Transkriptom Profilieren In-Vivo Produziert Bovine Präimplantationsembryonen Mit Zwei-Farben-Microarray-Plattform
30. Januar 2017
Microarray-Technologie ermöglicht die quantitative Messung und Erstellung von Genexpressionsprofilen von Transkripten auf genomweiter Basis. Aus diesem Grund bietet dieses Protokoll ein optimiertes technisches Verfahren in einem zweifarbigen, maßgeschneiderten Rinderarray unter Verwendung von Rinderembryonen am Tag 7, um die Machbarkeit der Verwendung einer geringen Menge an Gesamt-RNA zu demonstrieren.
Das übergeordnete Ziel dieses Videos ist es, ein optimiertes technisches Verfahren unter Verwendung eines zweifarbigen, maßgeschneiderten Rinderarrays mit einer geringen Menge an Gesamt-RNA von Rinderembryonen am siebten Tag bereitzustellen. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen zum Embryonalverlust bei hochproduktiven Milchkühen und Fragen zur embryonalen Qualität im Verhältnis zur Genexpression im sich entwickelnden Embryo vor der Implantation zu beantworten. Der Vorteil dieser Technik besteht darin, dass wir die Genexpression anhand der Gesamt-RNA im Pikogramm-Bereich untersuchen können, die aus einzelnen Embryonen extrahiert wurde.
Diese Methode kann Aufschluss über den Faktor geben, der das Überleben von in vivo produzierten Präimplantationsembryonen von Rindern beeinflusst. Dies kann auch dazu beitragen, Reproduktionstechnologien wie die In-vitro-Embryonenproduktion zu verbessern. Um mit dem Verfahren zu beginnen, bereiten Sie eingefrorene Rinderembryonen in einem Mikrozentrifugenröhrchen aus einem säulenbasierten RNA-Extraktionskit im Pico-Maßstab vor.
Geben Sie 10 Mikroliter Lysepuffer in das Röhrchen und inkubieren Sie die Embryonen 30 Minuten lang bei 42 Grad Celsius. Zentrifugieren Sie dann das Röhrchen zwei Minuten lang bei 800-facher G.Pipettieren Sie 250 Mikroliter Konditionierungspuffer in die Filtermembran der Reinigungssäule und inkubieren Sie die Säule fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Das Entnahmeröhrchen wird eine Minute lang bei 16.000 G zentrifugiert, um die Vorkonditionierung der Säule abzuschließen.
Geben Sie 10 Mikroliter 70%iges Ethanol zu der Mischung aus Lysepuffer und Embryonen und mischen Sie gut. Laden Sie dann die Mischung auf die Reinigungssäule. Die Säule wird zwei Minuten lang bei 100-fachem G und dann 30 Sekunden lang bei 16.000-fachem G zentrifugiert.
Geben Sie 100 Mikroliter des ersten Waschpuffers in die Säule und zentrifugieren Sie eine Minute lang bei 8.000 Mal G. Mischen Sie mit einem DNase-Kit fünf Mikroliter Stammlösung mit 35 Mikrolitern Puffer und mischen Sie, indem Sie das geschlossene Röhrchen vorsichtig umdrehen. Laden Sie dann das DNase-Gemisch auf die Membran der Reinigungssäule und inkubieren Sie es 15 Minuten lang bei Raumtemperatur.
Geben Sie 40 Mikroliter des ersten Waschpuffers in die Säule und zentrifugieren Sie 15 Sekunden lang bei 8.000 Mal G. Fügen Sie dann 100 Mikroliter des zweiten Waschpuffers hinzu und zentrifugieren Sie eine Minute lang. Geben Sie einen weiteren Teil des zweiten Waschpuffers in die Säule und zentrifugieren Sie zwei Minuten lang bei 16.000 G. Übertragen Sie die Aufreinigungssäule in ein anderes Mikrozentrifugenröhrchen und laden Sie 11 Mikroliter Elutionspuffer auf die Säulenmembran.
Inkubieren Sie die Säule eine Minute lang bei Raumtemperatur. Zentrifugieren Sie die Säule eine Minute lang bei 1.000 G und dann eine weitere Minute lang bei 16.000 G G.Überprüfen Sie die Qualität und Quantität der eluierten RNA und lagern Sie die Probe dann bei minus 80 Grad Celsius. Amplifizieren Sie mit einem Amplifikationskit 100 Pikogramm hochwertiger RNA
.Bewerten Sie den Größenbereich der amplifizierten aRNA mit fluoreszenzbasierter Quantifizierung. Bestimmen Sie dann die Konzentration der aRNA durch Spektrophotometrie. Bereiten Sie zwei Mikrogramm der amplifizierten aRNA für die Fluoreszenzmarkierung mit einem Standardkit vor.
Richten Sie einen Ozonkasten in einer Dunkelkammer ein und warten Sie, bis der Ozongehalt auf 0,001 ppm sinkt. Platzieren Sie einen Dunkelkammerfilter über dem Licht. Bringen Sie dann die Probe in die Ozonbox und fügen Sie jeweils zwei Mikroliter Cyanin, fünf Farbstoffe und Markierungspuffer hinzu.
Wenn Sie die Probe unter einem sicheren Licht halten, fügen Sie RNase-freies Wasser hinzu, um ein Gesamtvolumen von 20 Mikrolitern zu erreichen. Mischen Sie die Probe vorsichtig und inkubieren Sie das Röhrchen dann 15 Minuten lang in einem Thermocycler bei 85 Grad Celsius. Kühlen Sie die Probe eine Minute lang auf Eis ab und drehen Sie die Probe dann herunter.
Reinigen Sie die markierte und amplifizierte aRNA mit einem RNA-Extraktionskit. Bestimmen Sie mit dem entsprechenden Spektrometertyp die Konzentration der markierten, amplifizierten aRNA. Bereiten Sie eine zweite Probe amplifizierter aRNA vor, die mit Cyanin-Drei-Farbstoff markiert ist.
Lagern Sie die aRNA-Proben bis zu drei Tage bei minus 80 Grad Celsius. Kombinieren Sie jeweils 825 Nanogramm Cy3- und 5-markierte aRNA. Hinzu kommen der Blockierungspuffer und der Fragmentierungspuffer.
Inkubieren Sie die Mischung 15 Minuten lang bei 60 Grad Celsius und kühlen Sie sie dann eine Minute lang auf Eis ab. Fügen Sie 55 Mikroliter Hybridisierungspuffer hinzu und mischen Sie gut, ohne Luftblasen hinzuzufügen. Zentrifugieren Sie die Mischung eine Minute lang bei 11.300 mal G.
Laden Sie 100 Mikroliter Probe auf den Objektträger und verschließen Sie den Objektträger in der Hybridisierungskammer. Hybridisieren Sie die Probe 17 Stunden lang bei 65 Grad Celsius, während Sie mit 10 Umdrehungen pro Minute rotieren. Bereiten Sie eine Ozon-Absorptions-, Stabilisierungs- und Trocknungslösung vor.
Waschen Sie die Arrays, treffen Sie Vorsichtsmaßnahmen, um die Ozonbelastung zu minimieren, und tauchen Sie sie dann 30 Sekunden lang in die Stabilisierungs- und Trocknungslösung. Stellen Sie sicher, dass die Array-Oberfläche trocken und staubfrei ist. Bewahren Sie die Arrays an einem dunklen Ort auf.
Schalten Sie den Microarray-Scanner ein und warten Sie, bis er zum Scannen bereit ist. Laden Sie dann das Array mit dem Barcode auf der linken Seite. Führen Sie eine Spot-Analyse durch, und speichern Sie die Daten als GPR-Datei.
Normalisieren und analysieren Sie die Daten in einer statistischen Analysesoftware. Berechnen Sie den Schwellenwert für die positive Spot-Auswahl, und zeigen Sie das Diagramm der hybridisierten Signale und Hintergrundsignale an. Führen Sie eine Loess-Normalisierung innerhalb des Arrays und dann eine Quantil-Normalisierung zwischen den Arrays durch.
Exportieren Sie die normalisierten Daten in eine Tabellenkalkulationsdatei. Verwenden Sie alle positiven Signale in einem Microarray-Datenrepository, um eine ID-Liste ausgewählter einzigartiger Gene zu erstellen. Laden Sie die ID-Liste in eine Proteinklassifikations- und -analysedatenbank hoch, wählen Sie bos taurus als Organismus aus und führen Sie einen standardmäßigen statistischen Überrepräsentationstest durch.
Nach der zweistufigen Amplifikation sind die Fragmente sehr ähnlich groß und von guter Qualität. Eine erfolgreiche Amplifikation mit dieser Methode sollte zu einer mindestens tausendfachen Erhöhung der aRNA führen. Ein hochwertiges Microarray-Bild hat auf beiden Kanälen eine hohe Punktintensität und eine geringe Hintergrundintensität.
Wenn die Hintergrundintensität zu hoch ist, ist die Signalauflösung schlecht. Etwa 46% der Spots befanden sich über dem Hintergrund, von denen 6.765 einzigartige RNA-Transkripte, die in der Blastozyste exprimiert wurden, isoliert wurden. Ein statistischer Überrepräsentationstest zeigte, dass die Top 10 der genontologischen Begriffe aktive zelluläre Teilungsprozesse repräsentieren.
Die Entwicklung dieser Technik hat es Forschern auf dem Gebiet der Tierfortpflanzung ermöglicht, die embryonale Genexpression zu erforschen und zu bewerten, wie sich verschiedene Faktoren auf den sich entwickelnden Embryo auswirken. Diese Technik wurde auch bei anderen wichtigen Tierarten, wie z. B. dem Schwein, entwickelt. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie die quantitative PCR verwendet werden, um die Microarray-Ergebnisse zu validieren.
Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man RNA aus Embryonen extrahiert und wie man RNA amplifiziert und markiert, um eine zweifarbige Microarray-Analyse durchzuführen.
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Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt ein optimiertes technisches Verfahren unter Verwendung eines zweifarbigen, speziell angefertigten bovinen Arrays zur Analyse der Genexpression in bovinen Embryonen am siebten Tag. Die Methode ermöglicht die Nutzung geringer Mengen an Gesamt-RNA und liefert Erkenntnisse über die Embryonalqualität sowie Faktoren, die das Embryonenüberleben beeinflussen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Embryologie
- Genexpression
Hintergrund
- Die Microarray-Technologie ermöglicht die genomweite Profilierung der Genexpression.
- Das Verständnis des embryonalen Verlusts bei Milchkühen ist entscheidend, um Fortpflanzungstechnologien zu verbessern.
- Methoden mit geringer RNA-Menge können Studien an einzelnen Embryonen verbessern.
- Die Analyse der Genexpression kann die Praxis der In-vitro-Embryoproduktion unterstützen.
Zweck der Studie
- Die Machbarkeit der Verwendung geringer Mengen an Gesamt-RNA aus bovinen Embryonen zu demonstrieren.
- Die Genexpression in Bezug auf die embryonale Qualität vor der Implantation zu untersuchen.
- Einblicke in Faktoren zu gewinnen, die das Überleben boviner Präimplantations-Embryonen beeinflussen.
Verwendete Methoden
- Herstellung von schockgefrorenen bovinen Embryonen.
- Verwendung eines säulenbasierten Pikoskaligen RNA-Extraktionskits.
- Anwendung eines zweifarbigen, speziell angefertigten bovinen Arrays.
- Quantitative Messung der Genexpression auf Ebene von Pikogramm RNA.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Profilierung der Genexpression mit minimalem RNA-Material.
- Erkenntnisse zur Embryonalqualität und Faktoren, die das Überleben beeinflussen.
- Mögliche Verbesserungen in der Fortpflanzungstechnologie.
- Nachweis der Machbarkeit der Methode für zukünftige Studien.
Schlussfolgerungen
- Das Protokoll stellt ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung der Genexpression in bovinen Embryonen dar.
- Methoden mit geringem RNA-Eingang können die Forschung zur embryonalen Entwicklung erleichtern.
- Dieser Ansatz könnte zu Fortschritten in den Fortpflanzungsverfahren der Milchviehzucht führen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Dieses Protokoll ermöglicht die genomweite Profilierung der Genexpression aus RNA auf Pikogramm-Ebene, die aus einzelnen bovinen Embryonen isoliert wurde, und löst damit einen kritischen Engpass in der reproduktiven Biologieforschung. Durch die Bereitstellung quantitativer transkriptomischer Daten aus in vivo erzeugten Präimplantations-Embryonen unterstützt die Methode die mechanistische Absicherung von Faktoren, die embryonalen Verlust verursachen, bei hochleistenden Milchrindern. Der Ansatz bietet einen translationalen Nutzen für die Validierung von Zielstrukturen in der reproduktiven Therapeutik sowie eine prädiktive Zuverlässigkeit in Pipelines zur Beurteilung der Embryonenqualität.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung der transkriptionellen Netzwerke, die die embryonale Überlebensfähigkeit und Qualität vor der Implantation steuern.
- Operationaler Wert: Erleichtert die funktionelle Zielvalidierung, indem genexpressionsmuster mit phänotypischen Ergebnissen in der Embryonalentwicklung verknüpft werden.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die Portfolio-Priorisierung, indem molekulare Signaturmuster identifiziert werden, die mit lebensfähigen bzw. nicht lebensfähigen Embryonen assoziiert sind.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Erzeugt standardisierte, reproduzierbare transkriptomische Profile, die für die Biomarkerentdeckung und die Assay-Standardisierung geeignet sind.
- Skalierbarkeit: Das Zweifarb-Microarray-Design erhöht die technische Replikation und minimiert Variabilität, wodurch robuste Vergleiche zwischen Proben ermöglicht werden.
- Plattformnutzen: Schafft eine wiederverwendbare Grundlage für die nachgeschaltete Validierung mittels qPCR oder funktioneller Screening-Verfahren für Kandidatengene.
Translationale und präklinische Forschung
- Krankheitsrelevanz: Bietet ein bovines Modellsystem mit entwicklungsbiologischen Parallelen zur menschlichen Präimplantations-Embryogenese für mechanistische Untersuchungen.
- Translationale Kontinuität: Verbindet entdeckungsorientierte Befunde zur Genexpression mit der präklinischen Bewertung von Faktoren, die die Embryonalüberlebensrate beeinflussen.
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: Ermöglicht datengestützte Entscheidungen über interventionelle Fortpflanzungstechnologien basierend auf Expressionsprofilen zentraler Entwicklungswege.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in den frühen Entdeckungsprozess ein und unterstützt die hypothesengetriebene Zielidentifizierung und mechanistische Validierung, bevor funktionelle Assays oder in-vivo-Validierungsstudien durchgeführt werden.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Aufklärung von Signalwegen und die biologische Entrisikung, indem differentiell exprimierte Transkripte, die mit Embryoqualität und Überleben assoziiert sind, isoliert werden.
- Screening: Liefert quantitative, normalisierte Expressionsdaten, die einen zuverlässigen Vergleich genetischer oder umweltbedingter Faktoren im embryonalen Entwicklungsverlauf ermöglichen.
- Analytik: Wendet Loess- und Quantil-Normalisierung in Kombination mit statistischen Überrepräsentationstests an, um aussagekräftige Erkenntnisse aus Gen-Ontologie-Analysen von Microarray-Daten abzuleiten.
- Translationale Forschung: Unterstützt Biomarker-Entdeckungsansätze, indem konservierte Prozesse wie aktive Zellteilung als funktional am stärksten hervorgehobene Terme in Blastozysten-Embryonen identifiziert werden.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Etabliert einen standardisierten Workflow von RNA bis zur Datenanalyse, der auf Nutztiere anwendbar ist und auf andere Säugetier-Embryomodelle übertragbar bleibt.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verringert die mechanistische Unklarheit beim embryonalen Verlust, indem genomweite Expressionsdaten aus klinisch relevanten Entwicklungsstadien bereitgestellt werden.
- Operationaler Wert: Ermöglicht den Nachweis mit hoher Empfindlichkeit bei minimalem RNA-Eingang und standardisiert Workflows mit geringem Probenvolumen für wertvolle oder begrenzte biologische Proben.
- Strategischer Wert: Verbessert die Entscheidungsfindung über Fortsetzung oder Abbruch in der Entwicklung reproduktiver Technologien, indem molekulare Profile mit Ergebnissen zur embryonalen Lebensfähigkeit verknüpft werden.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung von Zielstrukturen oder Interventionen basierend auf der Anreicherung funktionell kohärenter Gen-Netzwerke.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse im Umgang mit RNA, enzymatischer Amplifikation und fluoreszenzmarkierungstechnischen Verfahren, um eine Probenverderbung zu verhindern.
- Setzt den Zugang zu Mikroarray-Scannern, Hybridisierungskammern und ozongesteuerten Umgebungen voraus, um die Signalintegrität aufrechtzuerhalten.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen Teams hinsichtlich RNA-Qualitätskenngrößen, Markierungseffizienz und Hybridisierungsbedingungen für reproduzierbare Ergebnisse.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen beim Übertragen des Protokolls auf verschiedene Embryonalstadien, Arten oder Probentypen mit unterschiedlichem RNA-Ertrag.
- Zu den praktischen Einschränkungen gehören die Notwendigkeit eines amplifizierten RNA-Eingangs und mögliche Verzerrungen, die während zweier Amplifikationsrunden eingeführt werden können.
