Name: Isolierung und Erweiterung zytotoxischer Cytokin-induzierter Killer-T-Zellen zur Krebsbehandlung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: Lernen Sie die Isolierung und Expansion zytotoxischer CIK-Zellen aus PBMCs für die Krebsimmuntherapie. Diese standardisierte Methode ermöglicht die Quantifizierung der Zellpotenz in Forschung und Klinik.

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Diese Studie wurde vom China Medical University Hospital (DMR-Cell-1809) unterstützt.

Das klinische Protokoll wurde in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Institutional Review Board der China Medical University and Hospital Research Ethics Committee durchgeführt und genehmigt. Periphere Blutproben wurden von gesunden Probanden mit ihrer informierten Zustimmung geerntet.
1. Herstellung von Materialien
<ol><li>Bewahren Sie Reagenzien, Antikörper und Chemikalien auf, wie im Sicherheitsdatenblatt (MSDS) dargestellt. Die Medikamente oder Zytokine in Lösungsmitteln als Stofflösungen auflösen und dann bei -20 °C oder -80 °C lagern. ANMERKUNG: Detaillierte Informationen zur Materialaufbereitung sind in der Materialtabelleaufgeführt.</li>
</ol>2. PBMC-Isolierung
<ol><li>Erwärmen Sie die Dichtegradientenlösung (Materialtabelle) vor der Verwendung auf 18–20 °C. Invertieren Sie die Lösungsflasche mehrmals, um eine gründliche Durchmischung zu gewährleisten.</li>
	<li>Sammeln Sie 3-5 ml menschliche venöse Blutprobe in einer heparinisierten Durchstechflasche und mischen Sie gut, indem Sie die Röhre mehrmals sanft invertieren.</li>
	<li>Bereiten Sie 4 ml Dichtegradientenlösung in einem 15 ml sterilen Rohr vor.</li>
	<li>Schicht 1 ml der Blutprobe vorsichtig auf die Dichtegradientenlösung.</li>
	<li>Zentrifuge bei 400 x g für 30 min bei 18 bis 20 °C (Pause ausschalten).</li>
	<li>Die buffy Schicht der mononukleären Zellen (ca. 1 ml) sofort vorsichtig und sofort ansaugen, um zu vermeiden, dass die Schichten mit einer 1 ml sterilen Pipette zu einem sterilen 15 ml-Rohr gestört werden.</li>
	<li>Fügen Sie dem Buffy-Mantel im Zentrifugenrohr mindestens 3 Bände (ca. 3 ml) Phosphat-gepufferte Saline (PBS) hinzu. Hängen Sie die Zellen an, indem Sie sie mindestens 3x mit einer sterilen Pipette auf und ab pfeifen.</li>
	<li>Zentrifuge bei 400 x g für 10 min bei 18 bis 20 °C. Aspirieren Sie den Überstand.</li>
	<li>Das Zellpellet mit 5 ml Basalmedium (Materialtabelle) aufhängen und in einen Kolben geben. Kultur die Zellen in einem Zellkultur-Inkubator bei 37 °C und 5%CO2.</li>
</ol>3. CIK-Induktion und -Erweiterung
<ol><li>An Tag 0 die PBMCs (1 x 106) in frischem Basalmedium mit 1.000 I.E./ml IFN-N für 24 h in einem befeuchteten Zellkultur-Inkubator bei 37 °C und 5%CO2kulturieren.</li>
	<li>Erfrischen Sie am 1. Tag das Medium mit einem frischen Basalmedium, das 50 ng/ml Anti-CD3-Antikörper, 1 ng/ml rh IL-1 und 1.000 U/ml rh IL-2 enthält. Erfrischen Sie das Medium alle 3 Tage.</li>
	<li>Erfrischen Sie das Medium an Tag 7 mit einem frischen Basalmedium, das 1.000 U/ml rh IL-2 enthält. Erfrischen Sie das Medium alle 3 Tage bis zum Ende der Zellexpansion (Tag 14).</li>
</ol>4. Immunophenotypisierung zur Beurteilung von KIK-Zellen
<ol><li>Waschen Sie die CIK-Zellen mit 10 ml sterilem PBS. Zentrifugieren Sie 10 min bei 300 x g und 18 x 20 °C, aspirieren Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen mit 10 ml PBS wieder auf. Zählen Sie die Zellzahl und die Lebensfähigkeit der Testzelle mit dem Trypan-Blau-Ausschluss-Assay.</li>
	<li>Aliquot die CIK-Zellen in sechs sterile 1,5 ml-Röhren mit einer Dichte von 5–10 x 105 Zellen/ml PBS. Etikettieren und behandeln Sie wie folgt: Tube 1, Blank (kein Antikörper); Tube 2, fügen Sie 20 l Isotyp IgG1-FITC hinzu; Tube 3, fügen Sie 20 l Isotyp IgG1-APC mAbs hinzu; Tube 4, fügen Sie 20 L CD3-FITC hinzu; Tube 5, fügen Sie 20 L CD56-APC mAbs hinzu; und Tube 6, fügen Sie 20 l CD3-FITC und 20 l CD56-APC mAbs hinzu.</li>
	<li>Mischen Sie die CIK-Zellen vorsichtig mit den Antikörpern, indem Sie sie mindestens 3x mit einer 1 ml sterilen Pipette nach oben und unten pfeifen und dann 30 min bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Rohre für 10 min bei 300 x g und 18 x 20 °C. Aspirieren Sie den Überstand und hängen Sie das Zellpellet einmal mit 1 ml PBS aus. Pfeifen Sie sie mindestens 3x mit einer 1 ml sterilen Pipette nach oben und unten.</li>
	<li>Wiederholen Sie Schritt 4.4.</li>
	<li>Lassen Sie die Rohre im Dunkeln, bevor Sie zytometrische Analysen durchfließen.</li>
</ol>5. CD-Marker-Erkennung
<ol><li>Übertragen Sie die Zellsuspension auf ein steriles 5 ml Polystyrol-Rundbodenrohr mit einer Zellsiebkappe (100 m Netz), indem Sie sanft durch die Kappe pipetieren. Setzen Sie die Rohre auf das Karussell in Ordnung.</li>
	<li>Öffnen Sie die Flow-Cytometrie-Analysesoftware, und erstellen Sie einen experimentellen Ordner. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Neue Probe", um dem Experiment eine Probe und ein Rohr hinzuzufügen, und benennen Sie die Rohre wie folgt: Tube 1, Blank; Rohr 2, Isotype IgG1-CD3; Rohr 3, Isotype IgG1-CD56; Tube 4, CD3; Tube 5, CD56; Tube 6, CD3CD56.</li>
	<li>Erstellen Sie ein Streuungs-Gating-System für die CIK-Zellpopulationen (Abbildung 2A).<ol>
<li>Wählen Sie Tube 1 (Blank) und klicken Sie auf die Schaltfläche Punktdiagramm, um ein FSC-A/SSC-A-Plot zu erstellen. Zeichnen Sie ein Rechtecktor über die gesamte Zellpopulation mit einem FSC-A-Schwellenwert >5 x 104, um Zellablagerungen auszuschließen.</li>
		<li>Wählen Sie den Parameter SSC-A/SSC-H für das neue Punktdiagramm aus, und zeichnen Sie ein Polygontor um alle einzelnen Zellen. Wählen Sie den Parameter Count/FITC (CD3) und Count/APC (CD56) für das neue Histogrammdiagramm aus. Wählen Sie den Parameter FITC (CD3)/APC (CD56) für das neue Punktdiagramm aus, und zeichnen Sie ein Vier-Quadranten-Gate, um die vier Subpopulationen zu definieren.</li>
		<li>Zeichnen Sie die Daten von 20.000 Einzelzellen in jeder Probe auf. Klicken Sie auf die Schaltfläche Sample laden, um zuerst das Blank-Steuerelementbeispiel zu analysieren. Identifizieren Sie die gesamte CIK-Zellpopulation mithilfe der Kanalparameter CD56 und CD3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wiederholen Sie Schritt 5.3 für die Untersuchung aller Proben.</li>
	<li>Öffnen Sie die Dateien, die die statistischen Werte der einzelnen Probe enthalten, um CIK-Zellpopulationen zu analysieren, und drucken Sie sie in Analysedateien neu aus.</li>
</ol>6. Kultivieren und Färben von humanen chronischen myeloischen Leukämie K562 Zellen und Eierstockkrebs OC-3 Zellen
<ol><li>K562-Zellen<ol>
<li>Kultur K562-Zellen in vollständigen Medien (RPMI-Basalmedium mit 10% fetalem Rinderserum [FBS] und 50 U/ml Antibiotika und Anpassung der Glukose auf 4,5 g/L) mit einer Dichte von 0,5 x 106 Zellen/ml in einem Zellkulturkolben und inkubieren in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C und 5%CO2.</li>
		<li>Übertragen Sie die Kulturmedien, die die K562-Zellen enthalten, in 50 ml sterile Schläuche und pelleten Sie die Zellen am Tag des Experiments bei 300 x g für 10 min bei 18 bis 20 °C.</li>
		<li>Aspirieren Sie den Überstand, setzen Sie die Zellen in 5 ml sterilem PBS wieder auf und mischen Sie sie gut.</li>
		<li>Pellet die Zellen bei 300 x g für 10 min. Aspirieren Sie den Überstand, suspendieren Sie die Zellen in PBS, und passen Sie die K562-Zellen auf eine Konzentration von 0,5-1 x 106 Zellen/ml an.</li>
		<li>Fügen Sie 0,5 l CFSE-Farbstoff in die 1 ml K562-Zellsuspension in einem 15 ml sterilen Rohr mit einer Endkonzentration von 5 m hinzu. Mischen Sie die Aufhängung vorsichtig, indem Sie mindestens 3x nach oben und unten pfeifen.</li>
		<li>Lassen Sie die Röhre in einem Zellkultur-Inkubator bei 37 °C und 5%CO2 für 10–15 min.</li>
		<li>Fügen Sie 9 ml PBS in das Rohr und Pellet die Zellen bei 300 x g für 10 min. Dekant den Überstand und dann hängen Sie das Zellpellet in 10 ml der gesamten Medien. Übertragen Sie die Zellsuspension in einen Zellkulturkolben und legen Sie sie in den Inkubator.</li>
	</ol>
</li>
	<li>OC-3-Zellen<ol>
<li>Kultur OC-3-Zellen in vollständigen Medien (DMEM/F12-Medium mit 10% FBS und 50 U/ml Antibiotika) mit einer Dichte von 0,5–1 x 106 Zellen in einem Zellkulturkolben bei 37 °C und 5%CO2.</li>
		<li>Saugen Sie die Kulturmedien und waschen Sie die Zellen mit PBS 1 Tag vor dem Experiment.</li>
		<li>Lösen Sie die Zellen durch Zugabe von 1 ml Zelldissoziationsenzymlösung (Materialtabelle) und inkubieren Sie sie 5 min bei 37 °C.</li>
		<li>Setzen Sie die Zellen durch Hinzufügen von 5 ml PBS und mischen Sie gut sanft. Pellet die Zellen bei 300 x g für 10 min und aspirieren den Überstand. Setzen Sie die Zellen in PBS wieder aus und passen Sie die Zellen auf eine Konzentration von 0,5–1 x 106 Zellen/ml an.</li>
		<li>Fügen Sie 0,5 l CFSE-Farbstoff zu 1 ml der OC-3-Zellsuspension in einem 15 ml sterilen Rohr bei einer Endkonzentration von 5 m hinzu. Mischen Sie die Aufhängung vorsichtig, indem Sie mindestens 3x nach oben und unten pfeifen.</li>
		<li>Lassen Sie die Röhre in einem Zellkultur-Inkubator bei 37 °C und 5%CO2 für 10–15 min.</li>
		<li>Fügen Sie 9 ml PBS in das Rohr und Pellet die Zellen bei 300 x g für 10 min. Dekant den Überstand und dann hängen Sie das Zellpellet mit vollständigen Medien. 5 x 105 Zellen/gut in eine 6-Well-Platte geben und in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C und 5%CO2 über Nacht inkubieren.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Zytotoxischer Assay
<ol><li>Kokultur von CIK- und K562-Zellen (CIK-K562)<ol>
<li>Zählen Sie die K562-Zellen aus Schritt 6.1.7 und testen Sie die Zelllebensfähigkeit durch Trypan-Blau-Ausschluss-Assay. Fügen Sie 1 ml K562-Zellen zu jedem Brunnen in eine 6-Well-Platte mit einer Dichte von 5 x 105/ml hinzu.</li>
		<li>1 ml Basalmedium mit oder ohne KIK-Zellen ab Schritt 3.4 zur 6-Well-Platte ab Schritt 7.1.1 wie folgt hinzufügen: Gut 1 = Leer, K562-Zellen allein (5 x 105); Gut 2 = CFSE-gefärbte K562-Zellen allein (5 x 105); Gut 3 = KIK-Zellen (E [Effektor], 25 x 105) + CFSE-gefärbte K562-Zellen (T [Ziel], 5 x 105); Gut 4 = KIK-Zellen (E, 50 x 105) + CFSE-gebeizte K562-Zellen (T, 5 x 105).</li>
		<li>Mischen Sie die Zellsuspensionen, indem Sie sie mindestens 3x nach oben und unten pfeifen. Legen Sie die Platte 24 h im Inkubator auf.</li>
	</ol></li>
	<li>Kokultur von CIK- und OC-3-Zellen (CIK-OC-3)<ol>
<li>1 ml Basalmedium mit oder ohne KIK-Zellen ab Schritt 3.4 zur 6-Well-Platte ab Schritt 6.2.7 wie folgt hinzufügen: Gut 1 = Leer, OC-3-Zellen allein (5 x 105); Gut 2 = CFSE-gefärbte OC-3-Zellen allein (5 x 105); Gut 3 = KIK-Zellen (E, 25 x 105) + CFSE-gebeiztoc-3-Zellen (T, 5 x 105); Gut 4 = KIK-Zellen (E, 50 x 105) + CFSE-gefleckte OC-3-Zellen (T, 5 x 105).</li>
		<li>Mischen Sie die Zellsuspensionen, indem Sie sie mindestens 3x nach oben und unten pfeifen. Legen Sie die Platte in den Inkubator für 24 h.</li>
	</ol></li>
	<li>7-Aminoactinomycin D (7-AAD) Farbstofffärbung<ol>
<li>Die CIK-K562 Zellsuspension ab Schritt 7.1.3 direkt in ein 15 ml steriles Rohr ernten.</li>
		<li>Ernte sowohl die Suspension sondienen als auch die anhaftenden Zellen aus den CIK-OC-3-Gruppen ab Schritt 7.2.2.<ol>
<li>Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 15 ml steriles Rohr. Waschen Sie den Brunnen mit 1 ml sterilem PBS, sammeln Sie das PBS, und fügen Sie das Rohr hinzu. Fügen Sie 0,5 ml Zelldissoziationsenzymlösung hinzu und brüten Sie 5 min bei 37 °C.</li>
			<li>Fügen Sie 1 ml der Lösung aus dem gleichen Rohr in den entsprechenden Brunnen und mischen Sie die Zellen sanft, indem Sie sie mindestens 3x mit einer 1 ml sterilen Pipette nach oben und unten pipetieren. Sammeln Sie alle Zellen in der gleichen Röhre.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Zentrifugieren Sie bei 300 x g für 10 min, aspirieren Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen in 1 ml sterilem PBS wieder aus. Pellet die Zellen bei 300 x g für 10 min, aspirieren Sie den Überstand, und resuspendieren Zellen in 100 l sterilen PBS.</li>
		<li>Fügen Sie der Zellsuspension 5 l 7-AAD-Farbstoff (50 ng/L-Bestand) hinzu. Mischen Sie die Zellen vorsichtig, indem Sie sie mindestens 3x mit einer 1 ml sterilen Pipette nach oben und unten pfeifen. 10 min inkubieren und vor der Analyse im Dunkeln lassen.</li>
	</ol></li>
	<li>Zytolytische Fähigkeit Assay<ol>
<li>Mischen Sie die Zellsuspension ab Schritt 7.3.4 und wiederholen Sie die Schritte 5.1 und 5.2 einmal.</li>
		<li>Klicken Sie auf die Schaltfläche Neue Probe, um dem Experiment eine Probe und ein Rohr hinzuzufügen, und benennen Sie die Röhren wie folgt: nur Tube 1, K562 (oder OC-3); Tube 2, CFSE-gebeizt K562 (oder OC-3) Zellen nur; Rohr 3, E:T = 5:1; Rohr 4, E:T = 10:1.</li>
		<li>Erstellen Sie ein Streuungs-Gating-System für den zytolytischen Assay (Abbildung 3A).<ol>
<li>Wählen Sie Tube 1 und klicken Sie auf die Schaltfläche Punktdiagramm, um ein FSC-A/SSC-A-Plot zu erstellen. Zeichnen Sie ein Rechtecktor über alle Ereignisse mit einem FSC-A-Schwellenwert >5 x 104, um Zellablagerungen auszuschließen.</li>
			<li>Wählen Sie den Parameter SSC-A/CFSE für das neue Punktdiagramm aus. Wählen Sie den 7-AAD/CFSE-Parameter für das neue Punktdiagramm aus, und zeichnen Sie ein Vier-Quadranten-Gate, um die vier Subpopulationen zu definieren.</li>
			<li>Klicken Sie auf die Schaltfläche Sample laden, um zuerst das leere Steuerelementbeispiel zu analysieren.</li>
			<li>Stellen Sie die Spannung von SSC-A und FSC-A ein. Identifizieren Sie die Totzellenpopulation mithilfe der CFSE- und 7-AAD-Kanalparameter. Zeichnen Sie die Daten aus >20.000 CFSE+ Zellen in jeder Probe auf.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Wiederholen Sie Abschnitt 7.4.6 für die Untersuchung aller Proben.</li>
		<li>Öffnen Sie die Dateien, die die statistischen Werte der einzelnen Proben enthalten, um die nicht lebensfähigen Zellpopulationen zu analysieren und die Daten in Analysedateien zu exportieren.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren erklären keine konkurrierenden Konflikte von finanziellen Interessen.

Die beschriebene Methode ist ein schnelles, bequemes und zuverlässiges Protokoll zur Isolierung und Ausdehnung von zytotoxischen Zytokin-induzierten Killer-T-Zellen aus Vollblutproben gesunder Spender. Es zeigt auch die zytotoxische Wirkung von CIK gegen Leukämie (K562) und Eierstockkrebszellen (OC-3) mit einem Flow-Zytometrie-Setup und Tracking-System (CS & T). KIK-Zellen können unter guten manufakturen Praktiken (GMP) induziert und erweitert werden, indem GMP-Grade-Zytokine und serumfreies Medium für weitere klinische ...

Zytotoxische T-Lymphozyten sind eine spezifische Immuneffektor-Zellpopulation, die Immunreaktionen gegen Krebs vermittelt. Mehrere Effektorzellpopulationen, einschließlich Lymphokin-aktivierte Killerzellen (LAK), tumorinfiltrierende Lymphozyten (TILs), natürliche Killerzellen (NK), T-Zellen und Zytokin-induzierte Killerzellen (CIK) wurden für die Adoptiv-T-Zelltherapie (ACT) entwickelt1. Das Interesse an KIK-Zellen wächst, da sie eine Mischung aus zytokininduzierten zytotoxischen Zellpopulationen darstellen, die aus autologen peripheren mononukleären Blutzellen (PMBCs)2erweitert werden.
Das unkontrollierte Wachstum von lymphoiden Vorläuferzellen, Myeloblasten und Lymphoblasten führt zu drei Haupttypen von Blutkrebs (z. B. Leukämie, Lymphom und Myelom), soliden Tumoren, einschließlich Karzinome (z. B. Lungenkrebs, Magenkrebs, Gebärmutterhalskrebs) und Sarkome, unter anderemKrebs3. KIK-Zellen sind eine Mischung von Zellpopulationen, die eine breite Palette von großen Histokompatibilitätskomplex (MHC) -unbeschränkte Antitumor-Aktivität aufweisen und damit Versprechen für die Behandlung von hämatologischen und fortgeschrittenen Tumoren4,5,6,7. KIK-Zellen bestehen aus einer Kombination von Zellen, einschließlich T-Zellen (CD3+CD56),NK-T-Zellen (CD3+CD56+), und NK-Zellen (CD3–CD56+). Die Optimierung des CIK-Induktionsprotokolls durch Verwendung eines festen Zeitplans für die Zugabe von IFN-, Anti-CD3-Antikörpern und IL-2 führt zur Erweiterung der CIK-Zellen8. Die zytotoxische Fähigkeit von CIK-Zellen gegen Krebszellen hängt hauptsächlich von der Beteiligung von NK-Gruppe 2-Mitglied D (ein Mitglied der C-Typ-Lektin-ähnlichen Rezeptorfamilie) NKG2D Liganden auf Tumorzellen und von Perforin-vermittelten Bahnen9ab. Die Ergebnisse einer präklinischen Studie zeigten, dass IL-15-stimulierte CIK-Zellen eine starke Zytotoxizität gegen primäre und akute myeloische Leukämie-Zelllinien in vitro induzierten und eine geringere Alloreaktivität gegen normale PBMCs und Fibroblasten9zeigten. Kürzlich wurde das Ergebnis einer einmaligen gesunden, von Spendern abgeleiteten CIK (1 x 108/kg CD3+ Zellen) ineiner Infusion als Konsolidierung nach nichtmyeloablativer allogener Transplantation zur Behandlung myeloider Neoplasmen in einer klinischen Phase-II-Studie veröffentlicht10.
In der vorliegenden Studie entwickelten wir eine optimierte Zellkulturformel, die aus IFN-, IL-1,, Anti-CD3-Antikörpern und IL-2 besteht, die dem hämatopoetischen Zellmedium hinzugefügt wurden, um die KIK-Produktion zu erhöhen, und untersuchten die zytotoxische Wirkung von CIK-Zellen gegen menschliche chronische myeloische Leukämie (K562) und Eierstockkrebs (OC-3).

<table><tbody><tr><td>7-Amino-Actinomycin D</td><td>BD</td><td>559925</td><td></td></tr><tr><td>APC Maus Anti-Human-CD56-Antikörper</td><td>BD</td><td>555518</td><td>B159</td></tr><tr><td>APC Maus IgG1 & Kappa; Isotypkontrolle</td><td>BD</td><td>555751</td><td>MOPC-21</td></tr><tr><td>BD FACSCanto II Durchflusszytometer</td><td>BD</td><td>338962</td><td></td></tr><tr><td>Carboxyfluoresceindiacetat-Succinimidylester (CFSE)</td><td>BD</td><td>565082</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glukoselösung</td><td>SIGMA</td><td>G8644</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium/F12</td><td>HyClone</td><td>SH30023.02</td><td></td></tr><tr><td>Fetales Rinderserum</td><td>HyClone</td><td>SH30084.03</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Plus</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>71101700-EK</td><td></td></tr><tr><td>FITC Maus Anti-Human-CD3-Antikörper</td><td>BD</td><td>555332</td><td>UCHT1</td></tr><tr><td>FITC Maus IgG1 & kappa; Isotypkontrolle</td><td>BD</td><td>555748</td><td>MOPC-21</td></tr><tr><td>humanes Anti-CD3 mAb</td><td>TaKaRa</td><td>T210</td><td>OKT3</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Proleukin</td><td>NOVARTIS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>rekombinantes humanes Interferon-gamma</td><td>CellGenix</td><td>1425-050</td><td></td></tr><tr><td>rekombinantes humanes Interleukin-1 alpha</td><td>PEPROTECH</td><td>200-01A</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640 Medium</td><td>Gibco</td><td>11875-085</td><td></td></tr><tr><td>Sigma 3-18K Zentrifuge</td><td>Sigma</td><td>10295</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzym</td><td>Gibco</td><td>12605028</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 15 medium</td><td>Lonza</td><td>04-418Q</td><td></td></tr></tbody></table>

isolierung und erweiterung zytotoxischer cytokin-induzierter killer-t-zellen zur krebsbehandlung

Isolation and Expansion of Cytotoxic Cytokine-induced Killer T Cells for Cancer Treatment

Die Adoptivzellimmuntherapie konzentriert sich auf die Wiederherstellung der Krebserkennung über das Immunsystem und verbessert die effektive Tötung von Tumorzellen. Zytokin-induzierte Killer (CIK) T-Zell-Therapie wurde berichtet, um erhebliche zytotoxische Wirkungen gegen Krebszellen ausüben und die Nebenwirkungen von Chirurgie, Bestrahlung, und Chemotherapie in Krebsbehandlungen zu reduzieren. CIK kann aus peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs), Knochenmark und Nabelschnurblut gewonnen werden. KIK-Zellen sind eine heterogene Subpopulation von T-Zellen mit CD3+CD56+ und natürlichen Killer (NK) phänotypic Eigenschaften, die großen Histokompatibilitätskomplex (MHC) -unbeschränkte Antitumoraktivität enthalten. Diese Studie beschreibt eine qualifizierte, klinisch anwendbare, strömungszytometriebasierte Methode zur Quantifizierung der zytolytischen Fähigkeit von PBMC-abgeleiteten CIK-Zellen gegen hämatologische und feste Krebszellen. Im zytolytischen Assay werden KIK-Zellen in unterschiedlichen Verhältnissen mit vorgefärbten Zieltumorzellen kokubiert. Nach der Inkubationszeit wird die Anzahl der Zielzellen durch einen Nukleinsäure-bindenden Fleck bestimmt, um abgestorbene Zellen zu erkennen. Diese Methode ist sowohl für Forschungs- als auch für Diagnoseanwendungen anwendbar. KIK-Zellen besitzen eine starke Zytotoxizität, die als alternative Strategie für die Krebsbehandlung nach ihrer präklinischen Bewertung durch ein Zytometer-Setup- und Tracking-basiertes Durchflusszytometriesystem (CS & T) untersucht werden könnte.

Ziel dieses Protokolls ist es, Zytokin-induzierte Killerzellen (CIK) t-Zellen aus peripheren Blutmonozyten zu isolieren und zu erweitern und die zytotoxische Wirkung von CIK gegen hämatologische Malignität bzw. feste Krebszellen zu bewerten. Die Induktion von CIK wurde durch die CD3/CD56-Erkennung identifiziert. Abbildung 1A zeigt das Protokoll für DIE CIK-Induktion und -Erweiterung. Die repräsentativen Ergebnisse der Gating-Strategie zur Analyse der Teilpopulation von CD3<s...

Hier stellen wir ein Protokoll zur Isolierung und Ausdehnung von peripheren mononukleären Blutzellen dar, die von Zytokin-induzierten CD3+CD56+ Killerzellen abgeleitet wurden, und ihre Zytotoxizitätswirkung gegen hämatologische und feste Krebszellen anhand eines in vitro-diagnosebasierten Durchflusszytometriesystems zu veranschaulichen.

Isolierung und Erweiterung zytotoxischer Cytokin-induzierter Killer-T-Zellen zur Krebsbehandlung

Adoptive cellular immunotherapy focuses on restoring cancer recognition via the immune system and improves effective tumor cell killing. Cytokine-induced ...

Wir haben eine hochqualifizierte und klinisch anwendbare Methode zur Erweiterung von PBMC-abgeleiteten Cytokin-induzierten Killer-T-Zellen und zur Bewertung ihrer Zytotoxizität gegen Krebs optimiert. Der Vorteil dieser Technik besteht darin, ein Standard-Betriebsverfahren für Techniker und Kliniker bereitzustellen, um die Wirksamkeit von Zytokin-induzierten Killerzellen sowohl in der wissenschaftlichen Forschung als auch in der klinischen Bewertung zu quantifizieren. Beginnen Sie dieses Verfahren mit einer Vorbereitung von KIK-Zellen, wie im Textprotokoll beschrieben, und waschen Sie dann die CIK-Zellen mit 10 Milliliter sterilen PBS.Zentrifuge für 10 Minuten bei 300 mal G und 18 bis 20 Grad Celsius. Aspirieren Sie den Überstand und suspendieren Sie die Zellen mit fünf MilliliterPBS. Zählen Sie die Zellzahlen und die Lebensfähigkeit der Testzelle mit dem Trypan-Blau-Ausschluss-Assay.Aliquot die CIK-Zellen in sechs sterile 1,5 Milliliter-Röhren mit einer Dichte von etwa 5 bis 1 Million Zellen pro Milliliter PBS. Beschriften und behandeln Sie die Zellen wie im Textprotokoll beschrieben. Mischen Sie die CIK-Zellen vorsichtig mit den Antikörpern, indem Sie mindestens dreimal mit einer

isolation-expansion-cytotoxic-cytokine-induced-killer-t-cells-for

Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

Ex vivo Expansion von Tumor-reaktiven T-Zellen mittels Bryostatin 1/Ionomycin und der Gemeinsamen gamma-Kette Zytokine Formulation

Hier beschreiben wir eine Methode, um effizient zu erweitern und zu reinigen eine große Anzahl von menschlichen NK-Zellen und beurteilen ihre Funktion.

Expansion, Reinigung und Functional Assessment of Human peripheren Blut NK-Zellen

In diesem Video demonstrieren wir eine auf Durchflusszytometrie basierende Technik zur Bestimmung des Anteils von Zytokin-induzierten Killer-T-Zellen, CIK-Zellen, die aus einer mononukleären Zellkultur aus dem peripheren Blut expandiert wurden.

CD-Markererkennung von humanen Zytokin-induzierten Killerzellen mittels Durchflusszytometrie

Dieses Video demonstriert eine in vitro Technik, um die zytotoxische Fähigkeit von Zytokin-induzierten Killerzellen (CIK) gegen Krebszellen zu messen. Bei der Co-Kultivierung von Zielkrebszellen mit CIK-Zellen werden die toten Krebszellen mit einem fluoreszierenden Viabilitätsfarbstoff identifiziert und mittels Durchflusszytometrie quantifiziert, um die zytotoxische Wirkung von CIK-Zellen abzuschätzen.

Ein In-vitro-Assay zur Untersuchung der zytotoxischen Fähigkeit von Zytokin-induzierten Killerzellen

Wir beschreiben ein schnelles und robustes Protokoll, um invariante natürliche Killer-T-Zellen (iNKT) aus Mausmilz anzureichern und sie in vitro auf geeignete Zahlen für In-vitro- und In-vivo-Studien zu erweitern.

Aufreinigung und Expansion von mausinvarianten natürlichen Killer-T-Zellen für in vitro und in vivo Studien

Das Protokoll stellt ein Krebsimmuntherapiemodell mit zellbasierter Tumorimpfung mit Flt3L-exprimierendem B16-F10-Melanom vor. Dieses Protokoll demonstriert die Verfahren, einschließlich der Vorbereitung kultivierter Tumorzellen, der Tumorimplantation, der Zellbestrahlung, der Messung des Tumorwachstums, der Isolierung intratumoraler Immunzellen und der Durchflusszytometrieanalyse.

Experimentelles Melanom-Immuntherapiemodell mit Tumorimpfung mit einem hämatopoetischen Zytokin

Wir beschreiben eine Methode, um tumorinfiltrierende Lymphozyten (TILs) von Mäusen mittels Durchflusszytometrie für den adoptiven Zelltransfer zu nutzen. Dieses Protokoll zielt darauf ab, die spezifische Zytotoxizität von TILs gegen Tumore in einem syngenen Pankreaskarzinom-Mausmodell zu verifizieren und Einblicke in die Entwicklung adoptiver Zelltherapien für Bauchspeicheldrüsenkrebs zu geben.

Durchflusszytometrie-basierte Isolierung und therapeutische Bewertung von tumorinfiltrierenden Lymphozyten in einem Mausmodell für Bauchspeicheldrüsenkrebs

Das vorliegende Protokoll beschreibt einen experimentellen Arbeitsablauf, der die ex vivo Analyse der Stimulation humaner T-Zellen in einem allogenen Co-Kultursystem mit vorbehandelten Tumorzellen ermöglicht.

Analyse der Aktivität humaner T-Zellen in einer allogenen Co-Kultur von vorbehandelten Tumorzellen

Dieses Protokoll beschreibt die in vivo Reprogrammierung von Krebszellen der Maus in dendritisch-ähnliche Zellen vom Typ 1 innerhalb der Tumormikroumgebung durch erzwungene Expression der Transkriptionsfaktoren PU.1, IRF8 und BATF3.

Steuerbare in vivo Reprogrammierung von Tumorzellen zu konventionellen dendritischen zellähnlichen Zellen vom Typ 1

Dieses Protokoll beschreibt eine skalierbare Methode zur Erweiterung von Adoptive Cell Therapies (ACT)-Produkten, nämlich Chimeric Antigen Receptor (CAR)-T-Zellen und Cytokine-Induced Killer (CIK)-Zellen, mit gasdurchlässigen Rapid Expansion (G-Rex)-Geräten, die ein effizientes und robustes Wachstum in einem klinisch relevanten Kontext nachweisen.

Effiziente und schnelle Erzeugung von CAR-T- und zytokininduzierten Killerzellen in GMP-skalierbaren Geräten

Lernen Sie die Isolierung und Expansion zytotoxischer CIK-Zellen aus PBMCs für die Krebsimmuntherapie. Diese standardisierte Methode ermöglicht die Quantifizierung der Zellpotenz in Forschung und Klinik.

Isolierung und Erweiterung zytotoxischer Cytokin-induzierter Killer-T-Zellen zur Krebsbehandlung

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