Name: Gentranskription durch Umleiten zellulären Maschinerie mit chemischen epigenetische Modifikatoren zu unterdrücken (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie die Gentranskription durch Umleitung zellulärer Maschinerie mit chemischen epigenetischen Modifikatoren unterdrücken. Diese Methode ermöglicht eine genomspezifische und reversible Kontrolle der Genexpression in Maus-ES-Zellen.

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Die Autoren möchten die Hathaway und Jin Labors für ihre hilfreiche Gespräche danken. Die Autoren danken auch Dan Crona und Ian MacDonald für ihre kritischen Lektüre des Manuskripts. Diese Arbeit wurde zum Teil unterstützt von Grant R01GM118653 von der US National Institutes of Health (zu N.A.H.); und durch Zuschüsse R01GM122749, R01CA218600 und R01HD088626 aus der US-National Institute of Health (, j.j.). Diese Arbeit wurde auch unterstützt durch eine Stufe 3 und ein Student aus dem UNC-Eshelman Institut für Innovation zu gewähren (N.A.H und A.M.C, beziehungsweise). Zusätzliche Mittel aus einem T-32-GM007092 (für A.M.C) unterstützt diese Arbeit. Flow Cytometry Daten wurde auf die UNC-Flow Cytometry Core Facility finanziert durch einen P30 CA016086 Cancer Center Core Support Zuschuss an die UNC Lineberger Comprehensive Cancer Center erhalten.

(1) Linie Zellkultur zur Herstellung von Lentivirus
<ol><li>Wachsen frische, niedrig-Passage (weniger als 30 Durchgang) 293T menschlichen embryonalen (HEK) Nierenzellen in hoch-Glukose Dulbecco modifizierten Eagle ist Medium (DMEM) base Medien ergänzt mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS), 10 mM HEPES, 1 x nicht-essentiellen Aminosäuren (NEAA), Stift / STREP, 2-Mercaptoenthanol in einem Inkubator 37 ° C mit 5 % CO2. Teilen Sie die Zellen jedes 3-5 d und zuvor werden sie > 95 % Zusammenfluss.</li>
	<li>Durchgang 293T HEK Zellen mit 18 x 106 / 15 cm Platte (ein 15-cm-Platte für jeden Virus produziert).<ol>
<li>Aspirieren Sie für ein 15-cm-Format die alten Medien, fügen Sie 10 mL 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS), Aspirieren der PBS, und 3 mL 0,05 % Trypsin. Inkubieren Sie die Zellen in Trypsin für 8 min bei 37 ° C, Schaukeln und tippen auf halbem Weg durch die Inkubation der Zellen. Hinweis: Das Ziel dieses Schrittes ist es, die Zellen in eine einzelne Zelle Suspension zu erhalten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wenn die Zellen 60-80 % Konfluenz am Folgetag erreicht haben, führen Sie eine Polyethylenimine (PEI) Transfektion mit 13,5 µg psPAX2 Plasmid, 4,5 µg des Plasmids pMD2.G, 18 µg Lentivirale kompatibel Lieferung Vektors mit dem gen des Interesses (d.h. , FKBP-Gal4), 108 µL des PEI und 1,8 mL Transfektion Medien.<ol>
<li>Vorsichtig mischen Sie die DNA, PEI und Transfektion Medien in einem 15 mL konische Röhrchen, inkubieren Sie die Probe bei Raumtemperatur für 15 min und die 15-cm-Platte tropfenweise hinzufügen. Hinweis: Bitte verwenden Sie geeignete Sicherheit misst und folgen alle institutionellen und Laborverfahren Sicherheit nach diesem Schritt als alle Reagenzien werden einen live-Virus enthalten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aspirieren Sie nach 16 h der Transfektion und Inkubation in einem Inkubator 37 ° C mit 5 % CO2die Medien und die 15-cm-Platten fügen Sie vorsichtig frische 293 HEK Medien (im Wasserbad 37 ° C vorgewärmt hinzu). Inkubieren Sie die Zellen in einem Inkubator 37 ° C mit 5 % CO2 für 48 h nach der Medienwechsel. Das Virus ist dann reif für die Ernte.</li>
</ol>(2) Infektion von Embryonalstammzellen der Maus (mESC) mit Lentivirus
<ol><li>Niedrig-Passage (weniger als 35 Durchgang) wachsen, Feeder-freie angepasst CiA mESCs in hoch-Glukose DMEM base Medien ergänzt mit 20 % ESC-Grade FBS, 10 mM HEPES, 1 X NEAA, Pen/Strep, 2 Mercaptoenthanol und 1: 500-Leukämie-Inhibitor Faktor (LIF) in einem Inkubator 37 ° C mit 5 % CO2. Hinweis: LIF wird aus der Überstand der COS-LIF-produzierenden Zellen gewonnen, die im Stapel gesammelt und bei-80 ° c eingefroren<ol>
<li>Wachsen Sie Zellen auf Tellern, die preincubated für 1-3 h mit 0,1 % Gelatine in 1 X PBS, und anschließend mit 1 X PBS gewaschen wurden. Füttern Sie die Zellen täglich und teilen Sie sie alle 2-3-d, je nach ihrer Dichte. Hinweis: Morphologisch, embryonale Stammzellen (ES) Kolonien klein, rund, und voneinander sollte.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Die Passage mESC in ein 12-Well-Plattenformat (100.000 Zellen/na) 1D vor der Infektion.<ol>
<li>Zählen Sie die Zellen mit einem Hemocytometer. Aspirieren Sie für Zellen in einem 10-cm-Format gewachsen die alten Medien, fügen Sie 5 mL 1 X PBS Aspirieren der PBS und fügen Sie 1 mL Trypsin 0,25 %. Inkubieren Sie die Zellen in Trypsin für 8 min bei 37 ° C, Schaukeln und tippen auf halbem Weg durch die Inkubation der Zellen. Das Ziel dieses Schrittes ist es, die Zellen in eine einzelne Zelle Suspension bekommen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>48 h nach dem Wechsel der Medien von der 293T15-cm-virale Zellen aus Schritt 1.4, Verpackung entfernen und den überstand auf eine 50 mL konische Rohr übertragen.</li>
	<li>Zentrifugieren des Überstands bei 300 X g für 5 min zu zellenrückstand Pellets.</li>
	<li>Filtern des Überstands durch einen 0,45-µm-Membran. Hinweis: Stellen Sie sicher, tensidfreien Cellulose-Acetat (SFCA) Membranen zu verwenden, wie einige andere Materialien Virus behalten und Erträge deutlich reduzieren können.</li>
	<li>Konzentrieren Sie, das Virus mit Ultrazentrifugation, mit Hilfe einer Zentrifuge mit SW32 Rotor, und drehen Sie es mit 20.000 u/min (~ 72.000 X g) 2,5 h bei 4 ° C.</li>
	<li>Während sich das Virus unter Ultrazentrifugation konzentriert, behandeln Sie der CiA-mESCs in der 12-Well-Platte mit frischen ES Medium mit 5 µg/mL Polybrene.</li>
	<li>Nach Abschluss der Viruskonzentration sorgfältig Aspirieren den überstand und hängen Sie das Virus Pellet in 100 µL 1 X PBS (Vermeidung von überschüssigen Luftblasen).</li>
	<li>Fügen Sie das Virus und 1 X PBS zu einem Schlauch 1,5 mL Microfuge. Vortex/Schütteln der Röhre bei 300 x g (oder bei der niedrigsten Einstellung), das Virus vollständig auszusetzen. Spin-down das Rohr in einer Mini-Tischplatte Zentrifuge für 5-10 s um Luftblasen zu entfernen.</li>
	<li>Geben Sie 30 µL des Virus in jedem ein 12-Well-Platte. Schwenken Sie die Platte und dann Zentrifugieren Sie die Platte bei 1.000 X g für 20 min. Hinweis: Der Virusmenge hinzugefügt kann abhängig von der viralen Titer variiert werden die umgekehrt mit Lieferung Konstrukt Größe zusammenhängt.<ol>
<li>Alternativ Flash das Virus mit flüssigem Stickstoff eingefroren und bei-80 ° c Lagern Allerdings senkt das Einfrieren der Virus viral Titer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Die 12-Well Platte wieder in den Inkubator 37 ° C und wechseln Sie das Medium am nächsten Morgen (~ 16 h) später mit frischen ES Medien (wie in Schritt 2.1 beschrieben).</li>
	<li>Wählen Sie nach 48 h der Infektion für Zellen, die das virale Plasmid integriert durch Zugabe von geeigneten Antibiotikums (z.B. 1,5 µg/mL von Puromycin, 10 µg/mL Blasticidin, etc.). Ändern Sie die Medien täglich und waschen Sie die Zellen mit 1 X PBS, wenn die Mehrheit der Zellen schwimmenden/Tote. Halten Sie die Auswahl-Medien auf die Zellen für 72-96 h in einem Inkubator 37 ° C mit 5 % CO2.</li>
</ol>(3) chemische epigenetische Modifikatoren (CEM) s Vorbereitung und Behandlung
<ol><li>Suspendieren Sie die pulverisierte CEM in Dimethyl Sulfoxid (DMSO), ein Lager Konzentration von 1 mM und eine arbeiten-Konzentration von 100 µM.</li>
	<li>Nachdem die Zellen die Auswahl für 72-96 h unterzogen wurden, die mESCs in einem 12-Well-Format mit 100.000 Zellen/gut aufgeteilt. Inkubieren Sie die Zellen in einem Inkubator 37 ° C mit 5 % CO2 für 24 h danach, bereiten eine Media-Lösung von 100 nM CEM mit ES-Media. Verwenden Sie dieses Medium, um feed der CiA mESC mit 1 mL/gut. Um als Kontrolle dienen, halten Sie eine gut von den Zellen ohne irgendwelche zusätzlichen CEMs.<ol>
<li>Wechseln Sie das Medium durch Absaugen von alten Medien und Hinzufügen von 1 mL/auch der frisch zubereiteten CEM-haltige oder CEM-frei ES Medien alle 24 h für die Dauer eines Experiments.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(4) Analyse des Ausdrucks von Mikroskopie und Durchflusszytometrie
<ol><li>Nach 48 Stunden CEM Behandlung, Bild, die ohne CEM Behandlung und die Zellen behandelt mit 100 nM CEM mit einem Fluoreszenzmikroskop. Nehmen Sie repräsentative Bilder mit Phase oder Hellfeld mESC Morphologie bei 20 X Vergrößerung aufzunehmen; die Zellen sollten Runde Kolonien, mit ein paar differenzierte Zellen gebildet haben. Unter dem FITC-Fluoreszenz-Kanal Bild beide Zelle Bedingungen.</li>
	<li>Isolieren Sie die Kontrolle und CEM-behandelten Zellen für Durchflusszytometrie durch Absaugen der Medien, die Zellen mit 1 mL 1 X PBS waschen, Absaugen der PBS und Hinzufügen von 0,25 mL von 0,25 % Trypsin mit EDTA für 8-10 min.</li>
	<li>Bestätigen Sie, dass die Zellen nicht mehr in großen Klumpen mit einem Blick in das Mikroskop. Verwenden Sie ein 20 X Vergrößerung. Wenn die Zellen nicht in einer einzelnen Zelle Suspension zu sein scheinen, pipette sanft nach oben und unten mit einer Pipette P1000, voll die Zellen trypsinize.</li>
	<li>Die Trypsin mit 1 mL frische Medien zu stillen und Aufschwemmen der Zellen mit hoher Geschwindigkeit mit einer serologischen Pipette (oder unter Verwendung eines P1000 Pipette und Spitze) bis die Zellen in einer einzelnen Zelle Suspension sind.</li>
	<li>Spin-down der Zellen bei 300 X g für 5 min. Aspirat überstand. Mit 1 X PBS waschen und wiederausschleudern der Zellen. Aspirieren des PBS Überstands.</li>
	<li>Aufschwemmen der Zelle Pellet in 200 mL FACS-Puffer (1 mM Ethylenediaminetetraacetic Säure [EDTA], 1 X PBS und 0,2 % Rinderserumalbumin [BSA]).<ol>
<li>Das Gesamtvolumen der FACS-Puffer werden abhängig, wie viele Zellen vorhanden sind, sollte aber die Konzentration 1.000-3.000 Zellen / µL. die Anzahl der Zellen in 3 Proben und die Konzentration der Zellen im Durchschnitt. Fügen Sie weitere FACS-Puffer, wenn nötig.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Führen Sie Durchflusszytometrie > 50.000 Zellen mit den suspendierten Zellen, die Zellen auf dem Eis zu halten, wenn sie nicht analysiert werden. Verwenden Sie einen 530/40 Filter (FITC, AF488, GFP, etc.) für die Aufzeichnung der Änderungen im Ausdruck. Bestimmen Sie die entsprechende fluoreszierende Spannung mit einer unbehandelten Kontrolle Zellprobe und stellen Sie die Spannung zu fluoreszierenden Spitze in der Mitte des Spektrums aufgenommenen Intensität sein. Laufen Sie die Proben mit einer Hülle-Geschwindigkeit von rund 5.000 Zellen/s.</li>
	<li>Exportieren Sie die Daten und analysieren Sie die FCS-Dateien auf einem Flow Cytometry Programm (d.h., FlowJo) durch Anspritzung zuerst auf forward Scatter vs. Side Scatter für lebende Zellen und dann auf forward Scatter Höhe vs. Bereich für Unterhemden. Dann visualisieren GFP-Channel-Daten auf ein Histogramm den relativen GFP-Ausdruck in die gezielte ermitteln und kontrollieren Populationen.</li>
</ol>(5) Analyse von Chromatin von Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) gefolgt von qPCR
<ol><li>Die mESCs in einer 10-cm-Platte mit 3 Millionen Zellen und 10 mL ES-Media aufgeteilt (eine 10-cm-Platte für jede experimentelle oder Kontrolle Zustand). Fügen Sie am folgenden Tag, 10 mL der CEM-haltige oder CEM-freie Medien. Aspirieren Sie nach 48 Stunden CEM Behandlung die alten Medien. Waschen Sie und Aspirieren Sie die Zellen mit 5 mL 1 X PBS. Als nächstes die Zellen mit 0,25 % Trypsin distanzieren, und Trypsin mit 10 mL ES-Media zu stillen. Zählen und eine Probe von 10 Millionen Zellen pro Zustand zu isolieren.</li>
	<li>Spin-down jeweils 10 Millionen Zellproben 300 X g für 5 Minuten.</li>
	<li>Jedes Pellet in 10 mL 1 X PBS aufschwemmen und die Zellen bei 300 X g für 5 min wiederausschleudern.</li>
	<li>Aufschwemmen jedes Pellet in 10 mL CiA Fix Puffer (50 mM pH 8, 1 mM EDTA pH 8, 0,5 mM Ethylenglykol-BIZ [ß-Aminoethyl Äther]-N, N, N', N'-Tetraacetic Säure [EGTA] pH 8 und 100 mM Natriumchlorid [NaCl]). Fügen Sie 1 mL 11 % Formaldehyd-Lösung und sofort umkehren Sie die Proben 5 x - 10 X. Inkubieren Sie die Probe bei Raumtemperatur für 10 min.</li>
	<li>0,5 mL 2,5 M Glycin hinzugeben. Umkehren Sie die Proben sofort und inkubieren Sie die Probe für 5 min auf Eis.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Probe bei 1.200 X g für 5 min bei 4 ° C. Den überstand abgesaugt.</li>
	<li>Das Pellet in 10 mL CiA spülen 1 Aufschwemmen (50 mM HEPES pH 8, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA pH 8, 10 % Glycerin, 0,5 % Nonidet p-40 [NP40] und 0,25 % Triton X100). Inkubation der Probe auf dem Eis für 10 min zentrifugieren es 1.200 x g für 5 min bei 4 ° c</li>
	<li>Das Pellet in 10 mL CiA spülen 2 (10 mM Tris [macht] Aminomethane [Tris] pH 8, 1 mM EDTA pH 8, 0,5 mM EGTA pH 8 und 200 mM NaCl) aufzuwirbeln. Zentrifugieren Sie die Probe bei 1.200 X g für 5 min bei 4 ° C.</li>
	<li>Hinzugeben Sie 5 mL CiA Scheren Puffer (0,1 % SDS, 1 mM EDTA und 10 mM Tris, pH 8) entlang der Seiten des konischen Rohres Salz abwaschen ohne Unterbrechung das Pellet vorsichtig. Zentrifugieren Sie die Probe bei 1.200 X g für 3 min bei 4 ° C. Wiederholen Sie die Waschschritt.</li>
	<li>Aufschwemmen Sie das Pellet in 90 µL der CiA Scheren Puffer und frischen Protease-Inhibitoren (verwenden Sie eine Mischung aus Leupeptin, Chymostatin und Pepstatin A zusammen bei 10 mg/mL jeweils in DMSO zu 1.000 x-Stammlösung, wodurch eine Endkonzentration von 10 µg/mL aufgelöst). Fügen Sie 10 µL Beschallung steigernde Nanodroplets und dabei alles auf Eis13,14.</li>
	<li>100 µL der Lösung in ein Glasrohr und Röhrchen Sie die.</li>
	<li>Die Proben für 3,5 min beschallen (ermittelt anhand der Zell-Linie und die Anzahl der Zellen). Um eine Überhitzung der Proben, Proben zu verarbeiten 2-min-maximale Taktzeiten übersteigt die gesamte beschallungsdauer 2 min. Hinweis: Die fokussierte Ultrasonicator hier verwendete Funktionen mit hoher Frequenz (500 kHz). Laufen Sie die Maschine, bei einer akustischen Leistung von 55 w. Die Dauer der Beschallung sollte von jedem einzelnen Lab vorgegeben werden.</li>
	<li>Übertragen Sie jede Probe beschallten Chromatin zu einem neuen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch. Drehen Sie die Rohre bei 8.000 X g für 2 min bei 4 ° C.</li>
	<li>Die Schur Effizienz analysieren und die relative Menge des Chromatins zu quantifizieren, folgen Sie Kit Chiphersteller Protokoll. Hinweis: Die DNA-Konzentration spektralphotometrisch bestimmen (z. B.mit einem DNA-Nanodrop Instrument), und laufen ~ 200 ng DNA auf einem 1 % Agarose-Gel um sicherzustellen, dass das Chromatin, etwa 200-500 Basenpaaren (bp) in der Größe beschallt wird.</li>
	<li>Immunopräzipitation durchführen und das Chromatin zu isolieren, Kit Chiphersteller Protokoll folgen. Hinweis: Für die Immunopräzipitation Proben mit höheren DNA-Konzentrationen den Elution Puffer bei 37 ° C warm und eluieren Proben 2 X mit 30 µL Elution Buffer (Spinnerei für 1 min jedes Mal).</li>
	<li>Um qPCR durchzuführen, laden Sie die Reagenzien in einem 384-Well-Platte. Fügen Sie 5 µL 2 x asymmetrische Cyanin-Farbstoff-master-Mix, 2,5 µM jedes Primer, Wasser und 0,1 - 10 ng DNA für jede Reaktion.<ol>
<li>Design Primer um 50-100 bp Amplifikate und CT-Werte verstärken werden zu einem Haus-halten-gen, Intracisternal Typ A Partikel (IAP) normalisiert. Hinweis: Weitere qPCR Methoden finden Sie in der Kit-Hersteller Protokoll. Die Grundierung verwendet, um die Oct4 Lokus war: (F) CACATGAAGCAGCACGACTT; (R) CCTTGAAGAAGATGGTGCGC. Die Kontrolle Grundierung set Ziel IAP gewöhnt war: (F) ATTTCGCCTAGGACGTGTCA; (R) ACTCCATGTGCTCTGCCTTC.</li>
		<li>Basierend auf den Primer und das gewünschte Produkt, die qPCR mit 40 Zyklen einer annealing Temperatur von 60 ° C für 1 min laufen. Hinweis: Die resultierenden Daten war quantitated mit der Delta-Delta Ct Vergleiche zwischen Proben, mit CiA:Oct4 über IAP normalisiert. Die endgültige Analyse-Ergebnisse werden als Durchschnittswerte von dreifacher experimentellen Proben mit dem Fehler als die Standardabweichung vom Mittelwert dargestellt angezeigt.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Hier beschrieben wir die neu entwickelte CEM-System zur Regulierung der Genexpression und Chromatin-Umgebung auf ein bestimmtes Gen in einer Dosis-abhängigen Weise angewendet wird. Wir bieten eine genaue Methode zur Untersuchung der Dynamik bei der Regulierung der Genexpression durch die gezielte Rekrutierung von bestimmten endogenen Chromatin regulatorische Proteine beteiligt. Dies ist eine sehr modulare Technologie, die angewendet werden können um zu untersuchen, wie verschiedene Protein - und Chromatin-modifizierende ...

Chromatin besteht aus DNA umwickelt Octamer histonproteine, die das Kern-Nukleosom-Teilchen bilden. Regulierung von Chromatin Verdichtung ist ein wesentlicher Mechanismus für korrekte DNA-Reparatur, Replikation und Ausdruck1,2,3. Ein Weg in die Zellen der Verdichtung zu kontrollieren ist durch das Hinzufügen oder Entfernen von verschiedenen Post-translationalen Histon-Tail-Modifikationen. Zwei solche Modifikationen umfassen (1) Lysin Acetylierung, die am häufigsten im Zusammenhang mit Genaktivierung ist, und (2) Lysin-Methylierung, die Genaktivierung oder Unterdrückung, je nach Aminosäure Kontext zugeordnet werden können. Die Zugabe der Acetylierung und Methylierung Marken ist von Histon-Acetyltransferases (Hüte) und Histon-Methyltransferasen (HMTs), bzw. katalysiert, während die Entfernung der Marke durch Histon Deacetylases (HDACs) und Histon-Demethylases (HDMs erfolgt ), bzw.4,5. Obwohl die Existenz dieser Proteine ist seit Jahrzehnten bekannt, viele Mechanismen wie Chromatin-modifizierende Maschinen arbeitet, um richtig Genexpression regulieren noch festgelegt werden. Da Chromatin Regulationsprozesse Dysregulated bei vielen menschlichen Krankheiten sind, könnten zukünftige therapeutische Anwendungen neue mechanistische Einblicke.
Der Chromatin in Vivo Assay (CiA) ist eine kürzlich beschriebenen Technik, die eine chemische Induktor von Nähe (CIP) verwendet, um Chromatin-modifizierende Maschinen Rekrutierung Steuern zu einem bestimmten Locus-6. Diese Technologie wurde genutzt, um eine wachsende Liste von Chromatin Dynamik, einschließlich Histon-modifizierende Proteine, Chromatin Remodelers und Transkription Faktoren6,7,8,9zu studieren. CIP-basierte Chromatin Anbindehaltung von exogen exprimierten Proteine wurde auch vorbei an CiA nicht veränderten genetischen Loci zu modulieren mittels mit einem deaktivierten gruppierten regelmäßig dazwischen kurze palindromische wiederholt CRISPR-assoziierten Protein (dCas9) erweitert 10 , 11. im CiA-System mESCs wurden geändert, um eine GLP-Reporter-gen bei Oct4 Locus, ein höchst ausgedrückt und streng reglementierten Bereich des Genoms mESC zum Ausdruck bringen. Zuvor wurde dieses System um die dosisabhängig und reversible Rekrutierung von exogen ausgedrückt Heterochromatin Protein 1 (HP1), ein Enzym zu beschreiben, die bindet H3K9me3 und breitet sich repressive Markierungen (z.B.H3K9me3) angewandt und DNA Methylierung6. Um diese Art von Recruiting-Strategie zu erreichen, sind die mESCs mit einem Plasmid infiziert, die drückt eine FK506-bindendes Protein (FKBP) verbunden mit einem Gal4, die eine DNA-Protein-Anker, der an eine Gal4-Bindung Array stromaufwärts von der GFP-Reporter bindet. Die Zellen sind auch mit einem FKBP-Rapamycin-bindende Domäne (FRB) verbunden mit HP1 infiziert. Wenn die mESCs gering nanomolaren Konzentrationen des CIP ausgesetzt sind, Rapamycin, FRB und FKBP, zusammengeführt in den Target Locus. Innerhalb von Tagen von Rapamycin Behandlung Ausdruck des Zielgens wird unterdrückt, wie Fluoreszenz-Mikroskopie und Flow-zytometrie belegt und Histon Acetylierung sinkt, von ChIP und Bisulfit Sequenzierung gezeigt. Während die Entwicklung und Validierung dieses Ansatzes bedeutende Fortschritte auf dem Gebiet der Chromatin Forschung und Regulierung wurden, ein Nachteil ist die erforderliche exogene Ausdruck der Chromatin-modifizierende Maschinen.
Um die Technologie basiert auf Einstellung von nur endogene physiologisch relevanten Enzyme und machen einem modulares System, wir konzipiert und zeichnet sich neuartige bifunktionelle Moleküle, CEMs (Abbildung 1)12bezeichnet. Ein Bestandteil der CEMs umfasst FK506, die ähnlich wie Rapamycin, dicht und speziell bindet, FKBP. So werden der CEMs noch Oct4 Locus in der CiA-mESCs eingestellt werden. Die andere Komponente der CEMs ist eine Verbindungsgruppe, die endogenen Chromatin-modifizierende Maschinen bindet. In einer Pilotstudie getestet wir CEMs, die HDAC-Inhibitoren enthalten. Während das Konzept des Verwendens eines Inhibitors HDACs rekrutieren unlogisch erscheint, kann die Inhibitor dennoch HDAC-Aktivität, das Gen des Interesses zu rekrutieren. Dies geschieht durch (1) die HDAC umleiten auf Locus, Freigabe des Enzyms und Erhöhung der Dichte des UN-gehemmte HDACs in der Region und (2) die Aufrechterhaltung HDAC-Hemmung auf dem Lokus, aber Rekrutierung repressiven komplexe, die an die gehemmte HDACs binden, oder (3) eine Kombination aus beidem. In einer früheren Studie zeigten wir, dass die CEMs erfolgreich unterdrücken die GFP-Reporter in einer Zeit-dosisabhängige Weise, sowie in einer Weise konnten, schnell reversibel war (d. h.innerhalb von 24 Stunden)12. Wir zeichnen die Fähigkeit der CEM-Technologie präsentiert hier Kontrolle Genexpression mit Fluoreszenz-Mikroskopie, Durchflusszytometrie und die Fähigkeit, um mittels ChIP-qPCR6Chromatin-Umgebung zu kontrollieren. Hier beschreiben wir eine Methode für die Verwendung und Charakterisierung der CEMs, die die Anpassung des Systems für zusätzliche Fragen im Zusammenhang mit Chromatin Biologie erleichtern wird.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-013CV</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (für Gewebekultur)</td><td>Corning</td><td>25-060-Cl</td><td></td></tr><tr><td>BME (2-Mercaptoethanol)</td><td>Gibco</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlantic Biologicals</td><td>S11550</td><td>Einzelne Chargen auf Qualität</td></tr><tr><td>geprüft Covaris Röhrchen</td><td>ThermoScientific</td><td>C4008-632R</td><td></td></tr><tr><td>Covaris Verschlüsse</td><td>ThermoScientific</td><td>C4008-2A</td><td></td></tr><tr><td>PEI (Polyethylenimin)</td><td>Polysciences</td><td>23966-1</td><td></td></tr><tr><td>Transfektionsmedien (Opti-mem)</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>Virus Zentrifugenröhrchen</td><td>Beckman Coulter</td><td>344058</td><td></td></tr><tr><td>Virus Filtermembran</td><td>Corning</td><td>431220</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC134220</td><td></td></tr><tr><td>0,25 % Trypsin</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>mit EDTA</td></tr><tr><td>0,05 % Trypsin</td><td>Gibco</td><td>25400-054</td><td>mit EDTA</td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pr</td><td></td></tr><tr><td>Blasticidin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-bl</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green Master Mix (asymmetrischer Cyaninfarbstoff)</td><td>Roche</td><td>4913914001</td><td></td></tr><tr><td>H3K27ac Antikörper</td><td>Abcam</td><td>ab4729</td><td></td></tr> <tr><td>(ChIP-Kit) ChIP-IT High Sensitivity Kit</td><td>Active Motif</td><td>53040</td><td></td></tr><tr><td>Ultraschallgerät</td><td>Covaris</td><td>E110</td><td></td></tr><tr><td>Ultrazentrifuge</td><td>Optima</td><td>XPN-80</td><td></td></tr><tr><td>SW-32 Zentrifugenrotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>14U4354</td><td></td></tr><tr><td>SW-32 Ti Zentrifugenschaufeln</td><td>Beckman Coulter</td><td>130.2</td><td></td></tr><tr><td>LentiX 293 Menschliche embryonale Niere</td><td>Clontech</td><td>632180</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>46-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Fisher</td><td>BP9700</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher</td><td>S311-100</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S271-1</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher</td><td>G33-1</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Fisher</td><td>BP152</td><td></td></tr><tr><td>NP40</td><td>Roche</td><td>11754599001</td><td></td></tr><tr><td>Triton</td><td>MP Biomedicals</td><td>807426</td><td></td></tr><tr><td>Glycin</td><td>Fisher</td><td>BP381-500</td><td></td></tr><tr><td>TE Puffer</td><td>Fisher</td><td>BP2474-1</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (für ChIP)</td><td>Fisher</td><td>BP310-100</td><td></td></tr><tr><td>Gelatine</td><td>Sigma</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>Durchflusszytometer, Attune NxT</td><td>Thermo Fisher</td><td>A24858</td><td></td></tr><tr><td>FKBP-Gal4 Plasmid</td><td>Addgene</td><td>44245</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2 Plasmid</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G Plasmid</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>Nanotröpfchen</td><td>MegaShear</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>DNA Nanodrop</td><td>Thermo Fisher</td><td>ND1000</td><td></td></tr><tr><td>Proteasehemmer (Leupeptin)</td><td>Calbiochem/EMD</td><td>108975</td><td></td></tr><tr><td>Proteasehemmer (Chymostatin)</td><td>Calbiochem/EMD</td><td>230790</td><td></td></tr><tr><td>Proteasehemmer (Pepstatin)</td><td>Calbiochem/EMD</td><td>516481</td><td></td></tr><tr><td>CiA:Oct4 mESC</td><td>Das freundliche Geschenk von G. Crabtree</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lif-1C-alpha - Produktion von Cos-Zellen</td><td>Das freundliche Geschenk von J. Wysocka</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

gentranskription durch umleiten zellulären maschinerie mit chemischen epigenetische modifikatoren zu unterdrücken

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

Regulierung von Chromatin Verdichtung ist ein wichtiger Prozess, der Gen-Expression in den höheren Eukaryotes regelt. Obwohl Chromatin Verdichtung und Genregulation Ausdruck allgemein bei vielen Krankheiten gestört werden, hat eine Locus-spezifische, endogene und reversible Methode zu studieren und steuern diese Wirkmechanismen gefehlt. Um dieses Problem zu beheben, haben wir entwickelt und neue gen-regulierende bifunktionelle Moleküle gekennzeichnet. Ein Bestandteil der bifunktionelle Molekül bindet an ein DNA-Protein-Anker, so dass es zu einem Allel-Spezifische Locus eingestellt werden. Die andere Komponente greift körpereigene zelluläre Chromatin-modifizierende Maschinen, Rekrutierung dieser Proteine zu einem gen des Interesses. Diese kleinen Moleküle, genannt chemischen epigenetische Modifikatoren (CEMs), sind in der Lage, Genexpression und die Chromatin-Umwelt in einer Dosis-abhängigen und reversible Weise zu kontrollieren. Hier zeigen wir ein CEM-Konzept und seine Anwendung auf die Genexpression und Histon Schweif Acetylierung auf ein grün fluoreszierendes Protein (GFP) Reporter am Oct4 Locus in embryonalen Stammzellen der Maus (mESCs) zu verringern. Wir charakterisieren die Führung CEM (CEM23) mit Fluoreszenz-Mikroskopie, Durchflusszytometrie und Chromatin Immunopräzipitation (ChIP), gefolgt von einer quantitativen Polymerasekettenreaktion (qPCR). Während die Kraft dieses Systems auf die Oct4 Locus, konzeptionell nachgewiesen wird, die CEM-Technologie ist modular aufgebaut und kann in andere Zelltypen und an anderen genomic Loci angewendet werden.

Wir vor kurzem CEMs entwickelt und gezeigt, dass diese Technologie zur Regulierung der Genexpression und Chromatin Umwelt an einen Ort der Reporter in einer Dosis-abhängigen und reversible Weise angewendet werden kann. In Abbildung 1ist ein Modell des potenziellen Kunden CEM, CEM23, dargestellt. HDAC-Maschinen ist, die Reporter-Locus von HDAC-Inhibitor rekrutiert, die in diesem Fall der GFP-Reporter an die Oct4 Locus eingefügt ist.
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Verordnung der Chromatin-Umgebung ist ein wesentlicher Prozess erforderlich für die ordnungsgemäße Genexpression. Hier beschreiben wir eine Methode zur Steuerung der Genexpression durch die Rekrutierung von Chromatin-modifizierende Maschinen Gen-spezifischen und reversibel.

Gentranskription durch Umleiten zellulären Maschinerie mit chemischen epigenetische Modifikatoren zu unterdrücken

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...

Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Epigenetik zu beantworten, wie z. B. die Mechanismen der Genregulation und Ursache-Wirkung-Beziehungen zwischen verschiedenen Chromatin-Regulierungselementen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass es erstmals möglich ist, einen Chromatin-Loci mit physiologisch relevanten endogenen Enzymen zu modulieren. Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode haben, Schwierigkeiten haben, weil die EsL-Kultur der Maus von Natur aus schwierig für diejenigen ist, die nicht in der Technik geschult wurden.Eine weitere Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da die Schritte zur Virusinfektion in der Zelle schwer zu erlernen sind. Der Forscher muss zwei getrennte Linien der Zellkultur Zeit, und es ist notwendig, die Sicherheit während dieser Schritte wachsam zu überwachen. Um das Protokoll zu beginnen, Durchgang 18 Millionen von 293T HEK-Zellen pro 50 Zentimeter Platte.Aspirieren Sie die alten Medien und fügen Sie 10 Milliliter einer X Phosphat gepufferte Saline, oder PBS. Aspirieren Sie die PBS und fügen Sie drei Milliliter 0,05%Trypsin. Inkubieren Sie die Zellen in Trypsin für acht Minuten bei 37 Grad Celsius.Gestein und tippen Sie die Zellen auf halbem Weg durch die Inkubation. Am nächsten Tag, wenn die Zellen 60 bis 80% Konfluenz erreicht haben, führen Sie eine Polyethylenimin-, oder PEI-Transfektion durch. Als nächstes mischen Sie die DNA-, PEI- und Transfektionsmedien vorsichtig in einem 15 Milliliter konischen Rohr.Inkubieren Sie die Probe bei Raumtemperatur für 15 Minuten. Nach der Inkubation tropfenweise die Lösung auf die 15-Zentimeter-Platte geben. Dann inkubieren Sie die Probe für 16 Stunden in einem 37 Grad Celsius Inkubator mit 5% Kohlendioxid.Am nächsten Tag die Medien ansaugen und sanft durch vorgewärmte, frische 293 HEK-Medien an den 15 Zentimeter großen Platten ersetzen. Nach dem Medienaustausch die Zellen in einem 37 Grad Celsius Inkubator mit 5% Kohlendioxid für 48 Stunden inkubieren. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer.Passage zuvor vorbereitet mESC in ein 12 Well-Platte-Format mit 100. 000 Zellen pro Brunnen einen Tag vor der Infektion. Für Zellen, die im 10-Zentimeter-Format angebaut werden, die alten Medien ansaugen, fünf Milliliter eines X-PBS hinzufügen, die PBS ansaugen und einen Milliliter 0,25% Trypsin hinzufügen. Inkubieren Sie die Zellen in Trypsin für acht Minuten bei 37 Grad Celsius und gesteinigen und tippen Sie die Zellen auf halbem Weg durch die Inkubation.48 Stunden nach dem Medienaustausch den Überstand der 293T HEK-Zellen entfernen und in ein 50-Milliliter-Konusrohr übertragen. Zentrifugieren Sie den Überstand bei 300 mal G für fünf Minuten, um den Zellabfall zu pellet. Filtern Sie als Nächstes den Überstand durch eine 0,45-Mikron-Membran.Konzentrieren Sie das Virus über Ultrazentrifuge mit einem SW32-Rotor und drehen Sie die Probe bei 72.000-fachem G für zweieinhalb Stunden bei vier Grad Celsius. Während sich das Virus unter Ultrazentrifugation konzentriert, behandeln Sie die CIA-mESC in der 12-Well-Platte mit frischem embryonalen Stamm oder ES-Medien, die fünf Mikrogramm pro Milliliter Polybren enthalten. Wenn die Viruskonzentration beendet ist, saugen Sie den Überstand sorgfältig an und setzen Sie das Viruspellet vorsichtig in 100 Mikroliter eines X PBS aus, um überschüssige Blasen zu vermeiden.Fügen Sie das Virus und ein X PBS zu einem 1,5 Milliliter Mikrofuge Tube. Wirbeln Sie die Röhre bei der niedrigsten Einstellung, um das Virus vollständig auszusetzen. Drehen Sie das Rohr in einer Mini-Tischzentrifuge für fünf bis zehn Sekunden, um Blasen zu entfernen.Fügen Sie 30 Mikroliter des Virus zu jedem Brunnen einer 12 Brunnenplatte hinzu. Die Platte verwirbeln und dann die Proben 20 Minuten lang bei 1000-fachm G zentrieren. Legen Sie die 12 Well-Platte über Nacht wieder in den 37 Grad Celsius Inkubator.Tauschen Sie am nächsten Morgen die Medien mit frischen ES-Medien aus und lassen Sie eine Infektion für 48 Stunden hinnehmen. Nach 48 Stunden Infektion, wählen Sie für Zellen, die das virale Plasmid durch Zugabe des entsprechenden Antibiotikum integriert. Ändern Sie die Medien täglich.Halten Sie die Selektionsmedien auf den Zellen für 72 bis 96 Stunden in einem 37 Grad Celsius Inkubator mit 5% Kohlendioxid. Fahren Sie mit dem chemischen epigenetischen Modifikator oder CEM fort, indem Sie das pulverisierte CEM und Dimethylsulfoxid (DMSO) auf eine Lagerkonzentration von einem Millimolar und eine Arbeitskonzentration von 100 Mikromolaren aussetzen. Nachdem die Zellen 72 bis 96 Stunden lang ausgewählt wurden, teilen Sie die mESC es in ein 12-Well-Format mit 100.000 Zellen pro Brunnen auf.Inkubieren Sie die Zellen in einem 37 Grad Celsius Inkubator mit 5% Kohlendioxid für 24 Stunden. Nach der Inkubation eine Medienlösung von 100 Nanomolaren CEM mit ES-Medien vorbereiten. Verwenden Sie die Medien, um den CIA mESC mit einem Milliliter gut zu füttern.Bewahren Sie einen Brunnen von Zellen ohne zusätzliche Cem es auf, um als Kontrolle zu dienen. Als nächstes ändern Sie die Medien, indem Sie die alten Medien anvisieren und für die Dauer des Experiments alle 24 Stunden einen Milliliter pro gut zubereitetem CEM-freien ES-Medien hinzufügen. Nach 48 Stunden CEM-Behandlung die Zellen ohne CEM-Behandlung in den mit 100 nanomolaren CEM behandelten Zellen mit einem Fluoreszenzmikroskop abbilden.Nehmen Sie repräsentative Bilder mit Phase oder Hellfeld auf, um die mESC-Morphologie bei der 10- bis 40-fachen Vergrößerung aufzuzeichnen. Die Zellen sollten sich um Kolonien mit einigen differenzierten Zellen gebildet haben. Bildnis unter dem FITC-Fluoreszenzkanal beide Zellbedingungen ab.Als nächstes isolieren Sie die Kontroll- und CEM-behandelten Zellen für die Durchflusszytometrie, indem Sie die Medien ansipirieren, die Zellen mit einem Milliliter eines X-PBS waschen, die PBS ansipirieren und 0,25 Milliliter 0,25%Trypsin mit EDTA für acht bis zehn Minuten hinzufügen. Bestätigen Sie, dass die Zellen nicht mehr in großen Klumpen durch das Mikroskop mit 20-facher Vergrößerung gebündelt sind. Wenn sich die Zellen nicht in einer Einzelzellsuspension zu befinden scheinen, pipettesiebe sie vorsichtig mit einer P1000 Pipette nach oben und unten, um die Zellen vollständig zu trypsinisieren.Das Trypsin mit einem Milliliter Frischmedien ablöschen und die Zellen mit hoher Geschwindigkeit mit einer serologischen Pipette wieder aussetzen, bis sich die Zellen in einer Einzelzellsuspension befinden. Dann drehen Sie die Zellen bei 300 mal G für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Aspirieren Sie den Überstand, waschen Sie die Zellen mit einem X PBS, und zentrifugieren Sie die Zellen.Aspirieren Sie den PBS-Überstand und setzen Sie das Zellpellet in 200 Mikroliter FACS-Puffer wieder auf. Führen Sie die Durchflusszytometrie an etwa 50.000 Zellen mit den suspendierten Zellen durch und führen Sie die Proben mit einer Mantelgeschwindigkeit von etwa 5 000 Zellen pro Sekunde aus. Exportieren Sie schließlich die Daten für die weitere Analyse.Phasenbilder des CEM-Systems am Okt4-Ort und cia mESC werden nach 48 Stunden Behandlung mit 100 Nanomolaren cem23 oder mit unbehandelten Zellen auf eine spezifische GFP-Repression hinweisen. Fluoreszierende Bilder zeigen eine helle GFP-Expression in den Steuerzellen und eine reduzierte GFP-Expression in der mit CEM23 behandelten mESC. Die Durchflusszytometrie zeigte durchweg eine um mehr als 30 % abnahme der GFP-Expression in der CIA mESC, die 48 Stunden lang mit 100 Nanomolaren von CEM23 behandelt wurde.Chromatin-Immunpräzipitation, oder CHIP, schwelgte, dass 48 Stunden Behandlung mit 100 Nanomolar von CEM23 den Gehalt an H3K27ac am Zielort im Vergleich zu Kontrollzellen verringerten. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, sich daran zu erinnern, vorsichtig mit den embryonalen Stammzellen der Maus zu sein. Wenn sie sich während des Protokolls unterscheiden, werden die Ergebnisse für ungültig erklärt.Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der synthetischen Biologie, um die In-vivo-Mechanismen im Säugetiergenom zu erforschen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

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