Generation von Escape Varianten des Influenza-Virus Monoclonal Antikörper neutralisieren

Das übergeordnete Ziel dieser Methode besteht darin, ein funktionierendes Protokoll bereitzustellen, das erklärt, wie das Epitop eines neutralisierenden monoklonalen Antikörpers aufgeklärt werden kann. Diese Methode kann dabei helfen, zentrale Fragen auf den Gebieten der Immunologie und Virologie zu beantworten, die Wechselwirkungen zwischen Wirt und Virus zu definieren, Therapeutika und diagnostische Werkzeuge zu entwickeln und somit bei der Impfstoffentwicklung zu unterstützen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass sie mit grundlegenden Zellkultur- und molekularbiologischen Methoden durchführbar ist, ohne dass spezielle Geräte oder Ausrüstung erforderlich sind.

Den Ablauf wird Mark Bailey, ein MD-, PhD-Student aus dem Labor von Peter Palese, demonstrieren. Beginnen Sie das Verfahren mit der Charakterisierung von Antikörpern basierend auf Hämaggliutinationshemmung, oder HI, und Neutralisationsaktivitäten, wie im Textprotokoll beschrieben. Neutralisierende Antikörper, die HI-Aktivität aufweisen, werden weiter analysiert, indem zunächst vier Verdünnungen des betreffenden Antikörpers in steigenden Konzentrationen in einfacher PBS in einem Volumen von 100 Mikroliter pro Verdünnung hergestellt werden.

Bereiten Sie anschließend einen Virenstamm mit einer Million Plaque-bildenden Einheiten pro Milliliter in 1× PBS in einem Volumen von 400 Mikrolitern vor. Mischen Sie dann 100 Mikroliter des Virus mit einer Million Plaque-bildenden Einheiten pro Milliliter mit jeweils 100 Mikrolitern der Antikörverdünnung oder 100 Mikrolitern 1× PBS. Inkubieren Sie die Proben eine Stunde lang in einem Inkubator bei 37 °C mit 5 % Kohlendioxid.

Nach einer kurzen Vortex-Behandlung jeweils 200 Mikroliter der Mischungen in spezifisch pathogenfreien bebrüteten Hühnereiern injizieren. Anschließend die Eier 40 bis 44 Stunden lang bei 37 Grad Celsius ohne Kohlendioxid inkubieren. Nach der Inkubation die virusinfizierten bebrüteten Eier durch eine Lagerung bei vier Grad Celsius für mindestens sechs Stunden euthanasiert.

Als Nächstes gewinnen Sie die Allantoisflüssigkeit aus den Eiern, wie zuvor beschrieben. Schließlich bestätigen Sie die Escape-Varianten durch Durchführung des HI-Assays gemäß dem im Text beschriebenen Protokoll. Um Escape-Varianten gegen neutralisierende Antikörper, die keine HI-Aktivität besitzen, zu erzeugen, muss das Virus in Gegenwart steigender Antikörpermengen weitergegeben werden.

Plattieren Sie MDCK-Zellen in einer 6-Loch-Platte mit einer Dichte von einer Million Zellen pro Loch. Inkubieren Sie die Zellen für mindestens vier Stunden in einem Inkubator bei 37 °C mit 5 % Kohlendioxid. In der Zwischenzeit verdünnen Sie den Virusstamm auf eine Million Plaque-bildende Einheiten pro Milliliter.

Stellen Sie eine einzelne Verdünnung des Antikörpers bei 0,02 Milligramm pro Milliliter in einmaligem MEM mit TPCK-behandeltem Trypsin in einem Volumen von 250 Mikrolitern her. Verwenden Sie höhere Antikörperkonzentrationen für alle nachfolgenden Passagen. Mischen Sie 250 Mikroliter verdünntes Virus mit 250 Mikrolitern verdünntem Antikörper oder 250 Mikroliter einmaligem MEM als Kontrolle ohne Antikörper.

Die Virus-Antikörper-Mischung 30 Minuten lang in einem 37-Grad-Celsius-Inkubator mit 5 % Kohlendioxid inkubieren. Nach der Inkubation der Zellen das Medium mit einer Pasteur-Pipette aus Glas abpipettieren und die Zellmonoschicht mit einem Milliliter 1× PBS waschen. 500 Mikroliter der Mischungen in die Vertiefungen geben und anschließend eine Stunde lang in einem 37-Grad-Celsius-Inkubator mit 5 % Kohlendioxid inkubieren.

Nach einer Stunde die Vertiefungen mit zwei Milliliter ein Mal MEM unter Zusatz von TPCK-behandeltem Trypsin auffüllen. Die Zellen 48 Stunden nach der Infektion am Mikroskop auf Anzeichen des zytopathischen Effekts, oder CPE, überprüfen oder einen Hämaggli­ti­na­ti­ons­test durchführen, um ein virales Wachstum nachzuweisen. Falls ein Wachstum CPE in der mit Antikörper ergänzten Kultur vorliegt, das Überstandmedium in mehrere Kryoröhrchen abfüllen.

Beschriften Sie die Röhrchen mit der Passagezahl und lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius. Heben Sie 100 Mikroliter des Überstandes auf, um eine frische Monoschicht von MDCK-Zellen mit zwei Millilitern einmal MEM, ergänzt mit TPCK-Trypsin und Antikörper, zu infizieren. Denken Sie daran, für jede Passage eine Kontrolle ohne Antikörper einzuschließen.

Erhöhen Sie die Konzentration des Antikörpers bei jedem folgenden Durchgang, bis das Viruswachstum noch lebensfähig ist, selbst bei der Endkonzentration von 0,6 Milligramm pro Milliliter Antikörper. Gefrieren Sie mehrere Gefäße mit Überstand jedes Durchgangs ein und lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius. Fahren Sie mit der Isolierung und Analyse der entkommenen Varianten fort, wie im Textprotokoll beschrieben.

Impfstoffinduzierte Antikörper, die von mit dem kandidaten H7N9-Influenza-A-Impfstoff Geimpften isoliert wurden, wurden verwendet, um Escape-Mutanten-Varianten zu erzeugen. Die Kartierung der Escape-Mutationen zeigte, dass viele der Antikörper entscheidende Reste an unterschiedlichen Stellen des viralen HA erkannten. Jeder in Rot markierte Rest stellt die Position kritischer Aminosäuren dar, die für eine effiziente Bindung eines monoklonalen Antikörpers erforderlich sind, während die Mehrheit der HI-positiven Antikörper Escape-Mutationen in der Nähe zuvor beschriebener antigener Zonen des H7HA aufweist. Die HI-negativen Antikörper erzeugten Escape-Mutanten mit Punktmutationen im Stamm-Bereich.

Wenn man diese Technik einmal beherrscht, kann sie dazu verwendet werden, die strukturellen Grundlagen des Schutzes gegen andere Krankheitserreger aufzuklären. Diese Technik beschränkt sich nicht nur auf die Erzeugung von Escape-Varianten monoklonaler Antikörper, sondern kann auch gegen antivirale Wirkstoffe angewandt werden. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie das Bindungs-Epitop monoklonaler Antikörper durch die Generierung von Escape-Varianten in vitro aufgeklärt werden kann.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, vorsichtig mit Viren umzugehen und geeignete persönliche Schutzausrüstung zu verwenden.