Korrelative Licht Elektronenmikroskopie (CLEM) für die Verfolgung und Imaging virales Protein verbundenen Strukturen in den Cryo-immobilisierten Zellen
7. September 2018
Eine Korrelative Licht Elektronenmikroskopie (CLEM) Methode gilt für virusbedingte intrazellulären Bildstrukturen über Elektronenmikroskopie (EM) in Zellen, die zuvor durch Lichtmikroskopie (LM) ausgewählt werden. LM und EM sind kombiniert als bildgebende Hybridansatz, eine integrierte Ansicht der Virus-Wirt Interaktionen zu erreichen.
Diese Methode hilft, Schlüsselfragen im Bereich der Biologie zu beantworten, wie Bioproteine, die sich in zellulären Membranen befinden, Umgebungen schaffen, die die Bioreplikation und -assemblierung begünstigen. Die beiden technischen Eckpfeiler, die hier kombiniert werden, sind zum einen die Korrelation zwischen Lebendzell-Imaging und Elektronenmikroskopie und zum anderen das Hochdruckgefrieren. Obwohl diese Methode entwickelt und erfolgreich eingesetzt wurde, um Wechselwirkungen mit Virusquellen zu bekämpfen, kann sie leicht auf eine Reihe von Anwendungen in der Zellbiologie verallgemeinert werden. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da es viele Schritte gibt, die praktische Erfahrung erfordern, um erfolgreich zu sein, insbesondere die Kryo-Immobilisierung durch Hochdruckgefrieren und die nachfolgenden Schritte. Beginnen Sie damit, gemusterte Saphirscheiben mit einem alphanumerischen Muster, das auf eine ihrer Oberflächen geätzt ist, in ein konisches 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen zu legen und die Scheiben gründlich mit Ethanol zu waschen. Legen Sie die gewaschenen Saphirscheiben zum Trocknen in eine mit Filterpapier ausgelegte Petrischale und übertragen Sie die getrockneten Saphirscheiben mit einer langen, schlanken Pinzette auf Objektträger. Bestätigen Sie mit einem inversen Mikroskop bei 4-facher Vergrößerung, dass das Koordinatenmuster auf jeder Saphirscheibe lesbar ist. Sterilisieren Sie dann die Scheiben fünf Minuten lang mit einem ultravioletten Vernetzer. Geben Sie in einer Biosicherheitswerkstatt die Hälfte des Zellkulturmediums in eine Zellkulturschale und geben Sie die Saphirscheiben vorsichtig mit einer langen Pinzette in die Schale. Dann 1x10 säen
Übersicht
Dieser Artikel stellt eine korrelative Licht-Elektronenmikroskopie (CLEM)-Methode zur Visualisierung virusinduzierter intrazellulärer Strukturen vor. Durch die Kombination von Lichtmikroskopie (LM) und Elektronenmikroskopie (EM) können Forscher Einblicke in Virus-Wirt-Interaktionen gewinnen.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Zellbiologie
- Mikroskopietechniken
- Virus-Wirt-Interaktionen
Hintergrund
- Die Methode kombiniert Live-Cell-Imaging mit der Elektronenmikroskopie.
- Das Hochdruckgefrieren ist ein entscheidender Bestandteil der Technik.
- Sie wurde erfolgreich zur Untersuchung von Virus-Wechselwirkungen angewandt.
- Die Methode kann auf verschiedene Anwendungen in der Zellbiologie verallgemeinert werden.
Zweck der Studie
- Um virusinduzierte Strukturen in Zellen sichtbar zu machen.
- Um das Verständnis von Bio-Protein-Wechselwirkungen in zellulären Membranen zu vertiefen.
- Um eine praktische Anleitung für Forscher bereitzustellen, die diese Methode anwenden.
Verwendete Methoden
- Herstellung strukturierter Saphirscheiben zur Bildgebung.
- Verwendung der inversen Mikroskopie zur Bestätigung der Struktur.
- Sterilisation der Scheiben mittels UV-Vernetzung.
- Zellkulturmethoden zum Ansäen von Zellen auf Saphirscheiben.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Visualisierung virusinduzierter intrazellulärer Strukturen.
- Nachweis der Wirksamkeit der CLEM bei der Untersuchung von Virus-Wirt-Wechselwirkungen.
- Praktische Schritte zur Implementierung der Methode beschrieben.
- Mögliche Anwendungen in weiter gefassten Kontexten der Zellbiologie.
Schlussfolgerungen
- Die CLEM-Methode liefert wertvolle Erkenntnisse zur Virusbiologie.
- Sie schließt die Lücke zwischen Licht- und Elektronenmikroskopie.
- Weitere Anwendungen in der Zellbiologie werden empfohlen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die korrelative Licht-Elektronenmikroskopie (CLEM) behebt einen kritischen Engpass in der Virologieforschung, indem sie eine gezielte Analyse seltener transfizierter oder infizierter Zellpopulationen ermöglicht. Durch die Kombination fluoreszenzbasierter Live-Cell-Bildgebung mit einer hochauflösenden ultrasruckturellen Konservierung mittels Hochdruckgefrierverfahren verbessert diese Methode die Vorhersagesicherheit bei mechanistischen Studien zu Virus-Wirt-Interaktionen. Sie unterstützt die Validierung von Zielstrukturen und die Entwicklung von Assays in frühen Entwicklungsstadien, indem sie korrelative Daten liefert, die funktionelle Phänotypen mit der subzellulären Architektur verbinden und somit Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch in antiviralen Entdeckungsprozessen fundieren.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen, indem die Expression fluoreszenzmarkierter viralen Proteine mit ultrastrukturellen Veränderungen in kryoimmobilisierten Zellen verknüpft wird.
- Operationaler Wert: Steigert die Effizienz bei der Untersuchung von Transfektions- oder Infektionsereignissen mit geringer Effizienz durch Vorscreening mittels Lichtmikroskopie.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die mechanistische Ent风险bewertung, indem virusinduzierte Membranveränderungen und Montagestellen, die für Replikationskomplexe relevant sind, sichtbar gemacht werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt korrelierte Fluoreszenz- und Elektronendichtesignale, die eine quantitative Beurteilung der Lokalisation viraler Proteine und struktureller Störungen ermöglichen.
- Operativer Wert: Standardisiert die Probenvorbereitung mithilfe strukturierter Saphir-Scheiben und erleichtert so eine reproduzierbare Korrelation zwischen Experimenten und Anwendern.
- Einsatzbereitschaft des Assays: Erzeugt ultrastrukturgetreue Proben, die für nachgeschaltete Bildgebung und morphometrische Analysen in Screenings geeignet sind.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationaler Zusammenhang: Erhält die strukturelle Genauigkeit von Live-Cell-Imaging bis zur Elektronenmikroskopie und unterstützt die phänotypische Bildschirmanalyse, die an Biomarkern ausgerichtet ist, in krankheitsrelevanten Systemen.
- Präklinische Modellierung: Ermöglicht eine detaillierte Charakterisierung virusinduzierter zytopathischer Effekte in nahezu nativen Zuständen und erhöht somit das Vertrauen in translationale Hochübertragungen.
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: Liefert ultrasruckturelle Nachweise, um Wirkmechanismen von antiviralen Kandidaten zu bestätigen oder auszuschließen.
Pipeline- und Workflow-Integration
CLEM ist in die Entdeckungskontinuum von der Hypothesengenerierung in der frühen Virologie bis zur mechanistischen Validierung in der Leitstrukturoptimierung eingebettet, insbesondere wenn strukturelle Korrelate der Proteinfunktion benötigt werden.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung, indem die direkte Visualisierung virusassoziierter Proteinstrukturen in definierten zellulären Teilpopulationen ermöglicht wird.
- Screening: Steigert die Zuverlässigkeit von Assays durch standardisierte Zelllokalisation und Kryokonservierung und verringert so die Variabilität struktureller Messergebnisse.
- Analytik: Liefert korrelierte Datensätze aus Licht- und Elektronenmikroskopie, die einen quantitativen Vergleich von Bedingungen anhand von Fluoreszenzintensität und ultrastrukturellen Merkmalen ermöglichen.
- Translationale Forschung: Verbindet funktionelle Bildgebung mit hochauflösenden strukturellen Daten und unterstützt so die kontinuierliche Übertragung von zellbasierten Assays zur mechanistischen Validierung.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform zur Untersuchung von Virus-Wirt-Interaktionen, die auf mehrere Zielstrukturen und Virusfamilien anwendbar ist.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verringert die mechanistische Unsicherheit, indem direkte korrelative Nachweise zur Lokalisation viraler Proteine und induzierter struktureller Veränderungen bereitgestellt werden.
- Operativer Wert: Verbessert die Reproduzierbarkeit durch standardisierte Nutzung strukturierter Substrate und Gefrieren unter hohem Druck, wodurch Artefakte durch chemische Fixierung minimiert werden.
- Strategischer Wert: Unterstützt fundiertere Go/No-Go-Entscheidungen, indem die Zielbindung auf ultrastruktureller Ebene validiert wird, wodurch das Risiko von Fehlschlägen in späteren Stadien verringert wird.
- Portfolio-Implikation: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von antiviralen Kandidaten basierend auf bestätigten Wirkungen auf virale Replikationskompartimente oder Assemblierungsstellen.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Fluoreszenz-Bildgebung an lebenden Zellen, Hochdruckfixierung, Gefrietausch und Transmissionselektronenmikroskopie.
- Setzt den Zugang zu Hochdruckgefriermaschinen, Ultramikrotomen und korrelierten Licht- und Elektronenmikroskopie-Abbildungsanlagen voraus.
- Erfordert die Standardisierung von Referenzmarkern (z. B. strukturierte Saphirplättchen) und Protokollen zur Koordinatenzuordnung über verschiedene Arbeitsgruppen hinweg.
- Die Anpassung an verschiedene Zelltypen oder virale Systeme kann eine Optimierung der Transfektionseffizienz, der Fluoreszenzmarkierung und der Einfrierparameter notwendig machen.
- Zu den praktischen Einschränkungen gehören die geringe Durchsatzkapazität aufgrund spezialisierter Geräte und die Notwendigkeit einer softwaregestützten Korrelation zur Bildregistrierung, wie in der Quelle angegeben.
Biopharma-Häufige Fragen
Chapters in this video
0:04
Title
0:51
Patterned Sapphire Disc Preparation, Cell Culture, and Imaging
3:16
Cryo-immobilization and Freeze Substitution (FS)
5:24
Resin Embedding and Patterned Sapphire Disc Removal from the Polymerized Resin Block
6:43
Ultrathin Section Preparation and Imaging via Transmission Electron Microscopy (TEM)
8:06
Results: Tracking and Imaging of Viral Protein-associated Structures via Correlative Light Electron Microscopy (CLEM)
8:47
Conclusion
