Transkriptom Profilieren In-Vivo Produziert Bovine Präimplantationsembryonen Mit Zwei-Farben-Microarray-Plattform

Das übergeordnete Ziel dieses Videos ist es, ein optimiertes technisches Verfahren unter Verwendung eines zweifarbigen, maßgeschneiderten Rinderarrays mit einer geringen Menge an Gesamt-RNA von Rinderembryonen am siebten Tag bereitzustellen. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen zum Embryonalverlust bei hochproduktiven Milchkühen und Fragen zur embryonalen Qualität im Verhältnis zur Genexpression im sich entwickelnden Embryo vor der Implantation zu beantworten. Der Vorteil dieser Technik besteht darin, dass wir die Genexpression anhand der Gesamt-RNA im Pikogramm-Bereich untersuchen können, die aus einzelnen Embryonen extrahiert wurde.

Diese Methode kann Aufschluss über den Faktor geben, der das Überleben von in vivo produzierten Präimplantationsembryonen von Rindern beeinflusst. Dies kann auch dazu beitragen, Reproduktionstechnologien wie die In-vitro-Embryonenproduktion zu verbessern. Um mit dem Verfahren zu beginnen, bereiten Sie eingefrorene Rinderembryonen in einem Mikrozentrifugenröhrchen aus einem säulenbasierten RNA-Extraktionskit im Pico-Maßstab vor.

Geben Sie 10 Mikroliter Lysepuffer in das Röhrchen und inkubieren Sie die Embryonen 30 Minuten lang bei 42 Grad Celsius. Zentrifugieren Sie dann das Röhrchen zwei Minuten lang bei 800-facher G.Pipettieren Sie 250 Mikroliter Konditionierungspuffer in die Filtermembran der Reinigungssäule und inkubieren Sie die Säule fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Das Entnahmeröhrchen wird eine Minute lang bei 16.000 G zentrifugiert, um die Vorkonditionierung der Säule abzuschließen.

Geben Sie 10 Mikroliter 70%iges Ethanol zu der Mischung aus Lysepuffer und Embryonen und mischen Sie gut. Laden Sie dann die Mischung auf die Reinigungssäule. Die Säule wird zwei Minuten lang bei 100-fachem G und dann 30 Sekunden lang bei 16.000-fachem G zentrifugiert.

Geben Sie 100 Mikroliter des ersten Waschpuffers in die Säule und zentrifugieren Sie eine Minute lang bei 8.000 Mal G. Mischen Sie mit einem DNase-Kit fünf Mikroliter Stammlösung mit 35 Mikrolitern Puffer und mischen Sie, indem Sie das geschlossene Röhrchen vorsichtig umdrehen. Laden Sie dann das DNase-Gemisch auf die Membran der Reinigungssäule und inkubieren Sie es 15 Minuten lang bei Raumtemperatur.

Geben Sie 40 Mikroliter des ersten Waschpuffers in die Säule und zentrifugieren Sie 15 Sekunden lang bei 8.000 Mal G. Fügen Sie dann 100 Mikroliter des zweiten Waschpuffers hinzu und zentrifugieren Sie eine Minute lang. Geben Sie einen weiteren Teil des zweiten Waschpuffers in die Säule und zentrifugieren Sie zwei Minuten lang bei 16.000 G. Übertragen Sie die Aufreinigungssäule in ein anderes Mikrozentrifugenröhrchen und laden Sie 11 Mikroliter Elutionspuffer auf die Säulenmembran.

Inkubieren Sie die Säule eine Minute lang bei Raumtemperatur. Zentrifugieren Sie die Säule eine Minute lang bei 1.000 G und dann eine weitere Minute lang bei 16.000 G G.Überprüfen Sie die Qualität und Quantität der eluierten RNA und lagern Sie die Probe dann bei minus 80 Grad Celsius. Amplifizieren Sie mit einem Amplifikationskit 100 Pikogramm hochwertiger RNA

Bewerten Sie den Größenbereich der amplifizierten aRNA mit fluoreszenzbasierter Quantifizierung. Bestimmen Sie dann die Konzentration der aRNA durch Spektrophotometrie. Bereiten Sie zwei Mikrogramm der amplifizierten aRNA für die Fluoreszenzmarkierung mit einem Standardkit vor.

Richten Sie einen Ozonkasten in einer Dunkelkammer ein und warten Sie, bis der Ozongehalt auf 0,001 ppm sinkt. Platzieren Sie einen Dunkelkammerfilter über dem Licht. Bringen Sie dann die Probe in die Ozonbox und fügen Sie jeweils zwei Mikroliter Cyanin, fünf Farbstoffe und Markierungspuffer hinzu.

Wenn Sie die Probe unter einem sicheren Licht halten, fügen Sie RNase-freies Wasser hinzu, um ein Gesamtvolumen von 20 Mikrolitern zu erreichen. Mischen Sie die Probe vorsichtig und inkubieren Sie das Röhrchen dann 15 Minuten lang in einem Thermocycler bei 85 Grad Celsius. Kühlen Sie die Probe eine Minute lang auf Eis ab und drehen Sie die Probe dann herunter.

Reinigen Sie die markierte und amplifizierte aRNA mit einem RNA-Extraktionskit. Bestimmen Sie mit dem entsprechenden Spektrometertyp die Konzentration der markierten, amplifizierten aRNA. Bereiten Sie eine zweite Probe amplifizierter aRNA vor, die mit Cyanin-Drei-Farbstoff markiert ist.

Lagern Sie die aRNA-Proben bis zu drei Tage bei minus 80 Grad Celsius. Kombinieren Sie jeweils 825 Nanogramm Cy3- und 5-markierte aRNA. Hinzu kommen der Blockierungspuffer und der Fragmentierungspuffer.

Inkubieren Sie die Mischung 15 Minuten lang bei 60 Grad Celsius und kühlen Sie sie dann eine Minute lang auf Eis ab. Fügen Sie 55 Mikroliter Hybridisierungspuffer hinzu und mischen Sie gut, ohne Luftblasen hinzuzufügen. Zentrifugieren Sie die Mischung eine Minute lang bei 11.300 mal G.

Laden Sie 100 Mikroliter Probe auf den Objektträger und verschließen Sie den Objektträger in der Hybridisierungskammer. Hybridisieren Sie die Probe 17 Stunden lang bei 65 Grad Celsius, während Sie mit 10 Umdrehungen pro Minute rotieren. Bereiten Sie eine Ozon-Absorptions-, Stabilisierungs- und Trocknungslösung vor.

Waschen Sie die Arrays, treffen Sie Vorsichtsmaßnahmen, um die Ozonbelastung zu minimieren, und tauchen Sie sie dann 30 Sekunden lang in die Stabilisierungs- und Trocknungslösung. Stellen Sie sicher, dass die Array-Oberfläche trocken und staubfrei ist. Bewahren Sie die Arrays an einem dunklen Ort auf.

Schalten Sie den Microarray-Scanner ein und warten Sie, bis er zum Scannen bereit ist. Laden Sie dann das Array mit dem Barcode auf der linken Seite. Führen Sie eine Spot-Analyse durch, und speichern Sie die Daten als GPR-Datei.

Normalisieren und analysieren Sie die Daten in einer statistischen Analysesoftware. Berechnen Sie den Schwellenwert für die positive Spot-Auswahl, und zeigen Sie das Diagramm der hybridisierten Signale und Hintergrundsignale an. Führen Sie eine Loess-Normalisierung innerhalb des Arrays und dann eine Quantil-Normalisierung zwischen den Arrays durch.

Exportieren Sie die normalisierten Daten in eine Tabellenkalkulationsdatei. Verwenden Sie alle positiven Signale in einem Microarray-Datenrepository, um eine ID-Liste ausgewählter einzigartiger Gene zu erstellen. Laden Sie die ID-Liste in eine Proteinklassifikations- und -analysedatenbank hoch, wählen Sie bos taurus als Organismus aus und führen Sie einen standardmäßigen statistischen Überrepräsentationstest durch.

Nach der zweistufigen Amplifikation sind die Fragmente sehr ähnlich groß und von guter Qualität. Eine erfolgreiche Amplifikation mit dieser Methode sollte zu einer mindestens tausendfachen Erhöhung der aRNA führen. Ein hochwertiges Microarray-Bild hat auf beiden Kanälen eine hohe Punktintensität und eine geringe Hintergrundintensität.

Wenn die Hintergrundintensität zu hoch ist, ist die Signalauflösung schlecht. Etwa 46% der Spots befanden sich über dem Hintergrund, von denen 6.765 einzigartige RNA-Transkripte, die in der Blastozyste exprimiert wurden, isoliert wurden. Ein statistischer Überrepräsentationstest zeigte, dass die Top 10 der genontologischen Begriffe aktive zelluläre Teilungsprozesse repräsentieren.

Die Entwicklung dieser Technik hat es Forschern auf dem Gebiet der Tierfortpflanzung ermöglicht, die embryonale Genexpression zu erforschen und zu bewerten, wie sich verschiedene Faktoren auf den sich entwickelnden Embryo auswirken. Diese Technik wurde auch bei anderen wichtigen Tierarten, wie z. B. dem Schwein, entwickelt. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie die quantitative PCR verwendet werden, um die Microarray-Ergebnisse zu validieren.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man RNA aus Embryonen extrahiert und wie man RNA amplifiziert und markiert, um eine zweifarbige Microarray-Analyse durchzuführen.