Ein Protokoll für die Verwendung von Gen Set Anreicherung Analyse zur Ermittlung von geeigneten Tiermodell für die translationale Forschung

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, das geeignete Tiermodell für translationsmedizinische Forschungsfragen zu identifizieren. Diese Methode kann dabei helfen, eine zentrale Frage der translationsmedizinischen Forschung zu beantworten: Wie kann ich ein geeignetes Tiermodell für eine bestimmte menschliche Erkrankung auswählen, die ich untersuchen möchte? Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass ganze Genomdaten zwischen Tiermodellen und humanen Erkrankungsstudien verglichen werden.

Daher vermeidet dieser Ansatz eine verzerrte Interpretation, die sich auf den Vergleich einzelner Gene bezieht. Obwohl diese Methode Einblicke in die Eignung von Mausmodellen für entzündliche Erkrankungen liefert, kann sie auch auf andere Krankheitsmodelle angewendet werden. GSEA hilft dabei, die Regulierung von Studien zur Genexpression zu untersuchen.

Die Ausgabe für jedes Tiermodell und jede Krankheitsstudie bildet die Grundlage für weitere Vergleiche. Beginnen Sie dieses Verfahren mit dem Herunterladen der Software und der Daten, gefolgt von der Datenverarbeitung und -formatierung, wie im textbasierten Protokoll beschrieben. Öffnen Sie dann das GSEA-Software-Tool.

Klicken Sie auf der linken Seite des Hauptfensters auf die Schaltfläche „Daten laden“. Ein neuer Tab öffnet sich zum Import der erforderlichen Datendateien. Navigieren Sie in dem neuen Tab zur Datei mit den Genexpressionsdaten und zur Phänotypdatei.

Falls GSEA keine Verbindung zum Internet herstellen kann, laden Sie auch die heruntergeladenen Dateien für molekulare Signaturdatenbanken und die DNA-Chip-Anmerkungsdateien. Erfolgreich importierte Daten werden im Bereich „Daten laden“ angezeigt. Klicken Sie auf der linken Seite des Hauptfensters auf die Schaltfläche GSEA ausführen.

Es öffnet sich ein neuer Tab, um die Parameter für die Analyse festzulegen. Der Tab ist in drei Bereiche unterteilt: erforderliche Felder, grundlegende Felder und erweiterte Felder. Wählen Sie zunächst im Bereich der erforderlichen Felder den Expression-Datensatz aus.

Danach die Gen-Set-Datenbank entweder von der verbundenen Website oder aus der manuell importierten Gen-Set-Datei auswählen. Die Phänotyp-Bezeichnungen bearbeiten, um die miteinander zu vergleichenden Probengruppen auszuwählen. Zum Beispiel Krankheitsgruppe im Vergleich zur gesunden Kontrollgruppe.

Wählen Sie anschließend „collapse dataset to gene symbols“ auf „true“, um die Sondenidentifikatoren im Expressionsdatensatz in offizielle HUGO-Gen-Symbole zu übersetzen, wie sie in der Gen-Sets-Datenbank verwendet werden. Wählen Sie „false“, wenn der Expressionsdatensatz bereits HUGO-Gen-Symbole enthält. Stellen Sie die Anzahl der Permutationen auf den Standardwert von 1.000 ein.

Ändern Sie den Permutationstyp in Gen-Set, da die Phänotyp-Permutation nur empfohlen wird, wenn mehr als sieben Proben für jeden Phänotyp vorliegen. Wählen Sie abschließend die Chip-Plattform aus, die zur Erzeugung der Genexpressionsdaten verwendet wurde, entweder von der verbundenen Website oder aus der manuell importierten Datei mit DNA-Chip-Anmerkungen. Bearbeiten Sie im Bereich der grundlegenden Felder den Analysenamen sowie den Abschnitt „Ergebnisse in diesem Ordner speichern“.

Außerdem können weitere statistische Parameter geändert werden. Weitere Einzelheiten zu den Parametern und zum Abschnitt „Erweiterte Felder“ finden Sie im GSEA-Benutzerhandbuch. Wenn extern berechnete Gruppenmetriken für Genexpressionsdaten verwendet werden, wenden Sie ein GSEA-Vorrang-Tool an.

Diese Analyse basiert auf einer einfachen Liste von Genen, die vorab bestimmten, vorberechneten Gruppenmetriken zugeordnet sind und zur Rangfolge der Gene verwendet werden. Nach dem Laden der alternativen Genexpressionsdatei wechseln Sie zur Hauptnavigationsleiste und klicken Sie auf Tools, GseaPreranked. Ebenso wird ein neuer Tab geöffnet, um die Parameter für die Analyse festzulegen.

Klicken Sie anschließend auf die Schaltfläche „Ausführen“ unten rechts im Fenster. Klicken Sie in der GSEA-Berichtsübersicht auf die erfolgreiche Analyse, um die Analyseergebnisse zu öffnen. Klicken Sie danach auf die detaillierten Anreicherungsergebnisse im Excel-Format, um die Analyseergebnisse in eine Tabellenkalkulation zu exportieren.

Exportieren Sie die Ergebnisse getrennt für beide Phänotypen. Verbinden Sie in Excel die Ergebnisdaten in einer einzigen Tabellenkalkulationsdatei. Für den anschließenden Vergleich von Genexpressionsdaten mehrerer Studien sollten mindestens der Name des Gen-Sets, sein normalisierter Anreicherungsscore und sein FDR-Wert beibehalten werden.

Wiederholen Sie die Analyse der Genexpression für die zweite Studie und alle weiteren Studien, die miteinander verglichen werden sollen. Schließen Sie so viele menschliche klinische Studien und verschiedene Mausmodelle wie möglich ein, um das optimale Mausmodell für die translationsmedizinische Fragestellung zu identifizieren. Um das optimale Tiermodell zur Nachbildung der menschlichen Situation zu bestimmen, vergleichen Sie die GSEA-Ergebnisse aller Studien untereinander.

Verwenden Sie die Anreicherungsscores und die FDR-Werte, um die Signalwege als aktiviert, gehemmt oder keines von beiden einzustufen. Für den Vergleich vieler Studien wird empfohlen, R-Skripte zu verwenden. Zählen Sie für jeden Vergleich zweier Studien die Anzahl der Realisierungen der neun möglichen Kombinationen der Wegregulierung, wie durch eine dreimal-drei-Kontingenztafel angegeben.

Beurteilen Sie die Korrelation zwischen zwei Studien durch Berechnung des positiven Vorhersagewerts und des negativen Vorhersagewerts, der per Definition der Anteil der Signalwege ist, die in beiden Studien dieselbe Regulation aufweisen. Schätzen Sie außerdem den Anteil der Signalwege ab, die rein zufällig korrelieren würden, dargestellt durch ppv Zufall und npv Zufall. Berechnen Sie anschließend den Informationsgewinn.

Alle Berechnungen können mithilfe von Tabellenkalkulationsprogrammen durchgeführt werden, die Verwendung von R-Funktionen wird jedoch empfohlen. Verwenden Sie die Kontingenztabelle eines Studienpaares, um den P-Wert mit dem Chi-Quadrat-Test zu berechnen, beispielsweise mithilfe der R-Funktion „chi-squared test“ oder Tabellenkalkulationsprogramme. Speichern Sie die Daten der Kontingenztabelle in einer Matrix X. Vergleichen Sie anschließend die GSEA-Ergebnisse für alle Kombinationen der für die Analyse ausgewählten Studien.

Sortieren Sie alle Kombinationen nach dem Informationsgewinn. Verwenden Sie für den Vergleich vieler Datensätze eine Matrix und visualisieren Sie die Ergebnisse mithilfe einer farbigen Wärmekarte. Wählen Sie das Tiermodell mit dem höchsten Informationsgewinn aus.

Um die Bedeutung des Informationsgewinns einzuschätzen, berücksichtigen Sie auch den Chi-Quadrat-Test. Hier wird eine Korrelationsmatrix von Pfadvergleichen zwischen humanen und murinen Studien gezeigt. Die Überschneidung der Pfadregulation wird als Informationsgewinn dargestellt, der aus einer Studie gewonnen werden kann, um die Effekte in einer anderen Studie vorherzusagen.

Blau bedeutet eine geringe Korrelation und Rot eine hohe Korrelation zwischen den Daten. Der Vergleich menschlicher mit murinen Datensätzen ergab eine Untergruppe muriner Modelle, die stark mit menschlichen Studien korrelierten. Daher eignen sich diese Mausmodelle am besten, um die menschliche Situation nachzuahmen.

Dagegen zeigten die Studien sieben, acht und neun keine Korrelation zu den humanen Krankheitsstudien. Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie in mehreren Tagen durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß durchgeführt wird. Dies hängt von der Menge der Daten und der Datenverfügbarkeit ab.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, dass die Gültigkeit der Ergebnisse von der Qualität und Relevanz der ausgewählten Daten abhängt. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein geeignetes Tiermodell für eine bestimmte menschliche Krankheit basierend auf Transkriptdaten auswählt.