Name: Generation und Isolierung des Zellzyklus verhaftet Zellen mit komplexen Karyotyp (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 22 s
Description: Erfahren Sie eine Methode zur Isolierung von Zellzyklus-verhafteten Zellen mit komplexen Karyotypen. Diese Technik ermöglicht die Untersuchung aneuploider Zellen und ihrer Wechselwirkungen mit dem Immunsystem.

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Diese Arbeit wurde zum Teil durch die Koch-Institut-Unterstützung (Kern) Grant P30-CA 14051 vom National Cancer Institute, von den nationalen Instituten der Gesundheit Grant (CA206157-22 und GM118066) und Curt Marmor Cancer Research Fund, Angelika Amon unterstützt. Angelika Amon ist auch ein Investigator am Howard Hughes Medical Institute und Glenn Foundation for Biomedical Research. S. S. wurde von der amerikanischen italienischen Krebs-Stiftung (AICF), durch ein Stipendium in der Krebsforschung von Marie-Curie-Maßnahmen und die italienische Vereinigung für Cancer Research (AIRC), und eine KI Quinquennial Cancer Research Fellowship unterstützt. E.M wurde durch ein Stipendium aus dem Howard Hughes Medical Institute unterstützt.

Kultur-Zustand
RPE-1 hTERT-Zell-Linie wurde in Dulbeccos geändert Eagle Medium (Table of Materials) ergänzt mit 10 % kultiviert fötalen Rinderserum, 2 mM L-Glutamin und 100 U/ml Penicillin/Streptomycin. Zellen wurden bei 37 ° C mit 5 % CO2 in eine feuchte Umgebung inkubiert. Die nachfolgend beschriebene Protokoll entwickelt wurde, mit 10-cm-Gerichte und alle technischen Details berichtet beziehen sich auf die Gerichte. Skalieren, wenn verschiedene Gerichte, oben oder unten entsprechend.
(1) Synchronisation der RPE-1-Zellen
<ol><li>Verwenden Sie frisch aufgetaute Zellen, die nicht mehr als 15 Passagen für alle Experimente durchlaufen haben. Am 1. Tag Tauen und ~2.5 - 5,0 x 105 RPE-1-hTERT-Zellen in der Kulturschale 10 cm Gewebe zu verzichten. 8 mL standard Wachstumsmedium hinzugeben und über Nacht inkubieren. Zellzahl Standardzelle Zähler (z. B. ein Hemocytometer) zu bestimmen. Hinweis: Zelldichte Wachstumsbedingungen des RPE-1-Zellen bezeichnet. Wachstumsbedingungen variieren zwischen verschiedenen Zelllinien; Betrachten sie entsprechend anpassen.</li>
	<li>Am 2. Tag synchronisieren Sie Zellen an der G1/S-Grenze durch regelmäßige Wachstumsmedium Absaugen und Hinzufügen von 8 mL 5 mM Thymidin-haltigem Medium. Hinweis: Thymidin Konzentration und Dauer der Behandlung variieren in verschiedenen Zelllinien. Es ist ratsam, pilot Experimente ermitteln die besten Voraussetzungen für die Zelle Zeile(n) getestet werden.</li>
	<li>Am 3. Tag, 24 h nach dem Hinzufügen von Thymidin Medium (Schritt 1.2) Thymidin-Block durch Absaugen von Medium und Zellen dreimal mit 1 X PBS waschen befreien. Geben Sie 8 mL regelmäßige Wachstumsmedium hinzu und wieder Platten in den Inkubator.</li>
</ol>2. Generation von Aneuploiden Zellen durch Interferenz mit der Tätigkeit der mitotischen Kinase Mps1
<ol><li>Am 3. Tag, 6 h nach der Entlassung von Thymidin-Block (Schritt 1.3; Dies ist ca. 3-6 h, bevor Zellen Mitose eindringen), Aspirieren Medium, einmal mit 1 X PBS waschen und mit 500 nM Reversine (Mps1-Hemmer)-haltigem Medium zu ersetzen. Hinweis: RPE-1-Zellen eindringen Mitose 9-12 h nach Thymidin Auswaschen10,11. Jedoch Zellzykluskinetik variieren zwischen den verschiedenen Zelllinien. Daher ist es wichtig diese Kinetik in Pilotversuchen durch Analyse der Zellzyklus durch bewährte Methoden (z.B.durch die Messung des DNA-Inhalt über FACS-Analyse) zu bestimmen. Darüber hinaus variiert die optimale Arbeit Konzentration Mps1 Inhibitor von Zelllinien. Frühere Experimente mit RPE1 Zellen wurden erfolgreich mit Reversine in einer Arbeitsgruppe Konzentration von 500 nM10,11,12. Es ist ratsam, pilot Experimente ermitteln die optimale Konzentration für die Zell-Linie getestet werden.</li>
	<li>Am Tag 4, 12 h nach Reversine Behandlung (ca. 6 h nach Zellen in Mitose waren) Aspirieren Sie Reversine Medium und waschen Sie Zellen dreimal mit 1 X PBS. Die Platte 8 mL regelmäßige Wachstumsmedium hinzu und Zellen in den Inkubator zurück.</li>
</ol>3. Entfernung von Radsport Aneuploiden Zellen und Anreicherung von ArCK Bevölkerung
<ol><li>Am Tag 6, ca. 72 h nach Zellen der ersten Mitose eingeben (Schritt 2.2; Dies ist ca. 66 h nach Reversine Auswaschen, das entspricht etwa 2-3 Zelle Zyklen), Aspirieren Medium, einmal mit 1 X PBS waschen und mit 300 nM Nocodazole-haltigem Medium zu ersetzen. Hinweis: Neuere Arbeiten haben gezeigt, dass RPE-1-Zellen beherbergen aneuploiden Karyotypen genomisch instabil sind und ihre Verbreitung über verhaften 2-3 Zelle Zyklen nach dem ersten fehlerhaften Mitose10. Allerdings variieren diese Kinetik unter verschiedenen Zelllinien. Daher ist es entscheidend für pilot Experimente um das richtige Timing für die Entfernung von Radsport aneuploiden Zellen zu bestimmen.</li>
	<li>Am Tag 7, 12 h nach der Nocodazole Behandlung Aspirieren Sie Medium und 3 mL 1 X PBS auf den Teller. Der mitotischen Zellen durch Tippen auf die Seite der Platte abschütteln. Drehen Sie die Platte zwischen jeder Berührung, sogar die Entfernung der mitotischen Zellen ermöglichen.</li>
	<li>Um die vollständige Entfernung der mitotischen Zellen gewährleisten, wiederholen Sie schütteln-off für mehrere Runden (3-5 mal empfohlen), Absaugen und das Hinzufügen von 3 mL 1 X PBS zwischen jeder Runde.</li>
	<li>Aspirieren Sie nach dem schütteln sanft jede Flüssigkeit, die den Deckel oder die Kante der Platte eingehalten. Kurz, überprüfen Sie die Platte unter dem Mikroskop bei 10-facher Vergrößerung. Sicherstellen Sie, dass nur wenige mitotische Zellen beobachtet werden. Wenn mehr als fünf mitotische Zellen unter 10 X Objektiv gesehen werden, wiederholen Sie eine weitere Runde der Shake-off. Hinweis: Mitotische Zellen scheint abgerundet und können nach dem schütteln teilweise getrennt werden. Es ist entscheidend für die vollständige Entfernung der mitotischen Zellen vor der Belichtung der Zellen in die nächste Runde der Nocodazole Behandlung zu gewährleisten. Nichtbeachtung kann zur mitotischen Zelltod führen und/oder bei der Erzeugung von tetraploiden Zellen führen.</li>
	<li>Waschen Sie nach dem letzten Shake Zellen einmal mit 5 mL 1 X PBS. Fügen Sie 8 mL Medium mit 330 nM Nocodazole in die Platte und 12 h inkubieren.</li>
	<li>Wiederholen Sie Nocodazole Behandlung/Shake-off (Schritte 3.1-3.5) alle 12 h bis keine mitotischen Zellen nach Inkubation eingehalten werden. In der Regel sind 4 bis 5 Runden Behandlung/Shake-off empfohlen. Hinweis: Die hier bereitgestellten Informationen beziehen sich auf RPE-1-Zellen. Die Anzahl der runden Behandlung/Shake-off variieren zwischen verschiedenen Zelllinien. Zur Vermeidung von langwierigen und unnötige Exposition gegenüber Nocodazole ist es entscheidend, die in einem Pilotversuch sorgfältig die Anzahl der Runden, die für die effiziente und vollständige Entfernung der Radsport aneuploiden Zellen bestimmen.</li>
	<li>Fügen Sie nach 4 bis 5 Runden der Nocodazole Behandlung/Shake-off (Schritte 3.1-3.6) 10 mL regelmäßige Wachstumsmedium und inkubieren. Lassen Sie Zellen für 12-24 h vor Manipulationen oder Assay Nachnutzung ruhen. Hinweis: Nach dem letzten Shake, Zellen bleiben auf der Platte sind Zellzyklus verhaftet und vor kurzem10, siehe Hafen komplexe Karyotyp. Diese Zellen werden als ArCK (Arrested mit komplexen Karyotyp) Zellen bezeichnet. Es ist ratsam, Assays auf ArCK Populationen innerhalb einer Woche nach der Isolation führen.</li>
	<li>Optional, den Anteil der verhafteten Zellen mit komplexen Karyotypen bewerten, sammeln Sie und zählen Sie Zellen von jeder Shake off Standardzelle Zähler.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57215/57215fig1.jpg"> Abbildung 1: insgesamt schematische der Methode zum Generieren und Isolieren von aneuploiden Zellen mit komplexen Karyotyp (ArCK) und repräsentative Bilder. (A) schematische ArCK Zellen Generation und Isolation Protokoll. (B) repräsentative Bilder der RPE-1 hTERT Zellen in jeder Phase der Behandlung. Letzte Paneel (rot dargestellt) repräsentiert die isolierten Zellen ArCK. Skala bar 100 µm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57215/57215fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
4. Charakterisierung der ArCK Bevölkerung
<ol><li>Bestätigen Sie erfolgreiche Isolierung der ArCK Bevölkerung durch Ausführen der folgenden Tests.<ol>
<li>Esel Beta-Galaktosidase Färbung (die Markierung der Seneszenz) mit einem handelsüblichen kit (siehe Tabelle der Materialien).</li>
		<li>Sekretion von Pro-inflammatorischen Zytokinen, z. B. CCL2, durch den Einsatz von handelsüblichen Kits (siehe Tabelle der Materialien) zu messen.</li>
		<li>Erhöhte Niveaus des Zellzyklus-Hemmer p53, p21, p16 durch Western-Blot zu bestätigen. Hinweis: Um diese Tests richtig zu steuern, sollte ArCK Populationen mit euploide und Aneuploidie Radsport Zellen verglichen werden. Ersteres ist niedrig Durchgang, Wildtyp RPE-1 hTERT Zellen wächst exponentiell. Letztere erhalten Sie durch Induktion Chromosom MIS Segregation im RPE-1 hTERT und Ernte Zellen 72 h nach der ersten aberranten Mitose. Folgen Sie dazu das Protokoll beschriebenen Schritt 1.1 und Ernte Zellen direkt vor der ersten Nocodazole-Behandlung (Schritt 3.1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Führen Sie einzellige Sequenzierung um den Karyotyp der verhafteten Zellen zu beurteilen. Hinweis: Einzellige Sequenzierung ist eine etablierte Methode zur Bestimmung von chromosomaler und Sub-chromosomaler Veränderungen in einer Zellpopulation an der Einzelzelle Level13. Modalitäten für einzellige Sequenzierung durchführen finden Sie ebenfalls10.</li>
</ol>

<ol><li>Santaguida, S., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-+and+long-term+effects+of+chromosome+mis-segregation+and+aneuploidy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Short- and long-term effects of chromosome mis-segregation and aneuploidy.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16 (8), 473-485 (2015).</li>
<li>Pfau, S. J., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+instability+and+aneuploidy+in+cancer%3A+from+yeast+to+man%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+reports%22%5BJournal%5D)">Chromosomal instability and aneuploidy in cancer: from yeast to man.</a> EMBO reports. 13 (6), 515-527 (2012).</li>
<li>Gordon, D. J., Resio, B., Pellman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Causes+and+consequences+of+aneuploidy+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Causes and consequences of aneuploidy in cancer.</a> Nature Reviews Genetics. 13 (3), 189-203 (2012).</li>
<li>Holland, A. J., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Boveri+revisited%3A+chromosomal+instability%2C+aneuploidy+and+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Boveri revisited: chromosomal instability, aneuploidy and tumorigenesis.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (7), 478-487 (2009).</li>
<li>Meena, J. K., Cerutti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomerase+abrogates+aneuploidy-induced+telomere+replication+stress%2C+senescence+and+cell+depletion%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Telomerase abrogates aneuploidy-induced telomere replication stress, senescence and cell depletion.</a> The EMBO Journal. , 1-14 (2015).</li>
<li>Ohashi, A., Ohori, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aneuploidy+generates+proteotoxic+stress+and+DNA+damage+concurrently+with+p53-mediated+post-mitotic+apoptosis+in+SAC-impaired+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Aneuploidy generates proteotoxic stress and DNA damage concurrently with p53-mediated post-mitotic apoptosis in SAC-impaired cells.</a> Nature Communications. 6, 7668(2015).</li>
<li>Passerini, V., Ozeri-Galai, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+presence+of+extra+chromosomes+leads+to+genomic+instability%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The presence of extra chromosomes leads to genomic instability.</a> Nature Communications. 7, 10754(2016).</li>
<li>Sheltzer, J. M., Blank, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aneuploidy+drives+genomic+instability+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Aneuploidy drives genomic instability in yeast.</a> Science. 333 (6045), 1026-1030 (2011).</li>
<li>Zhu, J., Pavelka, N., Bradford, W. D., Rancati, G., Li, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Karyotypic+determinants+of+chromosome+instability+in+aneuploid+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Karyotypic determinants of chromosome instability in aneuploid budding yeast.</a> PLoS Genetics. 8 (5), e1002719(2012).</li>
<li>Santaguida, S., Richardson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+Mis-segregation+Generates+Cell-Cycle-Arrested+Cells+with+Complex+Karyotypes+that+Are+Eliminated+by+the+Immune+System%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Chromosome Mis-segregation Generates Cell-Cycle-Arrested Cells with Complex Karyotypes that Are Eliminated by the Immune System.</a> Developmental Cell. 41 (6), 638.e5-651.e5 (2017).</li>
<li>Santaguida, S., Vasile, E., White, E., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aneuploidy-induced+cellular+stresses+limit+autophagic+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Aneuploidy-induced cellular stresses limit autophagic degradation.</a> Genes & Development. 29 (19), 2010-2021 (2015).</li>
<li>Santaguida, S., Tighe, A., D'Alise, A. M., Taylor, S. S., Musacchio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+role+of+MPS1+in+chromosome+biorientation+and+the+spindle+checkpoint+through+the+small+molecule+inhibitor+reversine%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Dissecting the role of MPS1 in chromosome biorientation and the spindle checkpoint through the small molecule inhibitor reversine.</a> The Journal of Cell Biology. 190 (1), 73-87 (2010).</li>
<li>Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+genome+sequencing%3A+current+state+of+the+science%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Single-cell genome sequencing: current state of the science.</a> Nature Reviews Genetics. 17 (3), 175-188 (2016).</li>
<li>López-Soto, A., Gonzalez, S., López-Larrea, C., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunosurveillance+of+Malignant+Cells+with+Complex+Karyotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Immunosurveillance of Malignant Cells with Complex Karyotypes.</a> Trends in cell biology. , 1-4 (2017).</li>
<li>Watson, E. V., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aneuploidy+Police+Detect+Chromosomal+Imbalance+Triggering+Immune+Crackdown%21%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+genetics%3A+TIG%22%5BJournal%5D)">Aneuploidy Police Detect Chromosomal Imbalance Triggering Immune Crackdown!</a> Trends in genetics: TIG. , 1-3 (2017).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Diese neuartige Methode zu erzeugen und zu bereichern für festgenommene Zellen mit komplexen Karyotypen (ArCK) ermöglicht die Untersuchung von Zellen, die mehrere Chromosom Gewinne oder Verluste und aufhören zu teilen. Die Methode Setup wurde entwickelt, um die Isolation der ArCK Zellen auf eine schnelle und zuverlässige Weise zu erleichtern.
Der wichtigste Schritt in diesem Assay ist rigoros die Timeline der medikamentösen Behandlung und vor allem die Beseitigung von Radsport aneuploiden Zellen steuern. Um optimale Ergebnisse zu erzielen ist das Timing von Nocodazole Behandlung und Shake-off von besonderer Bedeutung, um sicherzustellen, dass Radfahren Zellen von der Platte entfernt werden, während sie noch abgerundet und mitotischen, die Möglichkeit der mitotischen Zelltod oder Schlupf in G1 zu verhindern, potenziell Erstellen einer tetraploiden Bevölkerung. Es wird nicht empfohlen, dass das Timing der Shake-aus mehr als zwei Stunden von der empfohlenen 12-h-Nocodazole-Inkubation abweicht.
Zukünftige Studien an Zellen das Potenzial haben, zu ein tieferes Verständnis der wie komplex Karyotypen erleichtern ArCK beeinflussen Zellphysiologie. Insbesondere zeigte eine kürzlich durchgeführte Studie, dass Zellen des Immunsystems in der Lage sind zu interagieren und Trigger immun Clearance von ArCK10 Zellen. Die hier beschriebene Methode bietet einen hervorragenden Ausgangspunkt für die weitere Charakterisierung der ArCK Zellen, einschließlich der Klärung von den molekularen Mechanismen immun Lichtung im untransformierten Zellen und die Studie wie Onkogenen Transformation kann dieser Überwachungsmechanismus, eine entscheidende Frage in das Feld14,15umgehen.

Fehler in den Prozess der Trennung der Chromosomen führen zu Aneuploidie, ein Zustand, gekennzeichnet durch eine Chromosomenzahl, die kein Vielfaches der haploiden Ergänzung1,2,3,4. Aneuploidie Karyotypen Trigger Replikation Stress, die weiter genomische Instabilität5,erzeugt6,7,8,9,10, erhöht Karyotyp Komplexität, und letztlich zu Zellzyklus Festnahme von einer Subpopulation von Zellen10führt. Die hier vorgestellte Methode soll zu generieren und so eine Subpopulation aus dem Radsport Zellen zu trennen. Durch den Einsatz von preiswerten Gewebekultur Techniken, erleichtert dieses Protokoll die Isolierung und Charakterisierung des Zellzyklus verhaftet aneuploiden Zellen mit komplexen Karyotyp. Diese Zellen werden als ArCK (Arrested mit komplexen Karyotyp) Zellen und ihre euploide Radsport Gegenstücke als Steuerelemente bezeichnet.
Dieses Protokoll ist die erste, für diesen Zweck eingerichtet werden und ermöglicht für die Isolierung und weiter zu studieren, ArCK Linien einschließlich, aber nicht beschränkt auf, ihre induzierte Seneszenz und Seneszenz-assoziierten sekretorischen Phänotyp (SASP), ihre Pro-inflammatorischen Funktionen und ihre Fähigkeit, mit Immunzellen zu engagieren. Die hier vorgestellte Methode entwickelt wurde, in den untransformierten, verewigt menschlichen Zellen aber in Krebs Linien noch nicht getestet. Einige transformierten Zellen möglicherweise unempfindlich gegen Zellzyklus Festnahme aufgrund der Unterdrückung der einen oder mehrere Pfade; Daher sollten weitere Validierung in anderen Zelllinien durchgeführt werden.

<table><tbody><tr><td>DMEM (Dulbecco' s modifizierter Eagle Medium)&nbsp;</td><td>Thermofisher</td><td>11995-073</td><td></td></tr><tr><td>Thymidin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1859</td><td></td></tr><tr><td>Reversine</td><td>Cayman Chemical Company</td><td>10004412</td><td></td></tr><tr><td>Nocodazol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1410</td><td></td></tr><tr><td>Anti-p53 Antikörper</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-126</td><td></td></tr><tr><td>Anti-p21 Antikörper</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-6246</td><td></td></tr><tr><td>Anti-p16 Antikörper</td><td>BD</td><td>554079</td><td></td></tr><tr><td>Seneszenz b-Galactosidase Färbekit</td><td>Zellsignaltechnologie&nbsp;</td><td>9860</td><td></td></tr><tr><td>Proteome Profiler Humanes Zytokin-Array-Kit&nbsp;</td><td>Forschung & Forschung D Systems</td><td>ARY005B</td><td></td></tr></tbody></table>

generation und isolierung des zellzyklus verhaftet zellen mit komplexen karyotyp

Generation and Isolation of Cell Cycle-arrested Cells with Complex Karyotypes

Chromosom MIS Trennung führt zu Aneuploidie, eine Bedingung, in denen Zellen eine unausgewogene Chromosomenzahl beherbergen. Einige Linien des Beweises deuten stark, dass Aneuploidie löst Genom Instabilität, letztlich Erzeugung von Zellen mit komplexen Karyotyp, die ihre Verbreitung zu verhaften. Isolierung und Charakterisierung von Zellen beherbergen komplexe Karyotypen sind entscheidend für die Auswirkungen einer unausgewogenen Chromosomenzahl auf Zellphysiologie untersuchen. Bisher wurden keine Methoden zuverlässig solche aneuploiden Zellen isolieren gegründet. Dieses Dokument enthält ein Protokoll zur Bereicherung und Analyse von aneuploiden Zellen mit komplexen Karyotypen standard, preiswerte Gewebekultur Techniken. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um mehrere Funktionen von aneuploiden Zellen mit komplexen Karyotypen einschließlich ihrer induzierte Seneszenz-assoziierten sekretorischen Phänotyp, Pro-inflammatorische Eigenschaften und Fähigkeit zur Interaktion mit Immunzellen zu analysieren. Da Krebszellen oft Ungleichgewichte im Chromosom Nummer Hafen, ist es wichtig, zu entschlüsseln, wie Aneuploidie Zellphysiologie in normalen Zellen, mit dem Ziel der Aufdeckung seiner Pro und anti tumorigenic Effekte auswirkt.

Diese Methode nutzt eine in-vitro- Gewebekultur-System um aneuploiden Zellen mit komplexen Karyotyp zu isolieren, die ihre Verbreitung zu verhaften. Diese Bevölkerung wird als ArCK (Arrested mit komplexen Karyotypen) Zellen bezeichnet. Abbildung 1A zeigt das Schema des Experiments. Wildtyp Radsport RPE-1 hTERT Zellen sind an der G1/S-Grenze mit Thymidin synchronisiert und behandelt mit einem Mps1-Inhibitor, Chromosom MIS Segregation zu induzieren. Die Spindel vergiften Nocodazole ergänzt die Zellen 72 h nach Induktion der Chromosom MIS Segregation. 12 h nach der Nocodazole Behandlung der aneuploiden Zellen, noch in der Lage zu vermehren sind, geben Sie Mitose und befinden sich in dieser Phase des Zellzyklus aufgrund von Interferenzen mit Mikrotubuli Polymerisation gefangen. Diese gefangen Zellen werden dann einfach durch sanftes schütteln entfernt. Der Shake-off-Prozess soll wiederholte 3 - 5 Mal vollständige Entfernung des Radsports Zellen sichergestellt. Abbildung 1 b zeigt die repräsentative Bilder der RPE-1-Zellen in jeder Phase der Behandlung.
ArCK Zellen zeigen erhöhte der Zellzyklus-Inhibitoren, wie p53, p21 und p16 im Vergleich zu euploide und aneuploiden Zellen, Radfahren, wie in Abbildung 2Agezeigt. Darüber hinaus zeigt Abbildung 2 b positive β-Galaktosidase Färbung in ArCK Zellen im Vergleich zu euploide Kontrollzellen, eine gut etablierte Marker für zelluläre Seneszenz.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57215/57215fig2.jpg"> Abbildung 2: Repräsentative Ergebnisse unter Verwendung ArCK Zellen. (A) Western-blot Beurteilung der Zellzyklus Inhibitor Ebenen in euploide, Aneuploidie, Radfahren und ArCK Zellen. Die Ebenen von p53, p21 und p16 wurden durch western-Blot Analyse ermittelt. Aktin als laden Kontrolle diente. (B) β-Galaktosidase Färbung, die Höhe der Seneszenz in ArCK Zellen. Seneszenz-assoziierten β-Galaktosidase (β-Gal) Aktivität war in euploide und ArCK Zellen bestimmt. Skala bar 100 µm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57215/57215fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
Diese Zellzyklus Festnahme ist ein hervorstechendes Merkmal der aneuploiden Zellen mit komplexen Karyotyp, wie gezeigt durch repräsentative Karyotyp Analyse von einzelligen Sequenzierung in Abbildung 3, in dem ArCK Zellen mehrere Anzeigen zufällig Chromosom Gewinne und Verluste. Dieser Befund ist in voller Übereinstimmung mit früheren Berichte10.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57215/57215fig3.jpg"> Abbildung 3: Repräsentative einzellige Sequenzierung von ArCK Zellen. Segmentierung Grundstücke zeigen den Karyotyp der sechs repräsentative ArCK Zellen. Segmentierung Diagramme zeigen die Kopienzahl alle Chromosomen von 1 bis X bezogen auf ein euploide Verweis auf eine Log2 Skala (Wilde Typ RPE-1 ist eine diploide Zelle Linie weiblichen Ursprungs). Chromosom-Gewinne werden in rot, Chromosom Verluste in grün hervorgehoben. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57215/57215fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

Aneuploidie führt zu Genom Instabilität, die schließlich Zellzyklus verhaftet Zellen mit komplexen Karyotypen produziert. Dieses Papier stellt eine einfache und bequeme Methode zum aneuploiden Zellen mit komplexen Karyotyp zu isolieren, die aufhören zu teilen.

Generation und Isolierung des Zellzyklus verhaftet Zellen mit komplexen Karyotyp

Chromosome mis-segregation leads to aneuploidy, a condition in which cells harbor an imbalanced chromosome number. Several lines of evidence strongly ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, eine einfache Methode zur Erzeugung und Isolierung von zellzyklus-arrestierten Zellen mit komplexen Karyotypen bereitzustellen. Diese Methode kann Antworten auf zentrale Fragen der Aneuploidieforschung geben, etwa zur Interaktion des Immunsystems mit aneuploiden Zellen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine Zellpopulation erzeugt, die nur komplexe Karyotypen beherbergt.Um mit der Synchronisierung von RPE-1 hTERT-Zellen zu beginnen, verwenden Sie frisch aufgetaute Zellen und geben Sie sie mit acht Millilitern Standard-Wachstumsmedium in eine 10 Zentimeter große Gewebekulturschale. Verwenden Sie anschließend ein Hämozytometer, um die Zellzahl zu bestimmen. Inkubieren Sie die Zellen dann über Nacht.Ersetzen Sie am nächsten Tag das Standard-Wachstumsmedium durch ein Medium, das fünf Millimolare Thymidin enthält. Inkubieren Sie 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius, um die Zellen an der G1S-Grenze zu synchronisieren. Waschen Sie die Zellen nach 24 Stunden dreimal mit PBS.Geben Sie dann Standard-Wachstumsmedium zu den gewaschenen Zellen und inkubieren Sie sechs Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Waschen Sie zuerst die Zellen mit 10 Millilitern PBS. Fügen Sie dann Medium hinzu, das 500 nanomolare Mps1-Inhibitor-Reversin enthält.12 Stunden bei 37 Grad Celsius inkubieren. Waschen Sie die Zellen am nächsten Tag dreimal mit PBS. Fügen Sie dann Standard-Wachstumsmedium hinzu und stellen Sie die Platten wieder in den Inkubator.Etwa 72 Stunden nach der ersten aberranten Mitose waschen Sie die Zellen mit 10 Millilitern PBS. Fügen Sie dann Medium hinzu, das 330 nanomolare Nocodazol enthält. 12 Stunden bei 37 Grad Celsius inkubieren.Am nächsten Tag aspirieren Sie das Nocodazol-Medium. Geben Sie dann drei Milliliter PBS in die Schüssel und klopfen Sie auf die Seite des Tellers, um die mitotischen Zellen abzuschütteln. Drehen Sie die Platte zwischen jedem Klopfen, um eine gleichmäßige Entnahme der mitotischen Zellen zu ermöglichen.Nach dem ersten Abschütteln die am Deckel und am Rand der Platte anhaftende Flüssigkeit ansaugen. Überprüfen Sie dann die Platte unter dem Mikroskop bei 10-facher Vergrößerung. Waschen Sie dann die Zellen mit fünf Millilitern PBS.Als nächstes fügen Sie Medium hinzu, das 330 nanomolare Nocodazole enthält. 12 Stunden bei 37 Grad Celsius inkubieren. Nach dem abschließenden Schütteln fügst Du 10 Milliliter Standard-Wachstumsmedium hinzu.Inkubieren Sie die Zellen 12 bis 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius, bevor Sie die Assays durchführen. Die auf der Platte verbleibenden Zellen werden als mit komplexen Karyotyp- oder ArCK-Zellen arrestiert bezeichnet. Dieses Protokoll beschreibt eine einfache Methode zur Isolierung von ArCK-Zellen und es werden mehrere für ArCK-Zellen spezifische Merkmale analysiert, um ihre Isolierung zu bestätigen.ArCK-Zellen zeigen in der Immunoblot-Analyse erhöhte Spiegel der Zellzyklus-Inhibitoren p53, p21 und p16, während euploide und aneuploide Zykluszellen dies nicht tun. Darüber hinaus sind ArCK-Zellen positiv für die Seneszenz-assoziierte Beta-Galactosidase, die blau-grün färbt, während euploide Kontrollzellen dies nicht tun. Segmentierungsdiagramme zeigen, dass ArCK-Zellen aneuploid sind und durch mehrfache, zufällige Chromosomengewinne und Chromosomenverluste gekennzeichnet sind.Segmentierungsdiagramme zeigen die Kopienzahl einzelner Zellen von Chromosom eins bis X relativ zu einer euploiden Referenz-Logarithmus-Skala von zwei. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, dass Sie bei jedem Shake-off alle mitotischen Zellen entfernen. Nach Durchführung dieses Verfahrens können andere Methoden wie Zytokin-Assays durchgeführt werden.Diese Assays werden bei der Beantwortung weiterer Fragen helfen, wie z.B. der Fähigkeit von ArCK-Zellen, mit den Zellen des Immunsystems zu interagieren. Vergessen Sie nicht, dass Nocodazol gefährlich ist. Bei der Verwendung dieses Reagenzes sollte geeignete persönliche Schutzausrüstung getragen werden.Einmal gemeistert, kann diese Technik verwendet werden, um ArCK-Zellen effizient in vitro zu isolieren. Dieser Eingriff kann bei ordnungsgemäßer Durchführung in sieben Tagen durchgeführt werden.

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Krebsforschung

Karyotypisierung ist eine einfache und nützliche Technik allgemein zum Nachweis genetischer Veränderungen verwendet. Hier beschreiben wir Schritt für Schritt-Protokoll für das Chromosom verteilt Vorbereitung von menschlichen embryonalen Stammzellen für die Überwachung der chromosomalen Status dieser Zellen in Kultur gehalten.

Chromosomale Spread-Vorbereitung von humanen embryonalen Stammzellen für die Karyotypisierung

Die Mikro-seziert Explantate Technik ist eine robuste und zuverlässige Methode zur Isolierung proliferative Skelettmuskelzellen von Jugendkriminalität, adulte oder embryonale Muskeln als eine Quelle der Skelettmuskulatur Stammzellen. Einzigartig sind diese Zellen klonal abgeleitet, um Skelettmuskulatur Stammzelllinien für in vivo-Transplantation verwendet produzieren.

Adulten und embryonalen Skelettmuskel Microexplant Kultur und Isolation der Skelettmuskulatur Stem Cells

Die Bestimmung der Zellzyklus-Position eine Population von Zellen, oder zu verstehen, wie Signale Verbreitung beeinflussen, kann leicht durch Durchflusszytometrie mit diesem Protokoll gemessen werden. Wir berichten über einen einfachen experimentellen Ansatz zur Färbung von Zellen und die Quantifizierung ihrer Position in den Zellzyklus.

Analyse des Zellzyklus Position in Säugerzellen

Tracking-feine Veränderungen in der Progression und die Kinetik der Zellzyklusstadien kann durch Verwendung einer Kombination von metabolische Markierung von Nukleinsäuren mit BrdU und genomischer Gesamt-DNA-Färbung über Propidiumiodid durchgeführt werden. Dieses Verfahren vermeidet die Notwendigkeit von chemischen Synchronisation der Rad-Zellen, wodurch die Einführung von nicht-spezifischen DNA-Schäden, die sich wiederum auf den Ablauf des Zellzyklus.

Mess-Zellzyklus-Progression Kinetics mit Metabolische Markierung und Durchflusszytometrie

Chromosomen von lebenden Zellen, wie Lymphozyten oder Fibroblasten der Haut isoliert werden und aus Organismen, einschließlich Menschen oder Mäusen. Diese Chromosomen-Präparate können weitere für die Routine G-Banding und molekulare zytogenetischen Verfahren wie Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH), komparative genomische Hybridisierung (CGH), und spektrale Karyotypisierung (SKY) genutzt werden.

Chromosomenpräparation aus kultivierten Zellen

Wir berichten über zwei Zellsynchronisationsprotokolle, die einen Kontext für das Studium von Ereignissen im Zusammenhang mit bestimmten Phasen des Zellzyklus bieten. Wir zeigen, dass dieser Ansatz für die Analyse der Regulation von spezifischen Genen in einem ungestörten Zellzyklus oder bei Exposition gegenüber Mitteln, die den Zellzyklus beeinflussen, nützlich ist.

Das Studium der Zellzyklus-regulierten Genexpression durch zwei komplementäre Zellsynchronisationsprotokolle

Wir beschreiben eine Technik Durchflusszytometrie und Hochdurchsatz-Sequenzierung zu spätere replizierende Regionen des Genoms zu identifizieren, zu kombinieren.

G2-Seq: Ein hoher Durchsatz Sequenzierung-basierten Methode zur Identifizierung von spät repliziert Regionen des Genoms

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von zentrifugalen Sammelnetzwerk primäre akute lymphoblastische Leukämie-Zellen in verschiedenen Zellzyklus Phasen aufteilen.

Vorbereitung der primäre akute lymphoblastische Leukämie-Zellen in verschiedenen Zellzyklus Phasen durch zentrifugale Sammelnetzwerk

Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll für doppelte Thymidin-Synchronisation von HeLa-Zellen, gefolgt von Analyse mit hochauflösenden konfokalen Mikroskopie. Diese Methode ist Schlüssel zu große Anzahl von Zellen, die synchron von S-Phase, Mitose gehen, Studien auf mitotischen Rollen multifunktionale Proteine, die auch Interphase Funktionen besitzen.

Kombination von mitotische Zelle Synchronisation und hochauflösenden konfokalen Mikroskopie zur Untersuchung der Rolle von multifunktionalen Zelle Zyklus Proteine während der Mitose

Dieses Protokoll beschreibt eine einfache und bequeme Methode zum Beschriften und visualisieren live Chromosomen in mitotischen Zellen mit Histone2B-GFP BacMam 2.0-Gütezeichen und einer drehenden Scheibe konfokalen Mikroskopie System.

Live Cell Imaging der Segregation der Chromosomen während der Mitose

Dieses Protokoll beschreibt zwei Methoden des Hefezellzyklus-Arrests und der optionalen Freisetzung und erläutert den Einsatz von Fluoreszenzmikroskopie zur Untersuchung von zellzyklusabhängigen Prozessen in S. cerevisiae.

Manipulation und Analyse von zellzyklusabhängigen Prozessen in knospenden Hefen

Erfahren Sie eine Methode zur Isolierung von Zellzyklus-verhafteten Zellen mit komplexen Karyotypen. Diese Technik ermöglicht die Untersuchung aneuploider Zellen und ihrer Wechselwirkungen mit dem Immunsystem.

Generation und Isolierung des Zellzyklus verhaftet Zellen mit komplexen Karyotyp

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