem Sie alle erforderlichen Ablationsparameter festgelegt haben, drücken Sie auf Experiment ausführen und überwachen Sie die Effizienz der Ablation.

Weitere Informationen finden Sie im Textprotokoll. In diesem Experiment wurde eine UV-Laserablation an GFP-exprimierenden Motoneuronen im Rückenmark von transgenen Zebrafischen durchgeführt. Die GFP-Expression, die von Motoneuronen-Promotoren wie 3 MINX one, IO one oder MET gesteuert wird, ermöglicht eine hochauflösende Visualisierung der Zellkörper, der Hauptaxone und der peripheren Äste, die sich bis zu den Muskeln erstrecken.

Eine erfolgreiche Ablation von Neuronen im Rückenmark wurde erreicht, wenn die Fluoreszenz unmittelbar nach der Ablation nachlässt und nie wieder aufgenommen wird. Die Spezifität dieses Ansatzes wird bestätigt, wie hier gezeigt, wo ein einzelnes Zielneuron mit dem photokonvertierbaren Photofluro Kaede umgewandelt wurde, das seine Emission nach Exposition gegenüber UV-Licht von grün auf rot umschaltet. Um Zellen mit unterschiedlichen Intensitäten anzusprechen, stehen mehrere Feinabstimmungsebenen zur Verfügung, indem die Laserleistung, die Scangeschwindigkeit, die Zeilenmittelung, die Größe des abzutragenden ROI und die Wiederholungen angepasst werden.

Wie hier gezeigt, zeigten Motoneuronen mit langen axonalen Projektionen, die am Soma mit niedrigeren UV-Laserintensitäten abgetragen wurden, charakteristisches Blöken, das sich vom Soma entlang des Axons über die Zeit fortsetzte. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass jedes konfokale Setup einzigartig ist und dass die Laserleistung für jedes Instrument spezifisch ist und unterschiedlich sein kann. Nach dem Eingriff sind charakteristische Merkmale des apoptotischen Zelltods in den ablierten Neuronen zu sehen.

Apoptotische Marker wie XN 5 oder morphologische Veränderungen wie somale Degeneration oder externes Bläschen können reproduzierbar nachgewiesen werden. Zusätzliche Tests können durchgeführt werden, um weitere Fragen zu beantworten, z. B. wie die Schwimmleistung durch die Ablation einzelner oder mehrerer Neuronen im Rückenmark beeinflusst wird. Durch die Kreuzung verschiedener transgener Zebrafischlinien können Forscher die Reaktion anderer Zellen auf die laserinduzierte Zellzerstörung untersuchen.

Diese Methoden bieten eine einzigartige experimentelle Plattform, um die genauen molekularen Mechanismen einer Krankheit wie MND in vivo zu verstehen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Zebrafische auf die konfokale Mikroskopie vorbereitet und wie man eine Einzelzell-UV-Laserablation durchführt.