Generation und Isolierung des Zellzyklus verhaftet Zellen mit komplexen Karyotyp

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, eine einfache Methode zur Erzeugung und Isolierung von zellzyklus-arrestierten Zellen mit komplexen Karyotypen bereitzustellen. Diese Methode kann Antworten auf zentrale Fragen der Aneuploidieforschung geben, etwa zur Interaktion des Immunsystems mit aneuploiden Zellen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine Zellpopulation erzeugt, die nur komplexe Karyotypen beherbergt.

Um mit der Synchronisierung von RPE-1 hTERT-Zellen zu beginnen, verwenden Sie frisch aufgetaute Zellen und geben Sie sie mit acht Millilitern Standard-Wachstumsmedium in eine 10 Zentimeter große Gewebekulturschale. Verwenden Sie anschließend ein Hämozytometer, um die Zellzahl zu bestimmen. Inkubieren Sie die Zellen dann über Nacht.

Ersetzen Sie am nächsten Tag das Standard-Wachstumsmedium durch ein Medium, das fünf Millimolare Thymidin enthält. Inkubieren Sie 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius, um die Zellen an der G1S-Grenze zu synchronisieren. Waschen Sie die Zellen nach 24 Stunden dreimal mit PBS.

Geben Sie dann Standard-Wachstumsmedium zu den gewaschenen Zellen und inkubieren Sie sechs Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Waschen Sie zuerst die Zellen mit 10 Millilitern PBS. Fügen Sie dann Medium hinzu, das 500 nanomolare Mps1-Inhibitor-Reversin enthält.

12 Stunden bei 37 Grad Celsius inkubieren. Waschen Sie die Zellen am nächsten Tag dreimal mit PBS. Fügen Sie dann Standard-Wachstumsmedium hinzu und stellen Sie die Platten wieder in den Inkubator.

Etwa 72 Stunden nach der ersten aberranten Mitose waschen Sie die Zellen mit 10 Millilitern PBS. Fügen Sie dann Medium hinzu, das 330 nanomolare Nocodazol enthält. 12 Stunden bei 37 Grad Celsius inkubieren.

Am nächsten Tag aspirieren Sie das Nocodazol-Medium. Geben Sie dann drei Milliliter PBS in die Schüssel und klopfen Sie auf die Seite des Tellers, um die mitotischen Zellen abzuschütteln. Drehen Sie die Platte zwischen jedem Klopfen, um eine gleichmäßige Entnahme der mitotischen Zellen zu ermöglichen.

Nach dem ersten Abschütteln die am Deckel und am Rand der Platte anhaftende Flüssigkeit ansaugen. Überprüfen Sie dann die Platte unter dem Mikroskop bei 10-facher Vergrößerung. Waschen Sie dann die Zellen mit fünf Millilitern PBS.

Als nächstes fügen Sie Medium hinzu, das 330 nanomolare Nocodazole enthält. 12 Stunden bei 37 Grad Celsius inkubieren. Nach dem abschließenden Schütteln fügst Du 10 Milliliter Standard-Wachstumsmedium hinzu.

Inkubieren Sie die Zellen 12 bis 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius, bevor Sie die Assays durchführen. Die auf der Platte verbleibenden Zellen werden als mit komplexen Karyotyp- oder ArCK-Zellen arrestiert bezeichnet. Dieses Protokoll beschreibt eine einfache Methode zur Isolierung von ArCK-Zellen und es werden mehrere für ArCK-Zellen spezifische Merkmale analysiert, um ihre Isolierung zu bestätigen.

ArCK-Zellen zeigen in der Immunoblot-Analyse erhöhte Spiegel der Zellzyklus-Inhibitoren p53, p21 und p16, während euploide und aneuploide Zykluszellen dies nicht tun. Darüber hinaus sind ArCK-Zellen positiv für die Seneszenz-assoziierte Beta-Galactosidase, die blau-grün färbt, während euploide Kontrollzellen dies nicht tun. Segmentierungsdiagramme zeigen, dass ArCK-Zellen aneuploid sind und durch mehrfache, zufällige Chromosomengewinne und Chromosomenverluste gekennzeichnet sind.

Segmentierungsdiagramme zeigen die Kopienzahl einzelner Zellen von Chromosom eins bis X relativ zu einer euploiden Referenz-Logarithmus-Skala von zwei. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, dass Sie bei jedem Shake-off alle mitotischen Zellen entfernen. Nach Durchführung dieses Verfahrens können andere Methoden wie Zytokin-Assays durchgeführt werden.

Diese Assays werden bei der Beantwortung weiterer Fragen helfen, wie z.B. der Fähigkeit von ArCK-Zellen, mit den Zellen des Immunsystems zu interagieren. Vergessen Sie nicht, dass Nocodazol gefährlich ist. Bei der Verwendung dieses Reagenzes sollte geeignete persönliche Schutzausrüstung getragen werden.

Einmal gemeistert, kann diese Technik verwendet werden, um ArCK-Zellen effizient in vitro zu isolieren. Dieser Eingriff kann bei ordnungsgemäßer Durchführung in sieben Tagen durchgeführt werden.