توليف 1،2-Azaborines وإعداد مجمعات البروتين مع T4 الليزوزيم المسوخ

الهدف العام من هذا البروتوكول هو وصف طريقة عامة لتصنيع 1 ، 2-Azaborines ، وتطبيقها المحتمل في البحوث الطبية الحيوية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تظهر توليفا أكيدا لمركبات 1 ، 2-azaborine ، وهي عبارة عن بورون مدمج يحتوي على نظائر من شكل البنزين في كل مكان. يمكن زيادة تشغيل السلائف الموصوفة إلى جزيئات يحتمل أن تكون أكثر تعقيدا.

سيعطي تحضير مجمعات البروتين التي تحتوي على 1 ، 2-azaborine نظرة ثاقبة للتطبيق المستقبلي في البحوث الطبية الحيوية. لبدء هذا الإجراء، قم بإعداد المنتج المغلق بالحلقة كما هو موضح في بروتوكول النص. أضف 14 جراما من البلاديوم على الكربون إلى هذا المنتج المحضر في التولوين.

ثم قم بإزالة القارورة من الصندوق. قم بتركيب القارورة بمكثف ارتجاع مجفف بالفرن 24/40 تم تطهيره بالنيتروجين ومجهز بالماء المبرد. ضع القارورة في حمام زيت ، وقم بتسخين التفاعل مع الارتجاع القوي عند 135 درجة مئوية أثناء التحريك.

حافظ على رد الفعل عند الارتجاع لمدة 16 ساعة. بعد ذلك ، قم بإزالة القارورة من حمام الزيت لتبريد التفاعل مع درجة حرارة الغرفة. بمجرد أن يبرد ، استبدل مكثف الارتجاع بالحاجز الموجود على قارورة التفاعل.

باستخدام حقنة مجهزة بإبرة Luer Lock المجففة بالفرن ، اسحب كمية 5 ملليلتر. انقل الكمية إلى أنبوب الرنين المغناطيسي النووي اللولبي. تحليل العينة عبر Boron-11 NMR.

إذا كان التفاعل غير مكتمل ، فقم بنقل قارورة التفاعل إلى صندوق القفازات. ثم أضف ثلاثة جرامات إضافية من البلاديوم على الكربون. بعد ذلك ، قم بإزالة القارورة من صندوق القفازات.

قم بتركيب القارورة بمكثف ارتجاع 24/40 تم تطهيره بالنيتروجين ومجهز بالماء المبرد. باستخدام حمام الزيت ، قم بتسخين التفاعل مع الارتجاع القوي عند 135 درجة مئوية مع التقليب لمدة 24 ساعة. باستخدام Boron-11 NMR ، قم بتحليل كمية أخرى للتأكد من اكتمال التفاعل.

بعد ذلك ، انقل قارورة التفاعل مرة أخرى إلى صندوق القفازات. مرر خليط التفاعل عبر عمود كروماتوغرافيا فلاش مليء بمناديل ورقية. بعد ذلك ، اجمع المرشح في قارورة دائرية القاع سعة لتر واحد مزودة بقضيب تحريك.

اغسل العمود ب 50 مل من التولوين. قم بإزالة وعاء الترشيح من صندوق القفازات وقم بتوصيله بمشعب غاز مفرغ مزود بخط نيتروجين. ضع حماما مائيا أسفل القارورة ، وديوار يحتوي على النيتروجين السائل لاحتجاز المذيبات.

افتح صمام التفريغ العالي لبدء إزالة جميع المواد المتطايرة من المرشح. ثم أعد خليط التفاعل إلى صندوق القفازات. انقلي المزيج إلى قارورة مستديرة القاع مجففة بالفرن 24/40 250 مل مع شريط تقليب.

اشطف خليط التفاعل المتبقي بثنائي كلورو ميثان ، وانقله إلى القارورة. قم بتغطية القارورة بحاجز. انقل القارورة من صندوق القفازات إلى مشعب التفريغ ، وقم بتوصيله.

افتح صمام التفريغ العالي لإزالة المذيب المتبقي. بعد ذلك ، قم بإزالة الحاجز بسرعة وإضافة هيدريد الكالسيوم باستخدام مغرفة. قم بتوصيل القارورة المستديرة السفلية بجهاز التقطير المفصل في بروتوكول النص ، واضبط درجة حرارة حمام الزيت على 100 درجة مئوية.

بعد اكتمال التقطير ، قم بإزالة مصدر الحرارة وتبريد الجهاز إلى درجة حرارة الغرفة. أعد ضغط الجهاز المبرد بالنيتروجين ، وأغلق صمام التوصيل بإحكام على قارورة التخزين الخالية من الهواء. بعد نقل المنتج المعزول من القارورة إلى قارورة في صندوق القفازات ، قم بتخزين القارورة في الثلاجة صندوق القفازات.

بعد تنقية البروتين ، انقل المحلول المنقى إلى أنبوب غشاء غسيل الكلى. ضع أنبوب غسيل الكلى في صندوق يحتوي على محلول سعة أربعة لترات من فوسفات الصوديوم 100 ملليمولار ، و 550 مللي مولار كلوريد الصوديوم ، و 02٪ أزيد الصوديوم. يقلب طوال الليل عند أربع درجات مئوية.

في اليوم التالي ، أضف 2-mercaptoethanol إلى العينة التي تم تحليلها ، بحيث يكون التركيز النهائي خمسة مللي مولار. بعد ذلك ، استخدم مكثف الطرد المركزي لتركيز المحلول على 40 ملليغرام لكل مليلتر. قم بتدوير العينة عند 5 ، 000 دورة في الدقيقة وست درجات مئوية ، وقم بإزالة أي راسب بعد التركيز.

بعد ذلك ، في صفيحة مكونة من 24 بئرا ، قم بإعداد ظروف مختلفة مع محلول الخزان ، كما هو موضح في بروتوكول النص. استخدم الشحوم لإحكام الإغلاق عن طريق وضعه على حافة كل بئر. امزج خمسة ميكرولترات من محلول البروتين المركز مع خمسة ميكرولترات من محلول الخزان على شريحة غطاء زجاجي من السيليكون.

ضع شريحة الغطاء رأسا على عقب فوق الآبار التي تحتوي على محلول الخزان. قم بتخزين الطبق على حرارة 4 درجات مئوية لنمو البلورات. باستخدام حلقة من الأنابيب المبردة ، اختر البلورات المزروعة وضعها في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 6 ملليلتر.

أضف 50 ميكرولتر من الخمور الأم. ثم انقل الأنبوب إلى صندوق القفازات. انقل خمسة ميكرولترات من رابط الآزابورين المحضر إلى داخل الغطاء المفاجئ للأنبوب.

قم بتغطية الأنبوب ، واحفظه في الثلاجة داخل صندوق القفازات لمدة يومين إلى سبعة أيام لتحقيق التوازن عن طريق انتشار البخار. بعد ذلك ، قم بإيداع قطرة من N Paratone على شريحة زجاجية. باستخدام ماصة صغيرة ، انقل بلورة إلى الشريحة.

بعد ذلك ، استخدم حلقة من الأنابيب المبردة لالتقاط البلورة ونقلها من المحلول المائي إلى N Paratone. اغمر البلورة المحمية ب N Paratone في ديوار يحتوي على النيتروجين السائل. باستخدام ملقط مبرد ، قم بتركيب البلورة المجمدة على الحلقة.

بعد ذلك ، قم بتحليل البيانات البلورية التي تم جمعها كما هو موضح في بروتوكول النص. في هذه الدراسة ، يتم تقديم توليف معدل ل 1 ، 2-azaborines بناء على الطرق المبلغ عنها سابقا. يستخدم بورين ثلاثي الأليل لتحضير مقرب كلوريد الأليل N-allele NTBSB.

يتم استخدام تسلسل من خطوتين لتخليق NTBS BCl 1 ، 2-azaborine ، مما يؤدي إلى عائد معزول أعلى من الطرق السابقة. يتم تخليق N-H-B-ethyl-1 ، 2-azaborine في خطوتين ، باستخدام إيثيل الليثيوم بدلا من مركب الكروم المستخدم في الطرق المبلغ عنها سابقا. يتم تنقية البروتين باستخدام نظام كروماتوغرافيا منخفض الضغط.

يظهر الكروماتوجرام الذي يعمل على 280 نانومتر ذروة متوافقة مع طفرة T4 Lysozyme ، L99am102q. ثم يتبلور البروتين ويعقد مع الروابط. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن تخليق الآزابورين يتطلب استخدامات ظروف خالية من الهواء ، مثل صندوق القفازات ومشعب الغاز المفرغ ، لمنع تحلل المركبات.

بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق لاستكشاف الخصائص الكيميائية والفيزيائية الفريدة للأزابورين مقارنة بالعطريات الكربونية في جيوب استصلاح المساحات البيولوجية الكلاسيكية.