Ermittelnden Säugetier-Axon Regeneration: In Vivo Elektroporation von Erwachsenen Maus Dorsal Root Ganglion

Elektroporation ist eine effektive Annäherung an Genen Interessen in Zellen zu liefern. Durch die Anwendung dieses Ansatzes in Vivo auf die Neuronen des Erwachsenen Maus Dorsal Root Ganglion (DRG), beschreiben wir ein Modell um Axon Regeneration in Vivozu untersuchen.

Diese Methode bietet eine in-vivo-Gentransfektionstechnik zur Manipulation der Genexpression in adulten sensorischen Neuronen von Mäusen für zukünftige Studien zur Exoregeneration von Säugetieren. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie weniger Arbeits- und Zeitaufwand erfordert und die Zielgene gleichzeitig und getrennt sowohl überexprimieren als auch ausschalten kann. Um diesen Vorgang zu starten, markieren Sie beide Seiten des Beckenkamms einer anästhesierten Maus mit einem feinen Marker.

Zeichnen Sie eine Linie, die zwei Punkte des Beckenkamms verbindet, um die Identifizierung der Positionen der L5-DRGs zu erleichtern. Machen Sie dann mit einer Mikroschere einen drei Zentimeter langen Schnitt entlang der Mittellinie des unteren Rückens. Anschließend lösen Sie die paraspinösen Muskeln, wie den Musculus multifidus und den Musculus longissimus lumborum, von den Dornfortsätzen L3 bis S1 und legen das Fasziengelenk der L4-5 und L5-6 frei.

Als nächstes entfernen Sie mit einem Mikrorongeur die Fasziengelenke des L4-5 und L5-6. Entfernen Sie anschließend den linken Neuralbogen von L4 und L5, um die dorsale Seite der DRGs freizulegen. Für die DRG-Injektion laden Sie die DNA-Plasmide oder RNA-Oligos in die Glaskapillarpipette.

Führen Sie dann die Spitze der Kapillarglaspipette vorsichtig in das DRG ein und injizieren Sie nach und nach eine Mikroliterlösung von DNA-Plasmiden oder RNA-Oligos mit dem intrazellulären Mikroinjektions-Dispense-System. Für die Elektroporation kneifen Sie das Ziel-DRG vorsichtig mit den Elektroden zusammen und legen Sie fünf quadratische elektrische Impulse mit dem Elektroporationssystem an. Anschließend verschließen Sie den Muskel und dann die Hautschichten mit Nylonnähten.

Zwei oder drei Tage nach der DRG-Elektroporation betäuben Sie die Maus intraperitoneal, kleben Sie ihre Gliedmaßen auf die Korkplatte und machen Sie einen einen Zentimeter langen Schnitt 0,5 Zentimeter nach links entlang der Mittellinie. Schneiden Sie anschließend die Muskeln, wie z. B. den Musculus gluteus maximus und den Musculus piriformis, in Längsrichtung ab. Legen Sie dann das Segment des Ischiasnervs zwischen dem Foramen Ischias major und der Ischiaskerbe frei.

Quetschen Sie den Nerv 12 Sekunden lang mit einer mikrochirurgischen Pinzette und markieren Sie die Quetschstelle mit einer epineuralen Nylonnaht. Anschließend verschließen Sie die Muskel- und Hautschichten mit Nylonnaht. Trennen Sie die DRGs zusammen mit den Nervenwurzeln und dem Ischiasnerv vorsichtig mit einer Mikroschere und einer Mikrozange unter dem Dissektionsmikroskop

Übertragen Sie dann den Ischiasnerv direkt in 4%PFA über Nacht bei vier Grad Celsius. Um die fluoreszenzmarkierten sensorischen Axone unter dem Dissektionsmikroskop abzubilden und zu messen, entfernen Sie das anhaftende Gewebe und die Membran am fixierten Ischiasnerv vorsichtig mit einer Mikroschere und einer Mikrozange. Waschen Sie dann den Nerv dreimal mit PVS.

Legen Sie als nächstes den Ischiasnerv auf eine Folie und halten Sie sie gerade. Geben Sie 80 Mikroliter Anti-Fading-Lösung um den Nerv herum und legen Sie dann ein Deckglas darauf. Glätten Sie das gesamte montierte Gewebe mit Druck.

Legen Sie anschließend das abgeflachte Gewebe unter das inverse Epifluoreszenzmikroskop, das mit einem Zubehör für die Mosaikaufnahme und Bildverarbeitung ausgestattet ist. Bei der Messung der Länge der regenerierten Axone sind alle identifizierbaren fluoreszenzmarkierten Axone im Ischiasnerv von der Quetschstelle bis zu den distalen Axonenden zu verfolgen. Bei der Anwendung der aktuellen In-vivo-Elektroporationsmethode zur Untersuchung der axonalen Regeneration wurde der Ischiasnerv abgeflacht und abgebildet.

Jedes regenerierte Axon mit einer ausgeprägten Trajektorie und einem erkennbaren distalen Axonende kann von der durch den Nahtknoten angezeigten Quetschstelle verfolgt werden. Die weiße Pfeilspitze, der Pfeil und der Stern zeigen drei markante Axonenden, die sich alle von der Quetschstelle aus erstrecken. Zusätzlich wurden die DRGs mit EGFP-Plasmiden elektroporiert und das Rückenmark entnommen.

Die EGFP-markierten Axone der dorsalen Säule im Rückenmark wurden sowohl in den longitudinalen als auch in den sagittalen Projektionsbildern abgebildet und identifiziert. Hier ist eine Detailansicht der Axone in der dorsalen Säule, und hier ist eine Detailansicht der Axone in der dorsalen Wurzeleintrittszone. Dieses Bild zeigt die sagittale Projektion der EGFP-markierten Axone innerhalb der dorsalen Säule.

Alternativ können die konfokalen Bilder mit einer Mikroskopie-Visualisierungssoftware bearbeitet werden, um ein 3D-Bild zu rekonstruieren. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, die L4 und L5 DRGs richtig zu positionieren und einen Knoten auf der Duralmembran zu machen, ohne den Ischiasnerv aufzuspießen, während die Quetschstelle mit einem Nahtknoten markiert wird. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Axonregeneration, um Gene zu erforschen, die für PNS, die natürliche Axonregeneration, erforderlich sind, oder Gene, die die Regeneration bei erwachsenen Mäusen in vivo weiter fördern können.