Name: Transkriptom Profilieren In-Vivo Produziert Bovine Präimplantationsembryonen Mit Zwei-Farben-Microarray-Plattform (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Lernen Sie die Transkriptom-Analyse von Rinderembryonen mit einer Zwei-Farben-Microarray-Plattform. Diese Methode ermöglicht die Genexpressionsuntersuchung bei minimalem RNA-Einsatz und liefert wertvolle Einblicke in Embryonenqualität.

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Forschung unterstützt von Alberta Livestock and Meat Agency, Alberta Innovates - BioSolutions, Alberta Milk, and Livestock Research Branch, Alberta Agriculture and Forestry.

Das Tier Teil dieser Studie wurde an der Metabolic Research Unit der University of Alberta, Edmonton, Kanada, mit allen tierexperimentellen Verfahren genehmigt (Protokoll # AUP00000131) von der University of Alberta Animal Care und Use Committee, geleitet und Tiere betreut nach an den Canadian Council of Animal Care-Richtlinien (1993). 1. Embryo Produktion, Isolierung von Gesamt-RNA und DNase-Behandlung <ol><li> Für die Tierversuchsprotokolle und Embryo - Entnahme beziehen sich in unseren bisherigen Publikationen 17, 18. </li><li> Pool und Snap einfrieren ähnliche Stufe Embryonen aus jeder Kuh in flüssigem Stickstoff und dann halten bei -80 ° C bis zur RNA-Extraktion. </li><li> Extrahieren Sie die Gesamt - RNA über eine spaltenbasierte RNA - Extraktions - Kits , die RNA aus pico-Skala Proben zu extrahieren ermöglicht (Kit Informationen finden Sie in der Materialliste zur Verfügung). HINWEIS: Empfohlene Kit enthält: Konditionierungspuffer, Extraktion Buffer, 70% Ethanol, Waschpuffer 1, Waschpuffer 2, Elutionspuffer, RNA Reinigungskolonnen mit Sammelröhrchen und Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> In 10 &amp; mgr; l Extraktionspuffer zu Röhrchen mit Embryonen und Inkubation für 30 min bei 42 ° C. Zentrifugenröhrchen bei 800 × g für 2 min Zellextrakt in das Reaktionsgefäß zu sammeln. </li><li> Pipette 250 ul Konditionierungspuffer auf die Reinigungskolonne Filtermembran. Inkubieren der RNA Reinigungskolonne mit Konditionierungspuffer für 5 min bei Raumtemperatur. Zentrifugieren Sie die Reinigungskolonne in dem Sammelröhrchen bei 16.000 × g für 1 min. </li><li> Pipette 10 &amp; mgr; l 70% Ethanol in dem Gemisch aus RNA Extraction Buffer und Embryonen. Gut mischen durch Pipettieren von oben und unten. Pipette-Gemisch in die vorkonditioniert Reinigungskolonne. </li><li> RNA zu binden, zentrifugieren der Reinigungskolonne für 2 min bei 100 xg und sofort von einer Zentrifugation bei 16.000 xg für 30 s folgen, um Strömung durch entfernen. </li><li> Je 10081; L Waschpuffer 1 in die Reinigungskolonne und zentrifugieren für 1 min bei 8.000 x g. HINWEIS: DNase-Behandlung, wenn die Durchführung der reversen Transkription oder Verstärkung nach der RNA-Isolierung empfohlen. </li><li> Digest genomische DNA direkt nach dem Schritt 1.8. HINWEIS: Empfohlene DNase Kit ist in der Materialliste zur Verfügung. Empfohlene Kit enthält: DNase I-Stammlösung und Puffer. </li><li> Bereiten Mischung DNase Inkubation von 5 ul DNase I-Stammlösung mit 35 &amp; mgr; l Puffer zu mischen. Mischen Sie vorsichtig invertieren. </li><li> Pipette, um die 40 &amp; mgr; l DNase Inkubationsmischung direkt in die Reinigungskolonne Membran. für 15 min bei Raumtemperatur inkubieren. </li><li> Pipette 40 &amp; mgr; l Waschpuffer 1 in die Säule Membranreinigung und dann bei 8000 × g für 15 s zentrifugiert. </li><li> Je 100 &amp; mgr; l Waschpuffer 2 in die Reinigungskolonne und zentrifugieren für 1 min bei 8.000 x g. </li><li> Pipette weitere 100 &amp; mgr; l Waschpuffer 2 in die Reinigungskolonne und Zentrifugefür 2 Minuten bei 16.000 x g. </li><li> Übertragen Sie die Reinigungskolonne zu einem neuen 0,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Pipette 11 ul Elutionspuffer direkt auf die Membran der Reinigungskolonne. Um eine maximale Absorption von Elutionspuffer in die Membran zu gewährleisten, sanft berühren die Spitze der Pipette auf die Oberfläche der Membran, während die Elutionspuffer Abgabe. </li><li> Inkubieren der Säule für 1 min bei Raumtemperatur. Zentrifugieren der Säule für 1 min bei 1000 × g Elution Buffer in der Säule zu verteilen, und dann drehen für 1 min bei 16.000 xg RNA zu eluieren. </li><li> Verwenden Bioanalyzer Instrument nach den Anweisungen des Herstellers , die RNA - Qualität und Quantität 19 zu bewerten. </li><li> Lagern Sie die RNA-Probe bei -80 ° C bis zur Verwendung. </li></ol> 2. RNA-Amplifikation und Markierung für Microarray-Analyse HINWEIS: Zum ersten Mal Benutzer arbeiten mit RNA-Amplifikation und Kennzeichnungsverfahren, verwenden fünf ng spike in RNA aloden tatsächlichen aRNA Proben ng der Qualitätskontrolle Messung der RNA-Amplifikation und Hybridisierung zu überwachen. Der Spike-in RNA - Mix enthält zehn in vitro synthetisierten, polyadenylierte Transkripte in vorbestimmten Verhältnissen. Wenn das Verfahren korrekt durchgeführt, hybridisieren die markierten Transkripte spezifisch nur an komplementäre Kontrollsonden in Arrays und können die Daten abgetastet werden Qualitätskontrollsicherung mit minimaler Selbst- oder Kreuzhybridisierung zu verfolgen. Weitere Details Beschreibung in Bezug auf die mit Spikes-Kontrolle Intensitäten und Normalisierungsverfahren nach der Anordnung und Datenanalyse Scannen 20 zur vorherigen Publikationen verweisen, 21. Das folgende Verfahren wird auf die Routine Microarray-Benutzer gegeben. <ol><li> Bereiten 100 pg hoher Qualität RNA-Probe (RNA Integrity Number (RIN) Wert mindestens&gt; 7,0) in einem Gesamtvolumen von 10 - 11 &amp; mgr; l. </li><li> Amplify die RNA-Proben mit einem Amplifikationskit in der Lage,arbeiten mit Pico-Skala Proben (weniger als 100 pg). HINWEIS: Empfohlene Amplifikationskit Informationen finden Sie in der Materialliste zur Verfügung und folgt den Anweisungen des Herstellers ohne jegliche Änderung. </li><li> Verwenden, um eine fluoreszenzbasierte Quantifizierung des Profils der Größenbereich der amplifizierten aRNA auszuwerten. </li><li> Verwenden Sie das Spektralphotometer Instrument (bezogen auf die Absorption bei 260 und 280 nm), um die Konzentration der amplifizierten aRNA zu messen. </li><li> Lagern Sie den verstärkten aRNA bei -80 ° C bis sie bereit zur Kennzeichnung. </li><li> Verwenden Sie 2 ug amplifizierte RNA für die Fluoreszenzmarkierung gemäß ULS aRNA Labeling Kit Benutzerhandbuch. HINWEIS: Da Cyanine 547 und Cyanine 647 Farbstoff empfindlich auf Photoabbau und Cyanine 647 Farbstoff leicht durch Ozon abgebaut wird, nimmt das Markierungsverfahren in einer minimalen Menge an Licht und unter einer ozonfreien Umgebung. </li><li> Schalten Sie den Ozonfeld (1A) , bis das Niveau des Ozons 0,001 ppm. </li><li&gt; Haben die Reaktionsaufbau innerhalb des Ozons Feld (1B) durch Zugabe von 2 &amp; mgr; l Cyanine 547 oder Cyanine 647, 2 ul Markierungspuffer, und dann auf ein Endvolumen von 20 ul mit RNase-freiem Wasser unter dem Sicherheitslicht einzustellen. Hinzufügen Dunkelkammer Filter auf die Lichtquelle. </li><li> Vorsichtig mischen und die Röhrchen in einem Thermocycler bei 85 ° C für 15 min. Proben auf Eis stellen für mindestens 1 min. Spin down zum Inhalt von Rohren zu sammeln, bevor sie mit RNA-Extraktions-Kits fortfahren, mit Ausnahme Schritte im Zusammenhang mit DNase-Behandlung (1,9 bis 1,11), die Cy-Farbstoff-markierte amplifizierte RNA zu reinigen. </li><li> Verwenden Sie das Spektralphotometer Instrument zu messen und die Konzentration der markierten amplifizierten RNA bestimmen und halten Sie die markierten aRNA bei -80 ° C maximal für 3 Tage vor dem Gebrauch. </li></ol> 3. Microarray-Hybridisierung und Waschen HINWEIS: Die folgenden wichtigen Schritte angepasst sind, nach Zwei-Farben-Biochip-basierten Genexpressionsanalyse-Protokoll (Version6.5, Mai 2010). <ol><li> In gleicher Höhe von 825 von jedem Cyanine ng 547- und Cyanine 647-markierte aRNA und mischen sich mit 25x Fragmentierung und 10x Blockierpuffer. </li><li> Das Gemisch wird bei 60 ° C für 15 min und kühl auf Eis für 1 min. </li><li> In die gleiche Menge von 2x Hybridisierungspuffer und gut mischen. </li><li> Zentrifuge bei 13000 rpm, dann ist die Mischung fertig für die Hybridisierung. </li><li> Last 100 &amp; mgr; l aus der Mischung auf das Array Rutsche und versiegeln Sie die Folie im Inneren der Hybridisierungskammer. </li><li> Laden die zusammengesetzte Kammer in den Hybridisierungsofen für 17 h bei 65 ° C bei 10 Umdrehungen pro Minute im Ofen zu drehen. </li><li> Waschen Sie die Arrays gemäß Protokoll mit Ozonschutzbehandlung durch in Stabilisierung Tauchen und Trocknen Lösung für 30 s. </li><li> Entfernen Sie die Felder aus der Lösung und stellen Sie sicher, dass der Array-Oberfläche ohne Staubpartikel trocken ist </li></ol> 4. Scanning Microarray Slide <ol><li> Halten Sie die Arrays in dunklen Ort und schalten Sie scanner bis es gebrauchsfertig (15 Minuten Wartezeit). </li><li> Legen Sie das Array-Barcode auf der linken Seite, in den Scanner und Scanvorgang zu starten. Führen Sie die Analyse vor Ort nach dem Software-Benutzerhandbuch und speichern die Daten als (GPR) Dateiformat. </li></ol> 5. Statistische Analyse <ol><li> Laden Sie die Software FlexArray http://genomequebec.mcgill.ca/FlexArray/license.php Klicken Sie auf &quot;Import Rohdaten&quot; und laden Sie die GPR - Dateien in FlexArray. </li><li> Führen Sie die Normalisierung und die statistische Analyse bei Bedarf durch die Anweisung folgen. Hinweis: Berechnen Sie den Grenzwert für positive Punktauswahl in dieser Studie , wie es zuvor 22 beschrieben wurde. </li><li> Wählen Sie das Drop-Down-Handbuch aus dem Grundstück Betrachter des FlexArray alle Signale, die die hybridisierten Spots und Hintergrund zu sehen. Hinweis: Ein ähnliches Bild von Spike bei den Kontrollen nach der Hybridisierung auf dem Microarray kann in früheren Studie 8 zu sehen. </li><li> Wählen Sie einLöss Normalisierung innerhalb des Arrays durch ein Quantil zwischen Prozessanordnungen Normalisierung folgende von der FlexArray Drop-Down-Handbuch entsprechend. </li><li> Exportieren Sie alle normalisierten Daten von FlexArray in eine Excel zur weiteren Verwendung einreichen. </li></ol> 6. Bioinformatik-Analyse Die ursprüngliche Anmerkung der Sondensequenzen von Rinderembryonen spezifische Transkripte (BESTv1) Microarray zuvor 8 beschrieben worden ist . In dieser Studie, 20.403 einzigartige Gene Symbole (GS) wurden (erhalten <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/53754/Supplement_file_1.xlsx">Supplement File1</a> ) durch das EmbryoGENE Labor - Informations - Management - System (LIMS) ELMA (http://elma.embryo-gene.ca). Eine Liste von 6765 einzigartige Gene ( <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/53754/Supplement_file_2.xlsx">Supplement File2</a> ) wurde auf die alle positiven Signale nach Microarray - Normalisierungsprozess (Schritt 5 ausgewählt und entsprach0,5) aus Rinder Tag 7 Embryonen Genexpressionsprofil. Positive Signalschwelle wurde berechnet basierend auf durchlässigen Veröffentlichung 16 von der Signalintensität eines A - Wert. <ol><li> Zur Funktionsanalyse mit PANTHER (Protein - Analyse durch evolutionäre Beziehungen) Klassifizierungssystem 23, 24, führen Sie über den folgenden Link (http://www.pantherdb.org/about.jsp). </li><li> Laden Sie eine Liste von 6765 embryospezifischen GS spezifischen biologischen Prozess zu identifizieren , während der embryonalen Entwicklung mit Hilfe von statistischen Überrepräsentierung Test und verwenden Standardeinstellung von Bos taurus (alle Gene in der Datenbank) als Referenzliste 25. HINWEIS: Dies ermöglicht die Identifizierung von entwicklungsbezogenen Prozesse von den GO Begriffe, die statistisch über- oder unterdrückten eine binomische Test. </li><li> Stellen Sie P-Wert Schwelle bei &lt;0,05 als Software-Standard. Die Daten können heruntergeladen und Exportet in Excel - Datei zur weiteren Auswahl 16. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Das erste Problem, Microarray-Analyse unter Verwendung von Tag 7 Rinderembryonen durchzuführen, ist nicht ausreichende Mengen an qualitativ hochwertigen RNA immer Genexpression für das Studium. Traditionellen Phenol / Chloroform-RNA-Extraktion und Ethanol-Fällungsverfahren ist nicht für den Tag 7 Embryonen empfohlen, was zu einer geringen Ausbeute und mögliche Überbleibsel phenol inhibierende RNA-Amplifikationsreaktion. Stattdessen wird eine Standard-Spalte-basierte Methode ist besser Gesamt-RNA zu isolieren und dann di...

Frühe embryonale Verlust in hoher produzierenden Milchkühe ist eine der größten Herausforderungen in der Milchindustrie 1, 2. Bovine hat sich ein interessantes Modell menschlichen preimplantation Embryoentwicklung zu studieren aufgrund ihrer ähnlichen Entwicklungsprozess 3, 4. Jedoch ist mehr Forschung erforderlich besseres Verständnis über Gene in bovinen frühen Embryonalentwicklung beteiligt zu haben. Nach zwanzig Jahren seit Technologie der ersten Microarray 1995 entwickelte 5, 6 die Entwicklung anspruchsvollerer Sonde Herstellungstechnologie reduziert Druckfehler und Variabilität von Array - Chips innerhalb und zwischen verschiedenen Microarray - Plattformen. Verbesserte Mikroarray - Technologie führte zu einer weit Anwendung dieser Technologie in der klinischen Forschung 7 und in jüngster Zeit in frühen Embryos quality Bewertung 8. Die große Menge an benötigten Materialien für Microarray-Technologie ist der Hauptgrund, warum der Microarray-Technologie zunächst eine Reihe von Forschungsgebieten wie der frühen Embryonalentwicklung zu betreten gescheitert. In jüngerer Zeit wurden Verfahren RNA - Amplifikation verbessert RNA linear zu amplifizieren bis 9 Mikrogramm Ebene von Unter Nanogramm- Ausgangs - RNA - Material. Es gibt mehrere kommerzielle RNA Amplifizierung Kits auf dem Markt erhältlich; jedoch sind die immer beliebter gut entwickelten Kits im Zusammenhang mit Ribo-Einzel Primer isothermen Amplifikation 10 und T7 - Promotor 11 Methoden angetrieben. Die beliebtesten Antisense - RNA - Amplifikation verwendet in - vitro - Transkription mit einem Primer Oligo - dT - Verknüpfung mit einem T7 - Promotor am 5&#39; - Ende 12. Diese Technologie ermöglicht es, das Beste aus repräsentativen Antisense-Transkripte nach linearer Verstärkung f Aufrechterhaltungoder Arrays Hybridisierung 13. Dieses Verfahren wurde angepasst Picogramm Ebene der Gesamt - RNA aus Rinderembryo 8 extrahiert zu amplifizieren. Universal - Linkage System (ULS) ist das Markierungsverfahren , die direkt die DNA oder RNA verstärkt mit Platin-gebundenen Fluoreszenzfarbstoff entweder Cyanine 547 oder Cyanine 647, durch eine koordinative Bindung an N7 - Position von Guanin 14 bildet enthält. Diese Methode wurde in Embryonen Forschung angepasst stabiler amplifizierten aRNA ohne Modifikation zu erzeugen im Vergleich zu dem aminoallyl modifizierten aRNA durch enzymatische Verfahren 15 erzeugt. Sowohl Einzel- als Farbstoff und zwei Farbstoffe Markierungsverfahren wurden mit Universal Linkage System in Microarray angepasst. Eine große Microarray - Vergleiche Studie war , dass es eine gute Korrelation der Datenqualität ist zwischen den Ein- und Zwei-Farben - Array - Plattformen 6. Vor kurzem beide T7-Promotor-Laufwerkn - Antisense - RNA - Amplifikation und ULS Markierungsverfahren wurden eine zuverlässigere Protokoll bereitzustellen entwickelt eine ausreichende Menge von hoher Qualität zu erzeugen , gekennzeichnet aRNA Materialien für Mikroarray - Hybridisierungs 8, 16. Daher stellt diese Studie ein Protokoll in Zweifarb-Mikroarray mit Tag 7 Rinderembryonen als Beispiel beteiligt einige der wichtigen Schritte von der RNA-Extraktion bis zur Datenanalyse zu demonstrieren.

<table><tbody><tr><td>PicoPure RNA-Isolationskit</td><td>Applied Biosystems</td><td>KIT0204</td><td></td></tr><tr><td>RNase-freies DNase-Set (50)</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>Agilent RNA 6000 Pico Kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>Arcturus RiboAmp HS PLUS Kit</td><td>Applied Biosystems</td><td>KIT0505</td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer Instruments</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2940CA</td><td></td></tr><tr><td>RNA-Siebband</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-5576</td><td></td></tr><tr><td>ULS Fluoreszenz-Markierungskit</td><td>Kreatech Diagnostics</td><td>EA-021</td><td></td></tr><tr><td>Kundenspezifische Genexpressions-Microarrays</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2514F</td><td></td></tr><tr><td>Agilent Genexpressions-Waschpuffer 1</td><td>Agilent Technologies</td><td>Teil #5188-5325</td><td></td></tr><tr><td>Agilent Genexpressions-Waschpuffer 2</td><td>Agilent Technologies</td><td>Teil #5188-5326</td><td></td></tr><tr><td>2x Hi-RPM Hybridisierungspuffer</td><td>Agilent Technologies</td><td>&nbsp; Teil #5190-0403</td><td></td></tr><tr><td>25x Fragmentpuffer</td><td>Agilent Technologies</td><td>Teil #5185-5974</td><td></td></tr><tr><td>10x GE Blocker</td><td>Agilent Technologies</td><td>Teil #5188-5281</td><td></td></tr><tr><td>Stabilisierungs- und Trocknungslösung</td><td>Agilent Technologies</td><td> Teil #5185-5979</td><td></td></tr><tr><td>Dichtungsschieber aktiviert durch Agilent SureHyb-Technologie</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2524-60012</td><td>Packung mit 20 Dichtungsschiebern, 4 Microarrays/Objektträger</td></tr><tr><td>Zweifarbiges RNA-Spike-In-Kit</td><td>Agilent Technologies</td><td> Cat# 5188-5279</td><td></td></tr><tr><td>GenePix 4000B Array-Scanner</td><td>Molecular Devices</td><td>GENEPIX 4000B-U</td><td></td></tr><tr><td>Ozone Free Box</td><td>BioTray</td><td>OFB_100x200 GAL-Datei</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Agilent Technologies</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

transkriptom profilieren in-vivo produziert bovine präimplantationsembryonen mit zwei-farben-microarray-plattform

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Frühlicher Embryonalverlust trägt wesentlich zur Unfruchtbarkeit bei Rindern bei. Darüber hinaus wird das Rind aufgrund seines ähnlichen Entwicklungsprozesses zu einem interessanten Modell für die Untersuchung der Präimplantationsembryonalentwicklung des Menschen. Obwohl bekannt ist, dass genetische Faktoren die frühe Embryonalentwicklung beeinflussen, war die Entdeckung solcher Faktoren eine ernsthafte Herausforderung. Die Microarray-Technologie ermöglicht die quantitative Messung und Erstellung von Genexpressionsprofilen von Transkriptspiegeln auf genomweiter Basis. Eine der wichtigsten Entscheidungen, die bei der Planung eines Microarray-Experiments getroffen werden müssen, ist die Frage, ob ein ein- oder zweifarbiger Ansatz verwendet werden soll. Das zweifarbige Design erhöht die technische Replikation, minimiert die Variabilität, verbessert die Empfindlichkeit und Genauigkeit und ermöglicht Loop-Designs, die die gemeinsamen Referenzproben definieren. Obwohl Microarrays ein mächtiges biologisches Werkzeug sind, gibt es potenzielle Fallstricke, die seine Leistungsfähigkeit schwächen können. Daher demonstrieren wir in diesem Fachbeitrag ein optimiertes Protokoll für die RNA-Extraktion, Amplifikation, Markierung, Hybridisierung der markierten amplifizierten RNA mit dem Array, Array-Scanning und Datenanalyse unter Verwendung der Zwei-Farben-Analysestrategie.

Ein repräsentatives Ergebnis der Gesamt - RNA und verstärkt aRNA von Tag 7 Rinderembryonen ist in Abbildung 3 und zusammengefasst in Tabelle 1 dargestellt. RNA-Integrität und das Profil kann nach der RNA-Extraktion beurteilt werden. Qualitätsbewertung von RNA könnte durch Bioanalyzer (3A) und nur diesen Proben mit RIN - Wert höher als 7,0 sind qualifiziert werden verwendet für...

Die Microarray-Technologie ermöglicht die quantitative Messung und Erstellung von Genexpressionsprofilen von Transkripten auf genomweiter Basis. Aus diesem Grund bietet dieses Protokoll ein optimiertes technisches Verfahren in einem zweifarbigen, maßgeschneiderten Rinderarray unter Verwendung von Rinderembryonen am Tag 7, um die Machbarkeit der Verwendung einer geringen Menge an Gesamt-RNA zu demonstrieren.

Transkriptom Profilieren In-Vivo Produziert Bovine Präimplantationsembryonen Mit Zwei-Farben-Microarray-Plattform

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

Das übergeordnete Ziel dieses Videos ist es, ein optimiertes technisches Verfahren unter Verwendung eines zweifarbigen, maßgeschneiderten Rinderarrays mit einer geringen Menge an Gesamt-RNA von Rinderembryonen am siebten Tag bereitzustellen. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen zum Embryonalverlust bei hochproduktiven Milchkühen und Fragen zur embryonalen Qualität im Verhältnis zur Genexpression im sich entwickelnden Embryo vor der Implantation zu beantworten. Der Vorteil dieser Technik besteht darin, dass wir die Genexpression anhand der Gesamt-RNA im Pikogramm-Bereich untersuchen können, die aus einzelnen Embryonen extrahiert wurde.Diese Methode kann Aufschluss über den Faktor geben, der das Überleben von in vivo produzierten Präimplantationsembryonen von Rindern beeinflusst. Dies kann auch dazu beitragen, Reproduktionstechnologien wie die In-vitro-Embryonenproduktion zu verbessern. Um mit dem Verfahren zu beginnen, bereiten Sie eingefrorene Rinderembryonen in einem Mikrozentrifugenröhrchen aus einem säulenbasierten RNA-Extraktionskit im Pico-Maßstab vor.Geben Sie 10 Mikroliter Lysepuffer in das Röhrchen und inkubieren Sie die Embryonen 30 Minuten lang bei 42 Grad Celsius. Zentrifugieren Sie dann das Röhrchen zwei Minuten lang bei 800-facher G.Pipettieren Sie 250 Mikroliter Konditionierungspuffer in die Filtermembran der Reinigungssäule und inkubieren Sie die Säule fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Das Entnahmeröhrchen wird eine Minute lang bei 16.000 G zentrifugiert, um die Vorkonditionierung der Säule abzuschließen.Geben Sie 10 Mikroliter 70%iges Ethanol zu der Mischung aus Lysepuffer und Embryonen und mischen Sie gut. Laden Sie dann die Mischung auf die Reinigungssäule. Die Säule wird zwei Minuten lang bei 100-fachem G und dann 30 Sekunden lang bei 16.000-fachem G zentrifugiert.Geben Sie 100 Mikroliter des ersten Waschpuffers in die Säule und zentrifugieren Sie eine Minute lang bei 8.000 Mal G. Mischen Sie mit einem DNase-Kit fünf Mikroliter Stammlösung mit 35 Mikrolitern Puffer und mischen Sie, indem Sie das geschlossene Röhrchen vorsichtig umdrehen. Laden Sie dann das DNase-Gemisch auf die Membran der Reinigungssäule und inkubieren Sie es 15 Minuten lang bei Raumtemperatur.Geben Sie 40 Mikroliter des ersten Waschpuffers in die Säule und zentrifugieren Sie 15 Sekunden lang bei 8.000 Mal G. Fügen Sie dann 100 Mikroliter des zweiten Waschpuffers hinzu und zentrifugieren Sie eine Minute lang. Geben Sie einen weiteren Teil des zweiten Waschpuffers in die Säule und zentrifugieren Sie zwei Minuten lang bei 16.000 G. Übertragen Sie die Aufreinigungssäule in ein anderes Mikrozentrifugenröhrchen und laden Sie 11 Mikroliter Elutionspuffer auf die Säulenmembran.Inkubieren Sie die Säule eine Minute lang bei Raumtemperatur. Zentrifugieren Sie die Säule eine Minute lang bei 1.000 G und dann eine weitere Minute lang bei 16.000 G G.Überprüfen Sie die Qualität und Quantität der eluierten RNA und lagern Sie die Probe dann bei minus 80 Grad Celsius. Amplifizieren Sie mit einem Amplifikationskit 100 Pikogramm hochwertiger RNA.Bewerten Sie den Größenbereich der amplifizierten aRNA mit fluoreszenzbasierter Quantifizierung. Bestimmen Sie dann die Konzentration der aRNA durch Spektrophotometrie. Bereiten Sie zwei Mikrogramm der amplifizierten aRNA für die Fluoreszenzmarkierung mit einem Standardkit vor.Richten Sie einen Ozonkasten in einer Dunkelkammer ein und warten Sie, bis der Ozongehalt auf 0,001 ppm sinkt. Platzieren Sie einen Dunkelkammerfilter über dem Licht. Bringen Sie dann die Probe in die Ozonbox und fügen Sie jeweils zwei Mikroliter Cyanin, fünf Farbstoffe und Markierungspuffer hinzu.Wenn Sie die Probe unter einem sicheren Licht halten, fügen Sie RNase-freies Wasser hinzu, um ein Gesamtvolumen von 20 Mikrolitern zu erreichen. Mischen Sie die Probe vorsichtig und inkubieren Sie das Röhrchen dann 15 Minuten lang in einem Thermocycler bei 85 Grad Celsius. Kühlen Sie die Probe eine Minute lang auf Eis ab und drehen Sie die Probe dann herunter.Reinigen Sie die markierte und amplifizierte aRNA mit einem RNA-Extraktionskit. Bestimmen Sie mit dem entsprechenden Spektrometertyp die Konzentration der markierten, amplifizierten aRNA. Bereiten Sie eine zweite Probe amplifizierter aRNA vor, die mit Cyanin-Drei-Farbstoff markiert ist.Lagern Sie die aRNA-Proben bis zu drei Tage bei minus 80 Grad Celsius. Kombinieren Sie jeweils 825 Nanogramm Cy3- und 5-markierte aRNA. Hinzu kommen der Blockierungspuffer und der Fragmentierungspuffer.Inkubieren Sie die Mischung 15 Minuten lang bei 60 Grad Celsius und kühlen Sie sie dann eine Minute lang auf Eis ab. Fügen Sie 55 Mikroliter Hybridisierungspuffer hinzu und mischen Sie gut, ohne Luftblasen hinzuzufügen. Zentrifugieren Sie die Mischung eine Minute lang bei 11.300 mal G.Laden Sie 100 Mikroliter Probe auf den Objektträger und verschließen Sie den Objektträger in der Hybridisierungskammer. Hybridisieren Sie die Probe 17 Stunden lang bei 65 Grad Celsius, während Sie mit 10 Umdrehungen pro Minute rotieren. Bereiten Sie eine Ozon-Absorptions-, Stabilisierungs- und Trocknungslösung vor.Waschen Sie die Arrays, treffen Sie Vorsichtsmaßnahmen, um die Ozonbelastung zu minimieren, und tauchen Sie sie dann 30 Sekunden lang in die Stabilisierungs- und Trocknungslösung. Stellen Sie sicher, dass die Array-Oberfläche trocken und staubfrei ist. Bewahren Sie die Arrays an einem dunklen Ort auf.Schalten Sie den Microarray-Scanner ein und warten Sie, bis er zum Scannen bereit ist. Laden Sie dann das Array mit dem Barcode auf der linken Seite. Führen Sie eine Spot-Analyse durch, und speichern Sie die Daten als GPR-Datei.Normalisieren und analysieren Sie die Daten in einer statistischen Analysesoftware. Berechnen Sie den Schwellenwert für die positive Spot-Auswahl, und zeigen Sie das Diagramm der hybridisierten Signale und Hintergrundsignale an. Führen Sie eine Loess-Normalisierung innerhalb des Arrays und dann eine Quantil-Normalisierung zwischen den Arrays durch.Exportieren Sie die normalisierten Daten in eine Tabellenkalkulationsdatei. Verwenden Sie alle positiven Signale in einem Microarray-Datenrepository, um eine ID-Liste ausgewählter einzigartiger Gene zu erstellen. Laden Sie die ID-Liste in eine Proteinklassifikations- und -analysedatenbank hoch, wählen Sie bos taurus als Organismus aus und führen Sie einen standardmäßigen statistischen Überrepräsentationstest durch.Nach der zweistufigen Amplifikation sind die Fragmente sehr ähnlich groß und von guter Qualität. Eine erfolgreiche Amplifikation mit dieser Methode sollte zu einer mindestens tausendfachen Erhöhung der aRNA führen. Ein hochwertiges Microarray-Bild hat auf beiden Kanälen eine hohe Punktintensität und eine geringe Hintergrundintensität.Wenn die Hintergrundintensität zu hoch ist, ist die Signalauflösung schlecht. Etwa 46% der Spots befanden sich über dem Hintergrund, von denen 6.765 einzigartige RNA-Transkripte, die in der Blastozyste exprimiert wurden, isoliert wurden. Ein statistischer Überrepräsentationstest zeigte, dass die Top 10 der genontologischen Begriffe aktive zelluläre Teilungsprozesse repräsentieren.Die Entwicklung dieser Technik hat es Forschern auf dem Gebiet der Tierfortpflanzung ermöglicht, die embryonale Genexpression zu erforschen und zu bewerten, wie sich verschiedene Faktoren auf den sich entwickelnden Embryo auswirken. Diese Technik wurde auch bei anderen wichtigen Tierarten, wie z. B. dem Schwein, entwickelt. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie die quantitative PCR verwendet werden, um die Microarray-Ergebnisse zu validieren.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man RNA aus Embryonen extrahiert und wie man RNA amplifiziert und markiert, um eine zweifarbige Microarray-Analyse durchzuführen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

Ganze Berge In-situ Hybridisierung von E8.5 bis E11.5 Maus Embryonen

Wir berichten hier über die robuste und effiziente Expression von fluoreszierenden Proteinen nach der mRNA-Injektion in unbefruchtete Eizellen von Branchiostoma lanceolatum. Die Entwicklung der Mikroinjektionstechnik in dieser basalen chordate wird den Weg für tiefgreifende technische Innovationen in diesem aufstrebenden Modellsystem, auch in-vivo-Bildgebung und genspezifischen Manipulationen zu ebnen.

Expression von fluoreszierenden Proteinen in Branchiostoma lanceolatum Durch mRNA Injektion in ungedüngte Eizellen

Dieses Protokoll stellt eine Methode quantitative, single-cell in situ Analyse der Proteinexpression durchzuführen lineage in mouse Spezifikation Präimplantationsembryonen zu studieren. Die Verfahren, die für die Sammlung von Blastozysten, Vollmontage Immunfluoreszenz-Nachweis von Proteinen, Imaging von Proben auf einem konfokalen Mikroskop und Kern Segmentierung und Bildanalyse beschrieben.

Quantitative Analyse der Proteinexpression zu studieren Lineage Spezifikation in Maus Präimplantationsembryonen

Live Verfolgung einzelner WT retinalen Progenitoren in verschiedenen genetischen Hintergründen ermöglicht die Bewertung des Beitrags der Zelle nicht autonomen Signalisierung während der Neurogenese. Hier wird eine Kombination von Knock-Down, Chimäre Generation über Embryo - Transplantation und in - vivo - Zeitraffer-konfokale Abbildung wurde für diesen Zweck verwendet.

In - vivo - Bildgebung von Expression Transgene Gene in einzelnen Retinal Vorläufern in Chimäre Zebrabärblingembryonen Studie Zellnichtautonome Einflüsse

Abbilden der Morphogenese von Insekten Embryonen mit Lichtbogen basierende Fluoreszenzmikroskopie wurde Stand der Technik geworden. Dieses Protokoll beschreibt und vergleicht drei Befestigungstechniken geeignet für Tribolium castaneum Embryonen führt zwei neue maßgeschneiderte transgenen Linien gut geeignet für die Echtzeit- Bildgebung, diskutiert wesentliche Qualitätskontrollen und zeigt den aktuellen experimentellen Beschränkungen.

Lichtblatt-basierte Fluoreszenzmikroskopie lebender oder fixiert und gefärbt<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; Embry

Wir berichten von der Botal-RNA-Elektroporation (mRNA) als methode, die eine schnelle und effiziente Expression mehrerer Proteine im Wachtel-Embryo-Modellsystem ermöglicht. Diese Methode kann verwendet werden, um Zellen fluoreszierend zu kennzeichnen und ihre In-vivo-Bewegungen durch Zeitraffermikroskopie kurz nach der Elektroporation aufzuzeichnen.

Schnelle und effiziente Expression mehrerer Proteine in Aviären Embryonen mit mRNA-Elektroporation

Diese Arbeit beschreibt ein semi-high-throughput-Protokoll, das eine gleichzeitige 3D-Zeitraffer-Bildgebung der Embryogenese in 80–100 C. elegans Embryonen in einem einzigen Nachtlauf ermöglicht. Darüber hinaus sind Bildverarbeitungs- und Visualisierungstools enthalten, um die Datenanalyse zu optimieren. Die Kombination dieser Methoden mit kundenspezifischen Reporterstämmen ermöglicht eine detaillierte Überwachung der Embryogenese.

Ein Instrument zur Analyse der C. elegans Embryonal development

Hier präsentierten wir eine multiplexierte einzellige mRNA-Sequenzierungsmethode, um die Genexpression in embryonalen Geweben der Maus zu profilieren. Die tropfenbasierte einzelzellbasierte mRNA-Sequenzierung (scRNA-Seq) in Kombination mit Multiplexing-Strategien kann Einzelne Zellen aus mehreren Proben gleichzeitig profilieren, was die Reagenzkosten deutlich reduziert und experimentelle Chargeneffekte minimiert.

Multiplexed Single Cell mRNA Sequenzierungsanalyse von Mausembryonalzellen

Die Lichtbogen-basierte Fluoreszenzmikroskopie ist das wertvollste Werkzeug in der Entwicklungsbiologie. Ein wichtiges Thema in vergleichenden Studien ist die Varianz der Umgebung. Unser Protokoll beschreibt ein experimentelles Framework für die gleichzeitige Live-Bildgebung mehrerer Proben und befasst sich daher proaktiv mit diesem Problem.

Gleichzeitige Live-Bildgebung mehrerer Insektenembryonen in probenkammerbasierten Lichtbogenfluoreszenzmikroskopen

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Definition des Programms der mütterlichen mRNA-Translation während der In-vitro-Reifung mit einem Single Oocyte Reporter Assay

In dieser Arbeit wird eine Pipeline für hochwertige Einzelzell- und Zellkernsuspensionen von gastrulierenden Mausembryonen für die Sequenzierung von Einzelzellen und Zellkernen etabliert.

Einzelzell-RNA-Sequenzierung von mutierten ganzen Mausembryonen: Vom Epiblasten bis zum Ende der Gastrulation

Lernen Sie die Transkriptom-Analyse von Rinderembryonen mit einer Zwei-Farben-Microarray-Plattform. Diese Methode ermöglicht die Genexpressionsuntersuchung bei minimalem RNA-Einsatz und liefert wertvolle Einblicke in Embryonenqualität.

Transkriptom Profilieren In-Vivo Produziert Bovine Präimplantationsembryonen Mit Zwei-Farben-Microarray-Plattform

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