Synthese von biokompatiblen Liquid Crystal Elastomerschäume als Zellgerüste für 3D Spatial Zellkulturen

Ziel dieses Verfahrens ist es, biologisch abbaubare, dreidimensionale schaumartige Zellgerüste auf Basis biokompatibler Seitenketten-Flüssigkristallelastomere herzustellen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Flüssigkristalle und der Biomedizin zu beantworten, wie z. B. die Auswirkungen der Eigenschaften von Flüssigkristallelastomeren auf die Zellproliferation und -ausrichtung. Der Hauptvorteil dieser Methode der zweidimensionalen Zellgerüste besteht darin, dass sie die Untersuchung räumlicher Zell-Zell-Wechselwirkungen ermöglicht, was in 2D-Makroumgebungen nur selten möglich ist.

Im Allgemeinen werden diejenigen, die neu in dieser Methode sind, mit den taktilen Kompressionstests zu kämpfen haben. Die Idee zu dieser Methode hatten wir erst, nachdem wir bei Hunderten von Petrischalen das Medium wechseln mussten. Wir haben uns gefragt, ob Flüssigkristall-Elastomere Muskelzellen in einem 3D-Netzwerk unterstützen können, um die Verwendung so vieler Petrischalen zu eliminieren.

visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da einige Schritte eine sorgfältige Handhabung der Chemikalien erfordern. Darüber hinaus kann die Formgebung der Metallschaumschablone eine Herausforderung darstellen. Füllen Sie zunächst eine 20-Milliliter-Ampulle mit einer 2%-Vol.-Lösung von PFOTES in Toluol.

Rühren Sie die Lösung 24 Stunden lang in der Ampulle um, um das Innere der Ampulle zu silanisieren. Spülen Sie die silanisierte Ampulle mit Isopropylalkohol ab und trocknen Sie sie 30 Minuten lang bei 140 Grad Celsius. Geben Sie 3,64 Gramm destilliertes Epsilon-Caprolacton, 0,5 Gramm Alpha-Chlor-Epsilon-Caprolacton und 0,25 Milliliter Glycerin in die trockene Ampulle.

Die Mischung eine Minute lang verzerren. Fügen Sie dann 4,90 Gramm DL-Lactid zu der Mischung hinzu und spülen Sie die Ampullenatmosphäre eine Minute lang mit Stickstoffgas. Decken Sie die Ampullenöffnung mit Alufolie ab und erhitzen Sie die Mischung etwa zwei Stunden lang bei 120 Grad Celsius, um das DL-Lactid zu schmelzen.

Wirbeln Sie die Mischung ein, um ungeschmolzene Feststoffe aufzubrechen, und geben Sie dann 66 Mikroliter 10-2-ethylhexanoat in die Ampulle und wirbeln Sie erneut vortexen. Verschließen Sie die Ampulle mit Alufolie und erhitzen Sie die Mischung 10 Minuten lang bei 120 Grad Celsius, um das DL-Lactid wieder zu schmelzen. Sobald das DL-Lactid wieder geschmolzen ist, wird das Gemisch kräftig durchwirbelt und die Ampullenatmosphäre mit Stickstoffgas gespült.

Verschließen Sie die Ampulle mit einem Gummiseptum. Führen Sie eine Nadel, die mit einer Vakuumleitung verbunden ist, durch das Septum ein und starten Sie das Vakuum. Versiegeln Sie den Ampullenhals mit Flammen und achten Sie darauf, den Gummistopfen nicht zu schmelzen.

Sobald der Hals verschlossen ist, erhitzen Sie das Reaktionsgemisch 48 Stunden lang bei 140 Grad Celsius. Lassen Sie die Mischung dann auf Raumtemperatur abkühlen. Brechen Sie die Ampulle auf und lösen Sie das viskose Reaktionsgemisch in 10 Millilitern Dichlormethan auf.

Füllen Sie die Mischung in einen Scheidetrichter. Einen Kolben mit 100 Millilitern Methanol in ein Trockeneis- und Acetonbad stellen, um das Methanol auf etwa minus 78 Grad Celsius abzukühlen. Sobald das Methanol abgekühlt ist, wird der Scheidetrichter über dem Kolben befestigt.

Geben Sie das Reaktionsgemisch mit einer Geschwindigkeit von zwei Tropfen pro Sekunde zum kalten Methanol. Sammeln Sie den entstandenen weißen Niederschlag auf Filterpapier. Trocknen Sie den Niederschlag in einem Vakuumschrank zwischen 50 und 60 Grad Celsius, um das dreiarmige Alpha-Chlor-SBC-Produkt zu erhalten.

Zur Herstellung des dreiarmigen Alpha-Cholesteryl-SBC wird das hängende Chloratom durch ein Azid ersetzt. Eine Klick-Reaktion mit Cholesteryl-5-hexynoat führt zu einem hängenden Cholesteryl als Flüssigkristalleinheit. Um mit der Vorbereitung des Flüssigkristallelastomer-Gerüsts zu beginnen, kombinieren Sie 0,75 Gramm dreiarmiges Alpha-Cholesteryl-SBC mit 0,25 Millilitern HDI und 0,24 Millilitern destilliertem Epsilon-Caprolactton.

Fügen Sie dazu 60 Mikroliter 10-2-ethylhexanoat hinzu und wirbeln Sie die Mischung ein. Schneide dann ein ein mal vier Zentimeter großes Stück Nickel-Metallschaum aus. Rollen Sie den Nickelschaum zu einem Zylinder mit einem Durchmesser von einem Zentimeter und einer Höhe von einem Zentimeter, um eine Schablone für das Gerüst aus Flüssigkristall-Elastomerschaum zu bilden.

Legen Sie die Schablone in ein Glasfläschchen oder ein Aluminiumfoliengehäuse und gießen Sie die Flüssigkristallelastomermischung über die Schablone, bis sie vollständig bedeckt ist. Lassen Sie die Schablone zwei Minuten lang in der Flüssigkristall-Elastomermischung einwirken und entfernen Sie dann den Überschuss mit einer Pipette. Erhitze die Mischung und die Schablone über Nacht bei 80 Grad Celsius.

Ziehe dann die Alufolie ab oder zerbreche das Glas. Verwenden Sie eine Rasierklinge, um überschüssiges Flüssigkristallelastomer zu entfernen, um die Nickelmetallschablone freizulegen. Den Schaum in einen Kolben geben und 70 Milliliter einer gesättigten wässrigen Lösung von Eisen-3-chlorid hinzufügen.

Rühre den Schaum drei Tage lang bei Raumtemperatur in die Lösung, um die Nickelschablone aufzulösen. Rühren Sie den Schaum alle 24 Stunden 30 Minuten lang in entionisiertem Wasser und rühren Sie dann wieder in einer frischen Eisen-Dreichlorid-Lösung um. Nach dem zweiten Tag des Rührens ist ein taktiler Kompressionstest des Flüssigkristall-Elastomerschaums durchzuführen.

Die Beständigkeit gegen taktile Kompression zeigt an, dass die Nickelschablone noch im Schaum vorhanden ist. Nach dem dritten Tag wurden alle Nickelschablonen entfernt, und der resultierende Schaum erscheint sehr weich und lässt sich leicht vollständig komprimieren. Die Nickelschablone muss vollständig eliminiert werden.

Es ist wichtig, den Flüssigkristall-Elastomerschaum gründlich in Eisenchlorid abzuspülen, bis er sich weich anfühlt, wenn ein taktiler Drucktest durchgeführt wird. Das Gerüst aus Flüssigkristall-Elastomer-Schaum kann nun charakterisiert und verwendet werden. Sobald der Flüssigkristall-Elastomerschaum weich ist, spülen Sie ihn mit 70 % Ethanol ab, um ihn zu sterilisieren.

Um mit der Aussaat zu beginnen, waschen Sie die Gerüste aus Flüssigkristall-Elastomerschaum erneut zweimal in einem Milliliter 70 % Ethanol, um die Elastomeroberflächen zu sterilisieren. Bestrahlen Sie dann die Gerüste 10 Minuten lang mit UV-Licht. Waschen Sie die Gerüste mit einer weiteren Milliliterportion 70%Ethanol.

Spülen Sie die Gerüste mit je einem Milliliter sterilem Wasser und phosphatgepufferter Kochsalzlösung. Laden Sie die sterilisierten Flüssigkristallelastomer-Gerüste in 24-Well-Kulturplatten. Bereiten Sie eine Suspension der interessierenden Zellen in dem geeigneten Zellwachstumsmedium mit Penicillin und Streptomycin vor und zählen

Verdünnen Sie die Zellsuspension auf 1,5 mal 10 bis fünfte Zellen pro 100 Mikroliter mit Wachstumsmedium. Einen Tropfen verdünnter Zellsuspension auf jedes Flüssigkristall-Elastomergerüst geben. Inkubieren Sie die ausgesäten Flüssigkristallelastomer-Gerüste bei 37 Grad Celsius in einer Atmosphäre von 5 % CO2 für zwei Stunden.

Geben Sie weitere 0,5 Milliliter Wachstumsmedium in jedes Gerüst und setzen Sie die Inkubation fort. Waschen Sie die ausgesäten Gerüste alle 48 Stunden mit einem Milliliter PBS und fügen Sie frisches Wachstumsmedium hinzu. Inkubieren Sie die Gerüste weiter, bis die Zellen für die Mikroskopie bereit sind.

Diese smetischen LCs ermöglichen die Untersuchung komplexer Gewebekonstrukte und fördern gleichzeitig das Zellwachstum und die Zellproliferation. Um die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhalten, müssen die Schäume sterilisiert und die Sauberkeit der Kulturen jederzeit gewahrt werden. Zur Vorbereitung auf die Mikroskopie fixieren Sie die Zellen 15 Minuten lang mit einer Lösung aus 4% Paraformaldehyd in PBS auf den Gerüsten.

Weichen Sie die Proben dreimal fünf Minuten lang in drei Millilitern PBS ein. Legen Sie eine Gerüstprobe in ein Eppendorf-Rohr. Färben Sie die Probe 10 Minuten lang mit einer Lösung von 0,1 % DAPI in 500 Mikrolitern PBS.

Weichen Sie die Probe zweimal fünf Minuten lang in einem Milliliter PBS ein. Und dann wird die Probe sofort mit konfokaler Mikroskopie abgebildet. Erfassen Sie Bildstapel, die sich über die Stichprobe erstrecken, und analysieren Sie die Daten in einem Bildverarbeitungsprogramm.

Ein dreiarmiger SBC mit Flüssigkristallanteilen wurde auf eine Nickelschaumschablone mit HDI als Vernetzer gegossen. Die Nickelschablone wurde durch Ätzen entfernt, um den Flüssigkristall-Elastomerschaum zu erhalten. Zur Überwachung des Ätzprozesses wurden regelmäßig Druckverformungsversuche durchgeführt.

Nachdem das Nickel vollständig aufgelöst war, zeigte der Druckverformungstest eine Verringerung der Zerkleinerung um 70 % beim Verdichten. Beim Lösen der Kompression nahm der Flüssigkristall-Elastomerschaum seine ursprüngliche Größe und Form wieder auf. Dieses Verhalten wird auf die Flüssigkristallanteile zurückgeführt, da sich ähnliche Elastomerschäume, denen der Cholesterin-Epsilon-Caprolacton-Anteil fehlte, durch die Kompression nicht erholten.

Die SCM der internen Schaummorphologie zeigte ein miteinander verbundenes Netzwerk von hohlen Schaumstoffstreben. Die regelmäßige Morphologie wurde auf die Struktur des Nickelschaums zurückgeführt, was darauf hindeutet, dass die Porengröße und die Gesamtform durch die Auswahl einer geeigneten Metallschablone gesteuert werden können. Der Schaum wurde mit Neuroblastomzellen besiedelt, die sich innerhalb von zwei Tagen an den Wänden des Netzwerks festsetzten.

30 Tage nach der Aussaat zeigte die konfokale Mikroskopie, dass sich die Zellen über das Flüssigkristall-Elastomer-Netzwerk erstreckten und mehrere Schichten gebildet hatten, die über den Elastomerschaum verteilt waren. Es wurde eine Verlängerung der Zellkerne beobachtet, die mit der Zellausrichtung korrelierte. Einmal gemeistert, kann diese Technik innerhalb von drei bis vier Wochen durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Flüssigkristall-Elastomer-Zellgerüste mit bestimmten Porengrößen und Morphologien entwirft und vorbereitet. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, jedes Produkt vollständig zu charakterisieren und die Lebensfähigkeit und Expansion der Zellen zu überwachen. Darüber hinaus ist die richtige Färbetechnik wichtig, um auf einfache Weise konfokale Mikroskopiebilder zu erhalten.

Nach diesem Verfahren können Flüssigkristallelastomere auch äußeren Reizen wie Stress oder magnetischen und elektrischen Feldern ausgesetzt werden, um zusätzliche Fragen darüber zu beantworten, wie sich die anisotrope molekulare Ordnung der Flüssigkristallelastomere auf die Zellantwort auswirkt. Die Implikationen dieser Technik gelten für die Untersuchung von Krankheitsprozessen, da sie eine Plattform bieten, um die Auswirkungen externer Einflüsse auf die simulierte Krankheitsaktivität und nachfolgende Reparaturprozesse dynamisch zu untersuchen. Obwohl dieser smektische Flüssigkristall-Elastomerschaum Einblicke in Zell-Zell-Wechselwirkungen geben kann, kann er auch mit anderen Materialien wie Halbleiter- oder Metallnanostrukturen verwendet werden.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher in biomedizinischen Bereichen, um langfristige experimentelle Plattformen zu entwerfen, die lebende Systeme widerspiegeln.