Ein Protokoll für die Verwendung von Gen Set Anreicherung Analyse zur Ermittlung von geeigneten Tiermodell für die translationale Forschung
16. August 2017
Wir bieten ein standardisiertes Protokoll für die Nutzung der Genanalyse Set Anreicherung von transkriptomischen Daten, um eine ideale Maus-Modell für die translationale Forschung zu identifizieren.
Dieses Protokoll kann mit DNA-Microarray und RNA Sequenzierungsdaten verwendet werden und kann weiter mit anderen Daten der Omics verlängert werden, wenn Daten vorhanden sind.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, das geeignete Tiermodell für translationale Forschungsfragen zu identifizieren. Diese Methode kann helfen, eine Schlüsselfrage in der translationalen Forschung zu beantworten: Wie kann ich ein geeignetes Tiermodell für eine bestimmte menschliche Krankheit auswählen, die ich untersuchen möchte? Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass Gesamtgenomdaten zwischen Tiermodellen und Studien an menschlichen Krankheiten verglichen werden.
Dieser Ansatz vermeidet also eine verzerrte Interpretation in Bezug auf Einzelgenvergleiche. Diese Methode gibt zwar Aufschluss über die Eignung von Mausmodellen für entzündliche Erkrankungen, kann aber auch auf andere Krankheitsmodelle angewendet werden. GSEA hilft bei der Untersuchung der politischen Regulierung von Genexpressionsstudien.
Die Ergebnisse für jedes Tiermodell und jede Krankheitsstudie sind die Grundlage für weitere Vergleiche. Beginnen Sie dieses Verfahren mit dem Herunterladen von Software und Daten, gefolgt von der Datenverarbeitung und -formatierung, wie im Textprotokoll beschrieben. Öffnen Sie dann das GSEA-Softwaretool.
Klicken Sie auf die Schaltfläche Daten laden auf der linken Seite des Hauptfensters. Es öffnet sich ein neuer Tab zum Importieren der benötigten Datendateien. Navigieren Sie auf der neuen Registerkarte zur Genexpressionsdatendatei und zur Phänotypdatei.
Falls GSEA keine Verbindung zum Internet herstellen kann, laden Sie auch die heruntergeladenen Datenbankdateien für molekulare Signaturen und die DNA-Chip-Annotationsdateien. Erfolgreich importierte Daten werden im Abschnitt "Daten laden" angezeigt. Klicken Sie auf die Schaltfläche GSEA ausführen auf der linken Seite des Hauptfensters.
Es öffnet sich eine neue Registerkarte, in der Sie die Parameter für die Analyse einstellen können. Die Registerkarte ist in drei Teile unterteilt: Pflichtfelder, Basisfelder und erweiterte Felder. Wählen Sie in den erforderlichen Feldern zunächst den Ausdrucksdatensatz aus.
Wählen Sie dann die Gensets-Datenbank entweder von der verbundenen Website oder aus der manuell importierten Genset-Datei aus. Bearbeiten Sie die Phänotyp-Beschriftungen, um die Gruppen von Proben auszuwählen, die miteinander verglichen werden sollen. Zum Beispiel Krankheitsgruppe versus gesunde Kontrollgruppe.
Wählen Sie als Nächstes Datensatz auf Gensymbole reduzieren gleich true, um die Sondenidentifikatoren im Expressionsdatensatz in offizielle Hugo-Gensymbole zu übersetzen, die in der Gensets-Datenbank verwendet werden. Wählen Sie false aus, wenn der Ausdrucksdatensatz bereits Hugo-Gensymbole enthält. Legen Sie die Anzahl der Permutationen auf die Standardeinstellung 1.000 fest.
Ändern Sie den Permutationstyp in einen Gensatz, da die Phänotyp-Permutation nur empfohlen wird, wenn es mehr als sieben Proben in jedem Phänotyp gibt. Wählen Sie abschließend die Chipplattform aus, die zum Generieren der Genexpressionsdaten verwendet wird, entweder von der verbundenen Website oder aus der manuell importierten DNA-Chip-Annotationsdatei. Bearbeiten Sie in den Grundfeldern den Namen der Analyse und den Abschnitt Ergebnisse in diesem Ordner speichern.
Darüber hinaus können weitere statistische Parameter geändert werden. Weitere Informationen zu den Parametern und dem Abschnitt "Erweiterte Felder" finden Sie im GSEA-Benutzerhandbuch. Wenn extern berechnete Gruppenmetriken für Genexpressionsdaten angewendet werden, verwenden Sie ein GSEA-Tool mit Vorrangliste.
Diese Analyse basiert auf einer einfachen Liste von Genen, die vorab berechneten Gruppenmetriken zugewiesen sind, die für die Einstufung der Gene verwendet werden. Nachdem Sie die alternative Genexpressionsdatei geladen haben, gehen Sie zur Hauptnavigationsleiste und klicken Sie auf Tools, GseaPreranked. Ebenso öffnet sich eine neue Registerkarte zum Festlegen der Parameter für die Analyse.
Klicken Sie anschließend auf die Schaltfläche Ausführen am rechten unteren Rand des Fensters. Klicken Sie im Abschnitt GSEA-Bericht auf die erfolgreiche Analyse, um die Analyseergebnisse zu öffnen. Klicken Sie anschließend auf die detaillierten Anreicherungsergebnisse im Excel-Format, um die Analyseergebnisse in eine Tabelle zu exportieren.
Exportieren Sie die Ergebnisse für beide Phänotypen separat. Verbinden Sie in Excel die Ergebnisdaten in einer Tabellenkalkulationsdatei. Für den anschließenden Vergleich zwischen Genexpressionsdaten mehrerer Studien ist mindestens der Name des Gensatzes, sein normalisierter Anreicherungswert und sein FDR-Wert beizubehalten.
Wiederholen Sie die Genset-Anreicherungsanalyse für die zweite Studie und für alle weiteren Studien, die miteinander verglichen werden sollen. Beziehen Sie so viele klinische Studien am Menschen und verschiedene Mausmodelle wie möglich ein, um das optimale Mausmodell für die translationale Forschungsfrage zu identifizieren. Um das optimale Tiermodell für die Nachahmung der menschlichen Situation zu identifizieren, vergleichen Sie die GSEA-Ergebnisse aller Studien miteinander.
Verwenden Sie die Anreicherungswerte und die FDR-Werte, um die Pfade als aktiviert, inhibiert oder keines von beiden zu klassifizieren. Für viele Studien, die verglichen werden sollen, empfiehlt es sich, R-Skripte zu verwenden. Für jeden Vergleich von zwei Studien wird die Anzahl der Realisierungen der neun möglichen Kombinationen der Signalwegregulation gezählt, wie sie in einer Kontingenztabelle von drei mal drei angezeigt wird.
Bewerten Sie die Korrelation zwischen zwei Studien durch Berechnung des positiven prädiktiven Werts und des negativen prädiktiven Wertes, der definitionsgemäß der Teil der Signalwege ist, der in zwei Studien die gleiche Regulation zeigt. Schätzen Sie auch den Teil der Signalwege, von dem erwartet wurde, dass er rein zufällig korreliert, dargestellt durch ppv-Chance und npv-Chance. Berechnen Sie dann den Informationsgewinn.
Alle Berechnungen können mit Hilfe von Tabellenkalkulationsprogrammen durchgeführt werden, es wird jedoch die Verwendung von R-Funktionen empfohlen. Verwenden Sie die Kontingenztabelle eines Studienpaares, um den P-Wert mit dem Chi-Quadrat-Test zu berechnen, z. B. mit der R-Funktion, dem Chi-Quadrat-Test oder Tabellenkalkulationsprogrammen. Speichern Sie die Daten der Kontingenztabelle in einer Matrix X.Vergleichen Sie anschließend die GSEA-Ergebnisse für alle Kombinationen der Studien, die für die Analyse ausgewählt wurden.
Sortieren Sie alle Kombinationen nach dem Informationsgewinn. Verwenden Sie für den Vergleich vieler Datensätze eine Matrix und visualisieren Sie die Ergebnisse mithilfe einer farbigen Heatmap. Wählen Sie das Tiermodell mit dem höchsten Informationsgewinn aus.
Um die Bedeutung des Informationsgewinns beurteilen zu können, sollte auch der Chi-Quadrat-Test berücksichtigt werden. Hier wird eine Korrelationsmatrix von Signalwegvergleichen zwischen Human- und Mausstudien demonstriert. Die Überlappung der Signalwegregulation wird als der Informationsgewinn dargestellt, der aus einer Studie gewonnen werden kann, um die Auswirkungen in einer anderen Studie vorherzusagen.
Blau bedeutet eine geringe Korrelation und Rot bedeutet eine hohe Korrelation zwischen den Daten. Der Vergleich von menschlichen mit murinen Datensätzen ergab eine Untergruppe von Mausmodellen, die stark mit Studien am Menschen korrelierten. Daher sind diese Mausmodelle am besten geeignet, um die menschliche Situation nachzuahmen.
Im Gegensatz dazu zeigten die Studien sieben, acht und neun keine Korrelation zu den Studien zu menschlichen Krankheiten. Einmal gemeistert, kann diese Technik in mehreren Tagen durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Das hängt von der Datenmenge und der Datenverfügbarkeit ab.
Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Gültigkeit der Ergebnisse von der Qualität und Relevanz der ausgewählten Daten abhängt. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie auf der Grundlage von Transkriptdaten ein geeignetes Tiermodell für eine bestimmte menschliche Krankheit auswählen.
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Überblick
Dieser Artikel präsentiert ein standardisiertes Protokoll für die Gen-Set-Enrichment-Analyse (GSEA) von transkriptomischen Daten zur Identifizierung geeigneter Mausmodelle für translationale Forschung. Die Methode vergleicht gesamte Genomdaten zwischen Tiermodellen und menschlichen Krankheitsstudien und liefert Einblicke in die Modellauswahl für verschiedene Krankheiten.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Translationale Forschung
- Genomik
- Tiermodelle
Hintergrund
- Die Identifizierung geeigneter Tiermodelle ist entscheidend für die translationale Forschung.
- GSEA vermeidet voreingenommene Interpretationen durch den Vergleich ganzer Genomdaten.
- Diese Methode kann auf verschiedene Krankheitsmodelle jenseits entzündlicher Erkrankungen angewendet werden.
- Sie unterstützt die Untersuchung der Genexpressionsregulation.
Zweck der Studie
- Ein Protokoll zur Auswahl von Tiermodellen für spezifische menschliche Krankheiten bereitzustellen.
- Das Verständnis der Modelltauglichkeit in der translationalen Forschung zu verbessern.
- Die Verwendung von transkriptomischen Daten in der Modellauswahl zu erleichtern.
Verwendete Methoden
- Gen-Set-Enrichment-Analyse (GSEA) von transkriptomischen Daten.
- Vergleich ganzer Genomdaten zwischen Tiermodellen und menschlichen Krankheitsstudien.
- Anwendung des Protokolls auf DNA-Mikroarray- und RNA-Sequenzierungsdaten.
- Erweiterung auf andere verfügbare Omics-Daten.
Hauptergebnisse
- Das Protokoll identifiziert effektiv geeignete Mausmodelle für translationale Forschung.
- GSEA liefert eine umfassende Sicht auf die Genexpression über Modelle hinweg.
- Die gewonnenen Erkenntnisse können die Auswahl von Modellen für verschiedene Krankheiten beeinflussen.
- Die Methode reduziert Voreingenommenheit, die mit einzelnen Genvergleichen verbunden ist.
Schlussfolgerungen
- Das standardisierte Protokoll verbessert den Auswahlprozess für Tiermodelle.
- GSEA ist ein wertvolles Werkzeug in der translationalen Forschung zur Modellidentifizierung.
- Dieser Ansatz kann für verschiedene Krankheitskontexte angepasst werden.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Selecting appropriate animal models remains a critical challenge in translational research, where model misalignment contributes to late-stage attrition. This protocol enables systematic evaluation of murine models using transcriptomic concordance with human disease data, reducing reliance on subjective gene filtering. By providing a standardized GSEA-based framework, it supports predictive confidence in model selection and informs go/no-go decisions early in discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypothesis by assessing pathway-level concordance between human disease and animal model transcriptomes.
- Operational Value: Avoids biased interpretation from single-gene comparisons, reducing mechanistic ambiguity in target validation.
- Predictive Value: Enables data-driven prioritization of models with highest gain of information, supporting portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems by identifying models with conserved pathway regulation for downstream compound screening.
- Operational Value: Standardizes cross-study comparison through normalized enrichment scores and FDR values, enhancing reproducibility.
- Scalability: Supports inclusion of multiple human clinical studies and mouse models to identify optimal translational fit.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery through preclinical validation by identifying models with high correlation to human disease states.
- Risk-Adjusted Advancement: Uses gain of information and chi-squared testing to assess significance of model suitability, informing progression decisions.
- Biomarker Alignment: Facilitates identification of conserved pathways that may serve as translational biomarkers across species.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation to preclinical model selection, enabling transcriptomic data to guide animal model choice before significant investment in screening or efficacy studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by comparing whole-genome pathway activation or inhibition patterns between species.
- Screening: Enhances assay readiness by ensuring selected models reflect human disease biology, improving compound evaluation reliability.
- Analytics: Generates quantitative outputs (normalized enrichment score, FDR, gain of information) for objective cross-study comparison.
- Translational Research: Promotes continuity by selecting models with demonstrated pathway-level concordance to human conditions.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable bioinformatics capability applicable across disease areas and omics data types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in model selection, reducing false positives from inadequate biological representation.
- Operational Value: Promotes standardization and reproducibility in model evaluation across teams and sites.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by minimizing investment in poorly predictive models.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of projects based on model suitability evidence.
Implementation Considerations
- Requires expertise in transcriptomic data analysis and GSEA software operation.
- Dependent on access to quality gene expression data from human disease studies and candidate animal models.
- Necessitates standardized data formatting, including gene symbol collapse and phenotype labeling.
- Involves cross-functional alignment between bioinformatics, pharmacology, and pathology teams for interpretation.
- Limited to retrospective analysis; cannot predict model suitability a priori without existing omics data.
