Generation von Escape Varianten des Influenza-Virus Monoclonal Antikörper neutralisieren

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, ein Arbeitsprotokoll zur Aufklärung des Epitops eines neutralisierenden monoklonalen Antikörpers bereitzustellen. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen in den Bereichen Immunologie und Virologie zu beantworten, die dazu beitragen können, Interaktionen mit Wirtsviren zu definieren, Therapeutika und Diagnosewerkzeuge zu entwickeln, die alle bei der Entwicklung von Impfstoffen helfen können. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie mit grundlegenden Gewebekultur- und Molekularbiologietechniken ohne spezielle Instrumente oder Geräte durchgeführt werden kann.

Verfahren wird von Mark Bailey, einem MD, Doktorand aus dem Labor von Peter Palese, demonstriert. Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Charakterisierung von Antikörpern auf der Grundlage der Hämoagglutinationshemmung (HI) und der Neutralisationsaktivitäten, wie im Textprotokoll beschrieben. Neutralisierende Antikörper, die HI-Aktivität aufweisen, werden weiter analysiert, indem zunächst vier Verdünnungen des interessierenden Antikörpers in steigenden Konzentrationen in einem Volumen von 100 Mikrolitern pro Verdünnung hergestellt werden.

Bereiten Sie als Nächstes einen Virusvorrat von einer Million plaquebildenden Einheiten pro Milliliter in einem mal PBS in einem Volumen von 400 Mikrolitern vor. Mischen Sie dann 100 Mikroliter von einer Million plaquebildenden Einheiten pro Milliliter Virus mit 100 Mikrolitern jeder Antikörperverdünnung oder 100 Mikrolitern eines Einmal-PBS. Inkubieren Sie die Proben eine Stunde lang in einem 37 Grad Celsius heißen Inkubator mit 5 % Kohlendioxid.

Nach kurzem Vortexen injizieren Sie 200 Mikroliter jeder Mischung in spezifische, pathogenfreie embryonierte Hühnereier. Dann brüten Sie die Eier 40 bis 44 Stunden lang bei 37 Grad Celsius ohne Kohlendioxid aus. Nach der Inkubation opfern Sie die mit dem Virus infizierten embryonierten Eizellen, indem Sie sie mindestens sechs Stunden lang bei vier Grad Celsius erhitzen.

Ernten Sie als Nächstes die Allantoisflüssigkeit aus den Eiern, wie zuvor beschrieben. Bestätigen Sie abschließend die Escape-Varianten, indem Sie den HI-Assay durchführen, wie im Textprotokoll beschrieben. Um Escape-Varianten gegen neutralisierende Antikörper zu erzeugen, denen es an HI-Aktivität mangelt, muss das Virus in Gegenwart zunehmender Mengen an Antikörpern durchgelassen werden.

Plattieren Sie MDCK-Zellen in einer Sechs-Well-Platte mit einer Dichte von einer Million Zellen pro Well. Inkubieren Sie die Zellen mindestens vier Stunden lang in einem 37-Grad-Inkubator mit 5 % Kohlendioxid. In der Zwischenzeit verdünnen Sie den Virusbestand auf eine Million plaquebildende Einheiten pro Milliliter.

Bereiten Sie eine einmalige Verdünnung des Antikörpers mit 0,02 Milligramm pro Milliliter in einem Mal MEM mit TPCK-behandeltem Trypsin in einem Volumen von 250 Mikrolitern vor. Verwenden Sie für alle folgenden Passagen höhere Antikörperkonzentrationen. Mischen Sie 250 Mikroliter verdünntes Virus mit 250 Mikrolitern verdünntem Antikörper oder 250 Mikroliter einmaligem MEM als Null-Antikörper-Kontrolle.

Inkubieren Sie das Virus-Antikörper-Gemisch 30 Minuten lang in einem 37 Grad Celsius heißen Inkubator mit 5 % Kohlendioxid. Nach der Inkubation der Zellen aspirieren Sie das Medium mit einer Pasteurpipette aus Glas und waschen die Monoschicht der Zellen mit einem Milliliter einmaligem PBS. Geben Sie 500 Mikroliter der Mischungen in die Vertiefungen, bevor Sie eine Stunde lang in einem 37-Grad-Inkubator mit 5 % Kohlendioxid inkubieren.

Nach einer Stunde ergänzen Sie die Vertiefungen mit zwei Millilitern einmaligem MEM mit TPCK-behandeltem Trypsin. Überprüfen Sie die Zellen 48 Stunden nach der Infektion am Mikroskop auf Anzeichen der zytopathischen Wirkung (CPE) oder führen Sie einen Hämoagglutinationstest durch, um ein Viruswachstum nachzuweisen. Wenn in der Kultur, die mit Antikörpern ergänzt wird, Wachstums-CPE vorhanden ist, entnehmen Sie den Überstand in mehreren Kryoröhrchen.

Beschriften Sie die Röhrchen mit der Durchgangsnummer und lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius. Sparen Sie 100 Mikroliter des Überstandes, um eine frische Monoschicht von MDCKs mit zwei Millilitern einmaligem MEM zu infizieren, das mit TPCK-Trypsin und Antikörper ergänzt wurde. Denken Sie daran, für jede Passage eine Null-Antikörper-Kontrolle einzuschließen.

Erhöhen Sie die Konzentration des Antikörpers in jeder aufeinanderfolgenden Passage, bis das Viruswachstum noch lebensfähig ist, selbst bei der Endkonzentration von 0,6 Milligramm pro Milliliter Antikörper. Frieren Sie die Mehrfachfläschchen mit dem Überstand jedes Durchgangs ein und lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius. Fahren Sie mit der Isolierung und Analyse der maskierten Varianten fort, wie im Textprotokoll beschrieben.

Impfstoffinduzierte Antikörper, die von Personen isoliert wurden, die mit dem Impfstoffkandidaten H7N9 geimpft worden waren, wurden verwendet, um Escape-Mutantenvarianten zu erzeugen. Die Escape-Mutanten-Kartierung zeigte, dass viele der Antikörper kritische Rückstände an unterschiedlichen Stellen auf dem viralen HA erkannten. Jeder Rest, der rot markiert ist, repräsentiert den Ort kritischer Aminosäuren, die für eine effiziente Bindung eines monoklonalen Antikörpers erforderlich sind, während die Mehrheit der HI-positiven Antikörper mutierten Resten in der Nähe von zuvor berichteten antigenen Stellen des H7HA entkommen ist. Die erzeugten HI-negativen Antikörper Escape-Mutanten mit Punktmutationen in der Stammregion.

Sobald diese Technik beherrscht ist, kann sie angewendet werden, um die strukturellen Determinanten des Schutzes gegen andere Krankheitserreger aufzuklären. Diese Technik beschränkt sich nicht nur auf die Erzeugung von Escape-Varianten monoklonaler Antikörper, sondern auch gegen antivirale Wirkstoffe. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie das Bindungsepitop von monoklonalen Antikörpern durch die Generierung von Escape-Varianten in vitro aufklären können.

Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, beim Umgang mit Viren vorsichtig zu sein und geeignete persönliche Schutzausrüstung zu verwenden.