Generation und Isolierung des Zellzyklus verhaftet Zellen mit komplexen Karyotyp
April 13th, 2018
Aneuploidie führt zu Genom Instabilität, die schließlich Zellzyklus verhaftet Zellen mit komplexen Karyotypen produziert. Dieses Papier stellt eine einfache und bequeme Methode zum aneuploiden Zellen mit komplexen Karyotyp zu isolieren, die aufhören zu teilen.
Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, eine einfache Methode zur Erzeugung und Isolierung von zellzyklus-arrestierten Zellen mit komplexen Karyotypen bereitzustellen. Diese Methode kann Antworten auf zentrale Fragen der Aneuploidieforschung geben, etwa zur Interaktion des Immunsystems mit aneuploiden Zellen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine Zellpopulation erzeugt, die nur komplexe Karyotypen beherbergt.
Um mit der Synchronisierung von RPE-1 hTERT-Zellen zu beginnen, verwenden Sie frisch aufgetaute Zellen und geben Sie sie mit acht Millilitern Standard-Wachstumsmedium in eine 10 Zentimeter große Gewebekulturschale. Verwenden Sie anschließend ein Hämozytometer, um die Zellzahl zu bestimmen. Inkubieren Sie die Zellen dann über Nacht.
Ersetzen Sie am nächsten Tag das Standard-Wachstumsmedium durch ein Medium, das fünf Millimolare Thymidin enthält. Inkubieren Sie 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius, um die Zellen an der G1S-Grenze zu synchronisieren. Waschen Sie die Zellen nach 24 Stunden dreimal mit PBS.
Geben Sie dann Standard-Wachstumsmedium zu den gewaschenen Zellen und inkubieren Sie sechs Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Waschen Sie zuerst die Zellen mit 10 Millilitern PBS. Fügen Sie dann Medium hinzu, das 500 nanomolare Mps1-Inhibitor-Reversin enthält.
12 Stunden bei 37 Grad Celsius inkubieren. Waschen Sie die Zellen am nächsten Tag dreimal mit PBS. Fügen Sie dann Standard-Wachstumsmedium hinzu und stellen Sie die Platten wieder in den Inkubator.
Etwa 72 Stunden nach der ersten aberranten Mitose waschen Sie die Zellen mit 10 Millilitern PBS. Fügen Sie dann Medium hinzu, das 330 nanomolare Nocodazol enthält. 12 Stunden bei 37 Grad Celsius inkubieren.
Am nächsten Tag aspirieren Sie das Nocodazol-Medium. Geben Sie dann drei Milliliter PBS in die Schüssel und klopfen Sie auf die Seite des Tellers, um die mitotischen Zellen abzuschütteln. Drehen Sie die Platte zwischen jedem Klopfen, um eine gleichmäßige Entnahme der mitotischen Zellen zu ermöglichen.
Nach dem ersten Abschütteln die am Deckel und am Rand der Platte anhaftende Flüssigkeit ansaugen. Überprüfen Sie dann die Platte unter dem Mikroskop bei 10-facher Vergrößerung. Waschen Sie dann die Zellen mit fünf Millilitern PBS.
Als nächstes fügen Sie Medium hinzu, das 330 nanomolare Nocodazole enthält. 12 Stunden bei 37 Grad Celsius inkubieren. Nach dem abschließenden Schütteln fügst Du 10 Milliliter Standard-Wachstumsmedium hinzu.
Inkubieren Sie die Zellen 12 bis 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius, bevor Sie die Assays durchführen. Die auf der Platte verbleibenden Zellen werden als mit komplexen Karyotyp- oder ArCK-Zellen arrestiert bezeichnet. Dieses Protokoll beschreibt eine einfache Methode zur Isolierung von ArCK-Zellen und es werden mehrere für ArCK-Zellen spezifische Merkmale analysiert, um ihre Isolierung zu bestätigen.
ArCK-Zellen zeigen in der Immunoblot-Analyse erhöhte Spiegel der Zellzyklus-Inhibitoren p53, p21 und p16, während euploide und aneuploide Zykluszellen dies nicht tun. Darüber hinaus sind ArCK-Zellen positiv für die Seneszenz-assoziierte Beta-Galactosidase, die blau-grün färbt, während euploide Kontrollzellen dies nicht tun. Segmentierungsdiagramme zeigen, dass ArCK-Zellen aneuploid sind und durch mehrfache, zufällige Chromosomengewinne und Chromosomenverluste gekennzeichnet sind.
Segmentierungsdiagramme zeigen die Kopienzahl einzelner Zellen von Chromosom eins bis X relativ zu einer euploiden Referenz-Logarithmus-Skala von zwei. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, dass Sie bei jedem Shake-off alle mitotischen Zellen entfernen. Nach Durchführung dieses Verfahrens können andere Methoden wie Zytokin-Assays durchgeführt werden.
Diese Assays werden bei der Beantwortung weiterer Fragen helfen, wie z.B. der Fähigkeit von ArCK-Zellen, mit den Zellen des Immunsystems zu interagieren. Vergessen Sie nicht, dass Nocodazol gefährlich ist. Bei der Verwendung dieses Reagenzes sollte geeignete persönliche Schutzausrüstung getragen werden.
Einmal gemeistert, kann diese Technik verwendet werden, um ArCK-Zellen effizient in vitro zu isolieren. Dieser Eingriff kann bei ordnungsgemäßer Durchführung in sieben Tagen durchgeführt werden.
Übersicht
Diese Studie präsentiert eine unkomplizierte Methode zur Isolierung von aneuploiden Zellen mit komplexen Karyotypen, die im Zellzyklus arretiert sind. Die Technik zielt darauf ab, das Verständnis von Aneuploidie und deren Auswirkungen auf das zelluläre Verhalten und Immuninteraktionen zu verbessern.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Zellbiologie
- Genetik
- Neurowissenschaften
Hintergrund
- Aneuploidie ist mit Genominstabilität assoziiert.
- Zellen mit komplexen Karyotypen hören oft auf sich zu teilen.
- Das Verständnis dieser Zellen kann Einblicke in Krebs und andere Krankheiten liefern.
- Die Isolierung dieser Zellen kann weitere Forschung zu ihren Eigenschaften erleichtern.
Zweck der Studie
- Eine Methode zur Erzeugung und Isolierung von zellzyklus-arretierten Zellen zu entwickeln.
- Die Eigenschaften aneuploider Zellen zu untersuchen.
- Die Interaktion zwischen aneuploiden Zellen und dem Immunsystem zu erforschen.
Verwendete Methoden
- Synchronisierung von RPE-1 hTERT-Zellen mittels Thymidin und Nocodazol.
- Zell-Shake-off-Technik zur Isolierung von mitotischen Zellen.
- Immunoblot-Analyse zur Beurteilung von Zellzyklusinhibitoren.
- Säuglings-assoziierte Beta-Galaktosidase-Färbung zur Identifizierung von ArCK-Zellen.
Hauptergebnisse
- ArCK-Zellen weisen erhöhte Spiegel von Zellzyklusinhibitoren auf.
- Diese Zellen sind positiv für säuglings-assoziierte Marker.
- Segmentierungsplots bestätigen Aneuploidie in isolierten Zellen.
- Die Methode isoliert effektiv Zellen mit komplexen Karyotypen.
Schlussfolgerungen
- Das Protokoll bietet eine zuverlässige Möglichkeit, aneuploide Zellen zu untersuchen.
- Isolierte ArCK-Zellen können für weitere Forschung zu Immuninteraktionen verwendet werden.
- Die korrekte Durchführung der Methode kann Ergebnisse innerhalb einer Woche liefern.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Isolating cell cycle-arrested cells with complex karyotypes enables mechanistic de-risking of aneuploidy-driven phenotypes in discovery biology. This approach supports target validation by providing a reproducible system to study chromosomal instability and its impact on cellular senescence, inflammation, and immune interactions. The method’s reliance on standard tissue culture techniques enhances scalability and cross-functional adoption in early-stage R&D pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses linking aneuploidy to genome instability and pro-inflammatory phenotypes.
- Operational Value: Provides a standardized, low-cost workflow for generating ArCK cells using thymidine, reversine, and nocodazole synchronization.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates a defined cell population with complex karyotypes for quantitative analysis of senescence markers and cytokine secretion.
- Operational Value: Supports assay standardization through consistent isolation of arrested cells via shake-off and nocodazole treatment.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates study of aneuploid cell interactions with immune cells, informing immunomodulatory target assessment.
- Operational Value: Enables downstream functional assays such as cytokine profiling and senescence-associated beta-Galactosidase staining to validate phenotypic outputs.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to phenotypic screening, particularly for mechanisms involving chromosomal instability and stress response pathways.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by isolating cells with defined karyotypic complexity to clarify causal links between aneuploidy and cellular phenotypes.
- Screening: Enables reproducible preparation of ArCK cells for high-content analysis of cell cycle inhibitors and secretory profiles.
- Analytics: Provides quantitative outputs including immunoblot detection of p53, p21, p16 and segmentation plots for single-cell copy number variation.
- Translational Research: Connects to immune interaction studies, supporting biomarker exploration in senescence-associated secretory phenotypes.
- Enterprise Reuse: Uses accessible reagents and standard culture equipment, allowing adaptation across laboratories without specialized infrastructure.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in aneuploidy research by providing a defined arrest model with complex karyotypes.
- Operational Value: Delivers a seven-day protocol with high specificity for ArCK cells, improving throughput and reproducibility.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by enabling early assessment of aneuploidy-driven biological risks in target pathways.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets linked to chromosomal instability and senescence.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell synchronization techniques and mitotic shake-off procedures.
- Dependent on access to standard tissue culture incubators, hemocytometers, and fluorescence or brightfield microscopy for validation.
- Necessitates standardization of nocodazole handling and wash steps to ensure complete removal of mitotic cells across replicates.
- Adaptation to other cell lines may require optimization of thymidine, reversine, and nocodazole concentrations and timing.
- Limited to in vitro models; primary tissue or in vivo applicability not addressed in source material.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:32
Synchronization of RPE-1 hTERT Cells
1:34
Generation of Aneuploid Cells by Interference with the Activity of the Mitotic Kinase Mps1 and Removal of Aneuploid Cycling Cells to Enrich the ArCK Population
3:36
Results: In Vitro Isolation and Characterization of Aneuploid Cells with Complex Karyotypes (ArCK)
4:35
Conclusion
