Name: Murine Myokardinfarkt Modell mit permanenten Ligation der linken Anterior absteigende Koronararterie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Lernen Sie die permanente Ligatur der linken Anterior-Descending-Koronararterie bei Mäusen zur Untersuchung von Myokardinfarkt und Herzmuskelpathologie. Dieses chirurgische Verfahren ermöglicht reproduzierbare kardiovaskuläre Forschung.

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Dieses Modell wurde mit Unterstützung des Schweizerischen Nationalfonds (Grants 310030_162629 to LL) und Abteilungsfonds aus den Diensten der Thoraxchirurgie und Intensivmedizin des Universitätsspitals Lausanne entwickelt. JL erhält ein Stipendium der Emma Muschamp Foundation. Wir würdigen die entscheidende Unterstützung von Tierärzten und Mitarbeitern der Fakultät für Biologie und Medizin der Universität Lausanne. Wir danken Dr. Giuseppina Milano vom Service für Herzchirurgie des Universitätsspitals Lausanne und Dr. Alexandre Sarre von cardiovascular assessment Facilty der Universität Lausanne für ihre technischen Hinweise.

Die in diesem Protokoll beschriebenen Tierversuche wurden von der Tierethikkommission des Kantons Waadt überprüft und genehmigt.
HINWEIS: Für diese Experimente verwendeten wir männliche C57Bl/6J-Mäuse mit einem Gewicht zwischen 25 g und 30 g und einem Alter von 8-12 Wochen. Mäuse wurden mit Chow-Pellets und Wasser ad libitum gefüttert und unter konventionellen Bedingungen gezüchtet. Chirurgische Geräte wurden zuvor sterilisiert. Der Experimentator sollte sterile chirurgische Handschuhe und eine chirurgische Maske tragen, um Kontaminationen und postoperative Infektionen zu begrenzen.
1. Anästhesie und Trachealcannulation.
<ol><li>Wiegen Sie die Maus, um die Dosierung von Anästhetika, postoperativen analgetischen Medikamenten und Gezeitenvolumen des Beatmungsgeräts zu bestimmen. Das Heizkissen bei 37 °C vorheizen. Die chirurgische Einrichtung ist in Abbildung 1dargestellt.</li>
	<li>Injizieren Sie die Maus intraperitoneal mit einer Mischung aus Ketamin und Xylazin in einer Dosis von 80 mg/kg bzw. 10 mg/kg.</li>
	<li>Rasieren Sie schnell das Mausfell auf der Kehle und die linke Seite des Rippenkäfigs mit einem elektrischen Rasiermesser.</li>
	<li>Überprüfen Sie die Tiefe der Anästhesie, indem Sie Schwanz und/oder Hinterfüße kneifen und setzen Sie das Tier in einer Supine-Position auf dem Heizkissen ab. Legen Sie eine kleine Gaze kompresse unter den Kopf des Tieres, um eine Überhitzung der Augen zu vermeiden. Okulargel auftragen, um Augentrockenheit zu vermeiden.</li>
	<li>Sichern Sie die vier Gliedmaßen mit Klebeband auf der Oberfläche des Heizkissens. Passieren Sie eine Schleife von 5-0 Seidennaht unter den oberen Schneidezähnen und kleben Sie die Extremität der Schleife mit Klebeband auf das Heizkissen. Dies wird den Mund des Tieres offen halten und die Cannulation erleichtern.</li>
	<li>Haarentfernungscreme auf die vorrasierten Bereiche auftragen und sanft mit einem Wattestäbchen für 1 min massieren. Den Überschuss an Fell und Sahne mit einer Gaze abwischen. Verwenden Sie Tropfen von 0,9% Saline-Lösung und Gaze, um die Einschnittbereiche zu reinigen. Tragen Sie Stücke von steriler Gaze auf die rasierte Kehle und Thorax auf und tränken Sie sie in Iodopovidon. HINWEIS: Wir empfehlen die Anwendung eines lokalen Anästhetikums (Lidocain oder Bupivacain) an Schnittstellen.</li>
	<li>Stellen Sie das Beatmungsgerät auf ein Gezeitenvolumen von 7 ml/kg und eine Belüftungsrate von 140 Hüben/min ein. HINWEIS: Von nun an arbeiten unter einem Mikrochirurgie-Stereomikroskop.</li>
	<li>Halten Sie die Haut auf der Mitte des Halses und führen Sie einen Schnitt von 0,5 cm nach einer kaudalen / cephalischen Linie mit einer kleinen Schere. Trennen Sie die Lappen der Speicheldrüse, dann sanft trennen Faszien des sternohyoidEn Muskels mit gekrümmten sezierenden Zangen, bis Kehlkopf und Luftröhre sichtbar sind. Sichere Kanten der Öffnung mit Retraktoren, die an elastischen Bändern befestigt sind. HINWEIS: Machen Sie diesen Schritt ohne Einschnitt der Muskeln. Ein geschulter Bediener wird in der Lage sein, das Tier über Mundhöhle zu intubieren, ohne die Luftröhre zu beanstanden, was diesen Schritt optional macht.</li>
	<li>Halten Sie die Zunge sanft seitlich. Mit Zangen die stumpfe Innennadel einer 16 G Kanüle in die Luftröhre einlegen. Visualisieren Sie die korrekte Einfügung in die Luftröhre durch den Halsschnitt.</li>
	<li>Schließen Sie die Kanüle an das Beatmungsgerät an und sorgen Sie für eine korrekte Belüftung, indem Sie den Auspuffschlauch in Wasser geben. Das Vorhandensein von Blasen zeigt eine korrekte Intubation an. HINWEIS: Um Gewebe während des Betriebs nass zu halten, setzen Sie sterile Gaze mit 0,9% Saline-Lösung und Iodopovidon auf dem Halsschnitt getränkt. Kontrollieren Sie die Feuchtigkeit während des Eingriffs.</li>
</ol>2. Ligation der LAD-Herzkranzgefäße
<ol><li>Lösen Sie die linke vordere Pfote vom Kanalband und bewegen Sie die Maus vorsichtig in die rechte Dekubitusposition. Sichern Sie die linke vordere Extremität, sobald sich das Tier in der richtigen Position befindet.</li>
	<li>Identifizieren Sie die Linie zwischen linken pectoralis Minor und Hauptmuskeln und machen Sie einen schrägen Hautschnitt auf 1 cm mit einer Schere, die der Linie folgt. Mit sezierenden stumpfen Mikroschere, separate Faszien der pectoralis Muskeln ohne Schnitt. Halten Sie die Pectoralis-Muskeln getrennt mit Retraktoren, die an elastischen Bändern befestigt sind.</li>
	<li>Stellen Sie das Beatmungsgerät mit einem positiven Enddruck(PEEP) von 3 cm H2 O ein.</li>
	<li>Öffnen Sie die Brusthöhle mit stumpfen Zangen im 3. interkostalen Raum zwischen 3rd und 4th ribs. Vermeiden Sie das Berühren der inneren Brustarterie, da Blutungsgefahr besteht. Berühren Sie Weder Herz noch Lunge. Tragen Sie zwei Retraktoren in den Brustkorb auf, einen auf jeder Rippe (Abbildung2A).</li>
	<li>Mit einer gekrümmten feinen Zange, entfernen Sie vorsichtig das Perikard und ziehen Sie es auseinander, ohne das Herz und die Lunge zu schädigen.</li>
	<li>Finden Sie links anterior absteigende (LAD) koronare Arterie. DIE Arterie LAD erscheint als oberflächliche, leuchtend rote Linie, die vom Rand der linken Ohrmuschel in Richtung der Spitze verläuft.</li>
	<li>Verwenden Sie einen Nadelhalter, um eine 7-0 Seidennaht unter dem LAD 2 bis 3 mm unter der linken Voruhr zu passieren. Ziehen Sie die Seide langsam, um ein Reißen von Herzgewebe zu vermeiden. Binden Sie die Ligatur mit drei Knoten. Der untere linke Teil des linken Ventrikels wird sofort blass auf Ligation (Abbildung 2B-E). HINWEIS: Es ist wichtig, nicht zu tief in die ventrikuläre Höhle zu gehen oder zu oberflächlich zu bleiben. Für scheinbetriebene Tiere ziehen Sie die Nahtseide unter den LAD und entfernen Sie sie langsam, um Geweberisse zu vermeiden.</li>
	<li>Lassen Sie die Rippenretraktoren los, halten Sie die 3. Rippe mit Zangen und machen Sie zwei Pässe mit einer 6-0 Seidennaht unter der 3. und 4. Rippe. VORSICHT: Nicht das perforierte Herz oder die Lunge. Verknoten Sie noch keine Knoten.</li>
	<li>Legen Sie drei Tropfen 37 °C 0,9% Salinelösung auf die Öffnung und schließen Sie das Ablaufabgasrohr für 2 oder 3 Atemwege, um die Lunge richtig aufzublasen. Ziehen Sie die Naht und sichern Sie sich mit zwei Würfen.</li>
	<li>Lassen Sie Retraktoren, die Muskeln halten und helfen Sie ihnen, ihren richtigen Platz zu finden.</li>
	<li>Schließen Sie die Brusthaut mit zwei Stichen von 5-0 Nahtseide und sicher mit zwei Würfen. Schließen Sie die Kehlhaut mit einem Stich von 5-0 Nahtseide und sicher mit zwei Würfen.</li>
</ol>3. Postoperative Verfahren und Folgemaßnahmen.
<ol><li>Entfernen Sie Klebebandbänder von den Gliedmaßen. Legen Sie eine Kompresse auf das Heizkissen auf der rechten Seite des Tieres. HINWEIS: Das Gesamtverfahren von der Anästhesie bis zu diesem Punkt sollte nicht länger als 40-45 min dauern. Optional ip 0,2 ml Atipamezol in einer Konzentration von 0,1 mg/ml injizieren, um den Aufwachvorgang zu beschleunigen.</li>
	<li>Intraperitoneal injizieren 0,3 ml 5% Glukoselösung vorgewärmt bei 37 °C.</li>
	<li>Drehen Sie das Tier vorsichtig auf ventralen Dekubitus auf das Kompressenpad.</li>
	<li>Stopp-Lüfter; Wenn die Maus spontan atmet, vorsichtig Kanülen entfernen.</li>
	<li>Subkutane (SC) 0,1 mg/kg Buprenorphin injizieren und Mäuse in einen vorgewärmten Käfig geben, der bei 30 °C erhitzt und mit einem 100% O2 für mindestens 1 h belüftet wird.</li>
	<li>Während der beiden ersten Tage nach der Operation, überwachen Sie die Maus zweimal täglich. Injizieren Sie SC 0,1 mg/kg Buprenorphin zweimal täglich. Intraperitoneal injizieren 0,3 ml 0 von 5% Glukoselösung zweimal täglich. Bieten Sie Mäusen weiche Ernährung und Wasser ad libitum. Erwärmen Sie das Tier bei Bedarf. HINWEIS: Zusätzlich zu Opioiden sollten Tiere mit nichtsteroidalen entzündungshemmenden Medikamenten in der Nahrung gemischt oder in Trinkwasser verdünnt werden.</li>
	<li>Vom dritten Tag an spritzen Sie SC 0,1 mg/kg Buprenorphin zweimal täglich, wenn das Tier ungewöhnliche Anzeichen für allgemeines Aussehen, Atmung oder Verhalten aufweist. Intraperitoneally injizieren 0,3 ml 5% Glukoselösung zweimal täglich, wenn das Tier noch Gewicht verliert. Erwärmen Sie das Tier bei Bedarf. HINWEIS: Wenden Sie bei Bedarf vordefinierte Unterbrechungskriterien strikt an, um übermäßiges Leiden zu vermeiden. In der Regel Mäuse verlieren Gewicht bis tag 3 und 4 und dann Gewicht zu gewinnen. Nach sieben Tagen holen Mäuse in der Regel das Gewicht vor der Operation ab.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Der erste entscheidende Schritt dieses Verfahrens ist sicherlich die Intubation. Wir verwenden die abgestumpfte Innennadel eines 16 G Katheters als Trachealrohr. Wir empfehlen nicht, dieses Setup mit Mäusen zu verwenden, die weniger als 22 g wiegen. Mit diesem Setup kann es schwierig sein, Mäuse richtig mit kleinerem Körpergewicht zu intubieren, ohne die Luftröhre zu beschädigen. Ein weiterer kritischer Punkt ist die Begrenzung von Einschnitten auf den Muskel, während die Luftröhre und der Brustkorb freigelegt werden. Die Verringerung von Gewebeschäden ist von großer Bedeutung, insbesondere bei der Untersuchung von entzündlichen Prozessen nach MI. Deshalb bevorzugen wir sanfte Streuen von Muskeln und Rippen mit Zangen und Retraktoren8,9. Wir verwenden keinen elektrischen Kauteriser, um Blutungen10zu kontrollieren. Dies kann iatrogene Verbrennungen verursachen und Infektionen begünstigen. Sowohl Traumata als auch Infektionen können entzündliche Ausleseausbrüche voreingenommen. Die Anwendung eines extrinsischen PEEP von 3 cmH2O durch Eintauchen des Lüftungsabgass in ein Wasserrohr begrenzt den endexpauratorischen Alveolarkollaps während der Thorakotomie. Die Lokalisierung von LAD ist ein weiterer kritischer Schritt und man sollte bedenken, dass die Anatomie der Herzkranzgefäße je nach Stamm und Genotyp der Maus variieren kann11. Es erfordert einige Erfahrung, um die LAD zu visualisieren, aber die Naht direkt 2-3 mm unter der linken Vorahnung zu platzieren, wie im Verfahren beschrieben, muss eine korrekte Positionierung der Ligation ermöglichen. Die sofortige Verfärbung großer Teile des linken Ventrikels unter der Naht bestätigt die Genauigkeit. Schließlich ermöglicht die künstliche Anwendung von Auto-PEEP durch Blockierung von Beatmungsauslässen für 2-3 Atemwege während des Brustverschlusses eine vorübergehende Hyperinflation der Lunge, die helfen wird, die Luft aus der Brusthöhle zu jagen12. Wir führen absichtlich keine Thoracentese durch, wie in 9,10gezeigt. Auf diese Weise begrenzen wir das Risiko von Lungen- und Herzerkrankungen und vermeiden übermäßige Gewebeschäden oder Perforation.
Myokardiale Ischämie-Reperfusion (I/R) ist ein verwandtes chirurgisches Modell, das die Wiederherstellung des koronaren Blutflusses imitiert, die MI-Patienten in Kliniken durchgeführt wird. Während des I/R-Modells erfolgt ein vorübergehender Verschluss der Herzkranzgefäßarterie durch Anziehen eines Schlauchstücks auf dem LAD für eine Dauer von 20 bis 45 min8,13. Dann wird die Okklusion freigesetzt, um eine Reperfusion des Myokards für die gewünschte Dauer zu ermöglichen. Diese einfache Änderung, die auf unser Protokoll angewendetwird, kann es leicht in ein I/R-Modell 4,8,14,15verwandeln. Der Infarkt kann durch einen Bluttest auf Herztroponin T8,10 oder durch Echokardiographie15bestätigt werden.
MI unterscheidet sich vom I/R-Modell, da die Reperfusion selbst eine Verletzung auslöst. MI induziert mehr Gewebenekrose und Apoptose ist stärker ausgeprägt in reperfused Myokard5. Die Kinetik der inhetzischen Zellen infiltration unterscheidet sich auch zwischen MI und IR mit einer verzögerten Myokardinfiltration von Immunzellen in MI7. Die Größe und Position des Infarktbereichs unterscheiden sich auch zwischen permanenter Ligation und I/R-Modellen15. Vor diesem Hintergrund muss man vorsichtig sein, ein relevantes Modell zu wählen, da I/R- und permanente MI-Modelle nicht gleichwertig sind. Ein weiteres murines Modell des Myokardinfarkts ist das Kryoinfarktmodell. Die Anwendung einer kryogenen Sonde an der LV-Vorderwand induziert das Einfrieren von ventrikulärem Gewebe und blutdurchflussverhaften in der LAD-Arterie. Diese Technik unterscheidet sich jedoch von MI- und I/R-Techniken in Bezug auf Timing und Amplitude von Remodeling und Entzündungsreaktionen16,17.
Variabilität ist eine Einschränkung wie bei jedem chirurgischen Eingriff. Diese Variabilität beruht auf biologischen Unterschieden. Ein gutes Beispiel ist die Variation der koronaren arteriellen Anordnung bei Mäusen11. Es stützt sich auch auf Experimentierfähigkeiten. Es ist erwähnenswert, dass eine angemessene Ausbildung der Experimentatoren obligatorisch ist, um mit diesem Modell stabile Ergebnisse zu erzielen. Ein gut ausgebildeter Experimentator kann leicht Infarktgrößen herstellen, die reproduzierbar sind (Abbildung 3A-B). Die Sterblichkeit des Modells hängt von der Position des LAD, der Dauer der Experimente (Tage, Wochen), der Mausdehnung und den Genotypen ab. Die Arten von Anästhesie und analgetischen Medikamenten können auch das Ergebnis der Experimente mit vermeintlichen kardioprotektive oder kardiodepressive Wirkung beeinflussen. In unseren Händen hat dieses Modell eine globale Sterblichkeitsrate von 25-30%. Diese Sterblichkeitsrate umfasst spontane Todesfälle und Opfer vor dem Ende des Experiments, unabhängig von Belastungen und Experimentdauer. Die meisten Todesfälle oder Opfer liegen zwischen dem zweiten und vierten Tag nach der Operation. Die Anwendung eines strengen Schmerzmanagements und die Nachverfolgung der Tiere kann die Sterblichkeit senken.
Hier stellen wir repräsentative Ergebnisse der Infarktgröße vor, die mit TTC-Färbung und Expression von Proteinen und Genen analysiert wurden, die an entzündlichen oder fibrotischen Prozessen in LV durch Western Blot bzw. Real-Time PCR beteiligt sind (Abbildung 3C-G). Es ist auch möglich, viele dieser Parameter durch enzymgebundenen Immunsorbent Assay (ELISA) oder enzymatische Assays zu messen. Natürlich kann diese Methode gemäß der zu prüfenden Hypothese jede funktionelle Analyse durch Ultraschall, MRT oder intraventrikuläre Kathetermessung von Druck und Volumen durchführen. Es ist auch möglich, Herz zu extrahieren und die Herzzellbiologie an isolierten Zellen weiter zu untersuchen. Insgesamt ist das MI-Modell mit permanenter Ligation der LAD-Herzkranzgefäßarterie besonders nützlich, um entzündliche und fibrotische Prozesse, Wundheilung und Veränderungen der Herzfunktion nach Myokardinfarkt zu bewerten.

Akuter Myokardinfarkt (MI) ist der schwerste Ausdruck ischämischer Herzkrankheiten (IHD). IHD sind die Hauptursache für Morbiditäten und Todesfälle weltweit, vor allem in westlichen Ländern1. Folglich hat sie enorme wirtschaftliche Auswirkungen auf die Gesundheitssysteme2. MI ist gekennzeichnet durch die Okklusion einer Koronararterie durch atherosklerotische Plaque und die anschließende Verhaftung des Blutflusses in großen Teilen des Myokards. Mangelnde Sauerstoffversorgung im Myokard führt zum ischämischen Tod von Kardiomyozyten. Dieser pathologische Zustand löst Reaktionen im ventrikulären Gewebe aus, die letztlich zu Mängeln bei ventrikulären Funktionen, Umbau und Herzinsuffizienz führen3. MI ist ein komplexer pathophysiologischer Zustand, der mehrere und komplizierte biologische Prozesse umfasst, die einen regulierten Zelltod, eine Reaktion auf oxidativen Stress, Entzündungen, Wundheilung, Fibrose und ventrikuläre Umgestaltung umfassen. Einige dieser biologischen Reaktionen werden als individuelle Prozesse in vitro wie Nekrose-induzierte Freisetzung von damage-assoziierten molekularen Mustern und damit verbundenen Entzündungsreaktionen modelliert4. Diese vereinfachten Modelle sind für das Verständnis von MI unerlässlich. Allerdings kann nur ein In-vivo-Modell ein realistisches Bild der biologischen Prozesse Komplexität als Reaktion auf MI beteiligt.
Auch wenn Modelle von MI bei größeren Tieren wie Schweinen enger mit der menschlichen Pathophysiologie von MI in Verbindung stehen, liegt die Kraft der murinen Modelle in den Möglichkeiten der Gentechnik, die fortgeschrittener ist als bei jeder anderen Säugetierart. Andere nicht zu vernachlässigende Aspekte sind die relativ niedrigen Kosten und die Einfachheit des chirurgischen Setups.
Es ist erwähnenswert, dass Modelle der Ischämie-Reperfusion des Myokards andere Ergebnisse aufweisen können als permanente MI-Modelle. Biologische Prozesse wie die Art des zelltoten Einsatzes, Qualität/Amplitude oder Kinetik von entzündlichenund Wundheilungsreaktionen im Myokardgewebe können je nach Modell 5,6,7variieren. Dieses Protokoll der permanenten koronaren Okklusion kann jedoch leicht angepasst werden, um ein Ischämie-Reperfusionsmodell zu erhalten.
Diese Methode ist relevant für Studien im Zusammenhang mit der Physiopathologie von MI ohne Reperfusion und ermöglicht die Überwachung pathologischer Prozesse, die von koronaren Okklusion (Minuten) bis spät im Stadium Herzinsuffizienz (Wochen) am lokalen Herzgewebe und systemische Ebenen.

<table><tbody><tr><td>1 CC Spritze, Omnifix-F</td><td>B. Braun</td><td>9161406V</td><td></td></tr><tr><td>30G- Nadel</td><td>BD Microlance 3</td><td>304000</td><td></td></tr><tr><td>70% Ethanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Betadine 60 ml</td><td>MundiPharma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blunt Retractors</td><td>Fine Science Tools</td><td>18200-09</td><td></td></tr><tr><td>Castroviejo Nadelhalter Gerade mit Lock</td><td>Roboz</td><td>RS-6416</td><td></td></tr><tr><td>Wattestäbchen</td><td>Applimed SA</td><td>6001109</td><td></td></tr><tr><td>Präparierschere, gebogen</td><td>Aesculap</td><td>BC603R</td><td></td></tr><tr><td>Elektrorasierer</td><td>Remington</td><td>HC720</td><td></td></tr><tr><td>Glukose 5% B.Braun</td><td>B. Braun</td><td>531032</td><td></td></tr><tr><td>Haarentfernungscreme, Veet</td><td>Seide & Frische Technologie.</td><td></td><td></td>8218535</tr><tr><td>Iris-Präparierzange voll gekrümmte</td><td>Äskulap</td><td>&nbsp; OC022R</td><td></td></tr><tr><td>Ketasol 100 (100 mg/ml)</td><td>Dr. E. Graeub AG</td><td>QN01AX03</td><td></td></tr><tr><td>Mikroschere, gebogen stumpf/stumpf</td><td>Aesculap&nbsp;</td><td>FM013R</td><td></td></tr><tr><td>NaCl 0,9% B. Braun</td><td>B. Braun</td><td>534534</td><td></td></tr><tr><td>Short</td><td>Fixator Fine Science Tools</td><td>18200-01</td><td></td></tr><tr><td>Seidennaht 5-0, BB</td><td>Ethicon</td><td>K880H</td><td></td></tr><tr><td>Seidennaht 6-0, P-1</td><td>Ethicon</td><td>639H</td><td></td></tr><tr><td>Seidennaht 7-0,BV-1</td><td>Ethicon</td><td>K804</td><td></td></tr><tr><td>Student Dumont #7 Pinzette</td><td>Fein Science Tools</td><td>91197-00</td><td></td></tr><tr><td>Student Feinzange mit abgewinkelten</td><td>feinen Science Tools</td><td>91110-10</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische Handschuhe</td><td>Weitacare</td><td>834301</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgisches Heizkissen</td><td>Personalisierte Einstellung</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Temgesic&nbsp; sol 0,3 mg/ml&nbsp; Buprenorphine</td><td>Indivior Schweiz AG</td><td>N02AE01</td><td></td></tr><tr><td>Innennadel des Trachealtubus eines 16G i.v. cat</td><td>Abbocath-T</td><td>G714-A01</td><td></td></tr><tr><td>Universal S3 Mikroskops, OMPIMD</td><td>Zeizz</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ventilator, MiniVent Model 845</td><td>Harvard Apparatus</td><td>73-0043</td><td></td></tr><tr><td>Viscotears</td><td>Alcon</td><td>1551535</td><td></td></tr><tr><td>Xylasol (1mg/ml)</td><td>Dr. E. Graeub AG</td><td>QN05CM92</td><td></td></tr></tbody></table>

murine myokardinfarkt modell mit permanenten ligation der linken anterior absteigende koronararterie

Murine Myocardial Infarction Model using Permanent Ligation of Left Anterior Descending Coronary Artery

Myokardinfarkt (MI) und akute Koronarerkrankungen gehören zu den prominentesten Todesursachen in der Bevölkerung mit westlichem Lebensstil. Die murinen Modelle des MI mit permanenter Ligation der linken vorderen absteigenden (LAD) Koronararterie imitieren MI beim Menschen. Murine-Modelle profitieren von der umfangreichen Gentechnik, die es heute gibt. Hier schlagen wir ein reproduzierbares murinisches chirurgisches Modell des Myokardinfarkts durch permanente LAD-Koronarligation vor. Unsere Technik umfasst Anästhesie mit Ketamin/Xylazin, die durch Verabreichung eines Antagonisten schnell umgedreht werden kann, Intubation ohne Tracheotomie für die mechanisch unterstützte Beatmung, Belüftung mit Anwendung von extrinsischem positivem Endexpiratorischen Druck (PEEP) zur Vermeidung von Alveolarkollaps, eine Thorakotomiemethode, die sich auf die minimalen chirurgischen Läsionen der Skelettmuskulatur beschränkt, und Lungeninflation ohne Thoracentese. Diese Methode ist spärlich invasiv, reproduzierbar und reduziert die Sterblichkeit und Komplikationen nach der Operation.

Mäuse wurden sieben Tage nach der Operation eingeschläfert. Die Tiere wurden mit 80 mg/kg Ketamin und 10 mg/kg Xylazin anbeet. Unter Anästhesie wurde Blut aus Vena cava entnommen und das Herz entnommen. Atria wurden entfernt, Myokard in eiskaltem PBS gewaschen. Für Messungen ischämischer Bereiche wurden die Herzen 40 min bei -20 °C eingefroren, dann in 20 min bei 37 °C in PBS mit 2% Triphenyltetrazoliumchlorid (TTC) geschnitten und gebeizt. Herzscheiben wurden über Nacht in 4% gepufferter Paraformaldehydlösung bei Raumtemperatur fixiert. Ischämische Gebiete blieben ungefärbt, während lebendes Gewebe aufgrund von Dehydrogenasen rot gefärbt wurde. Ischämische Bereiche wurden als Prozentsatz der weißen Fläche des linken Ventrikels (LV) mit einer Bildgebungssoftware berechnet (Abbildung3A, B). Für biochemische und molekularbiologische Analysen wurden Herzen in flüssigem Stickstoff eingefroren. Nach dem Mahlen von Herzen auf flüssigem Stickstoff wurde das Organpulver für die Protein- und mRNA-Extraktion verwendet. Das Ausmaß der Fibrose im Myokardgewebe von Infarktherzen wurde durch die Western-Blot-Analyse von Alpha-Glattmuskel-Aktin (SMA) und SMAD2-Phosphorylierung beurteilt, die jeweils wichtige Auslesungen von Myofibroblasten und der TGF-Signalaktivierung sind ( Abbildung 3C). mRNA Expression von Tgfb, und downstream Targets Ctgf, Postn und Il11 sind alle Indikatoren für Myokardfibrose. Dies zeigte sich an der Echtzeit-Analyse der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) (Abbildung 3D).
Pro-inflammatorische Signalwege und expression von pro-inflammatorischen Genen wurden in der Regel innerhalb der ersten Woche nach Myokardinfarkt aktiviert gefunden. Die Phosphorylierung des NF-B-P65-Transkriptionsfaktors ist ein Kennzeichen der Entzündung und wurde in ganzen Myokardextrakten der MI-Mäuse beobachtet (Abbildung 3E). mRNA-Expression der pro-inflammatorischen Gene Il1b, Il6 und Cxcl10 (Abbildung 3F) und Monozyten/Makrophagen-Marker Cd14 und Mertk wurden mit Echtzeit-PCR analysiert (Abbildung 3G). Beachten Sie, dass es eine Variabilität in der Ausdehnung der NF-B p65 und SMAD2 Phosphorylierung gab (Abbildung 3C,E, Bahnen 4-7). Diese Variabilität hängt weitgehend von der Größe des Infarkts ab.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59591/59591fig1.jpg"> Abbildung 1 : Beschreibung des chirurgischen Aufbaus. (A) Der chirurgische Aufbau besteht aus einem modifizierten Heizkissen, einem Beatmungsgerät und Retraktoren, die an elastischen Bändern befestigt sind. (B) Set von Scheren, Zangen und Nadelhalter während der Operation verwendet. (C) Nahaufnahme der Mini-Retraktoren. Nicht gezeigt: chirurgisches Stereomikroskop. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59591/59591fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59591/59591fig2.jpg"> Abbildung 2 : Repräsentative Bilder der Chirurgie und LAD Ligation. (A) Geöffnete Brust mit Retraktoren. Der linke Ventrikel war offensichtlich. Obere, linke und untere Retraktoren hielten den Brustkorb und der rechte Retraktor den Pectoralis-Muskel. (B) Die Nadel wurde unter dem LAD übergeben. (C) Nahtseide wurde unter dem LAD in den linken Ventrikel geleitet. (D) Einzelstich auf dem LAD. (E) Ende des Ligationsverfahrens wurde die Naht mit drei Knoten gesichert. (F) Darstellung einer vorderen Sicht des Herzens. Die Position der LAD Ligation war 2-3 mm unter der linken Vorhöfin und über dem diagonalen Zweig des LAD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59591/59591fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59591/59591fig3.jpg"> Abbildung 3 : Fibrose und Entzündung im ganzen Myokard extraktsieben Tage nach der Operation. (A) Repräsentative Bilder der TTC-Färbung eines in Scheiben geschnittenen Infarktherzens sieben Tage nach der Operation. Blass ischämische Bereiche blieben ungefärbt und weiß, während lebendes Gewebe rot gefärbt war. Die Ligation war auf der dritten Scheibe von links zu sehen. (B) Die Größe der ischämischen Bereiche von fünf infarktierten Herzen wurde mit der TTC-Färbungstechnik gemessen. Die Ergebnisse waren der Prozentsatz der weißen Fläche des linken Ventrikels (LV). (C) Western Blot Analyse von SMAD2 Phosphorylierung und Alpha-SMA-Expression in ganzem Myokard als Indikatoren für Fibrose. (D) mRNA-Expression von Tgfb, Ctgf, Postn und Il11 in ganzen Myokardextrakten. (E) Westlicher Fleck der NF-B p65-Phosphorylierung in ganzen Myokardextrakten. (F) mRNA-Expression der pro-inflammatorischen Gene Il1b, Il6 und Cxcl10 in ganzen Myokardextrakten. (G) mRNA-Expression von Cd14 und Mertk als Indikatoren für das Vorhandensein von Monozyten/Makrophagen bzw. phagozytischen Makrophagen im Myokard. N = 3 in Schein und N = 4 in MI-Gruppe. Für die mRNA-Expressionsanalyse war die Expression relativ zur endogenen Kontrolle Rps18 und Gruppenvergleiche waren ungepaarte Student-T-Tests, *p - 0,05, **p - 0,01, *** p - 0,001. In den Bedienfeldern B, D, F und G stellen Fehlerbalken Standardabweichungen dar.  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59591/59591fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Hierin beschreiben wir ein chirurgisches Verfahren, das zeigt, wie eine dauerhafte Ligation der links-vorderen absteigenden Herzkranzgefäße bei Mäusen erreicht werden kann. Dieses Modell ist von hoher Relevanz für die Untersuchung der Pathophysiologie des Myokardinfarkts und der damit einhergehenden biologischen Prozesse.

Murine Myokardinfarkt Modell mit permanenten Ligation der linken Anterior absteigende Koronararterie

Myocardial infarction (MI) and acute coronary diseases are among the most prominent causes of death in population with western lifestyle. The murine ...

Dieses murine Modell der Myokardverletzung ermöglicht die Überwachung pathologischer Prozesse, die von der koronaren Okklusion bis zur Herzinsuffizienz im späten Stadium des lokalen Herzgewebes und der systemischen Ebene auftreten. Diese Methode ist mit allen Derzeit in der Herzbiologie und Physiologie verwendeten Auslesungen kompatibel. Darüber hinaus profitiert es von der immensen Vielfalt der murinen genetischen Modelle.Der Erwerb von adäquaten chirurgischen Fähigkeiten kann einige Zeit in Anspruch nehmen. Dieses Verfahren lernt man am besten Schritt für Schritt mit einem erfahrenen Forscher. Visuelle Demonstration dieses murinen Modells ermöglicht die gemeinsame Nutzung von Hinweisen, die mit dem chirurgischen Eingriff helfen und den Lernprozess beschleunigen können.Verwenden Sie einen elektrischen Rasierer, um schnell eine anästhesierte, 25-zu-30-Gramm, männlich, C57-Black/6 Maus auf der Kehle und der linken Seite des Rippenkäfigs zu rasieren. Bestätigen Sie einen Mangel an Reaktion auf Zehenkneifen. Tragen Sie Salbe auf die Augen des Tieres auf.Legen Sie die Maus in die Supine-Position auf einem Heizkissen, und legen Sie eine kleine Gaze-Kompresse unter den Kopf, um eine Überhitzung der Augen zu vermeiden. Sichern Sie die Gliedmaßen mit Klebeband. Passieren Sie eine Schleife von 5-0 Seidennaht unter den oberen Schneidezähnen, und sichern Sie die Extremität der Schleife auf das Heizkissen, um den Mund während der Kanulation offen zu halten.Enthaartiscreme auf die vorrasierten Bereiche auftragen und eine Minute lang sanft mit einem Wattestäbchen massieren. Entfernen Sie das überschüssige Fell und Creme mit Gaze, und reinigen Sie die exponierte Haut mit Tropfen von 0,9% Saline-Lösung und Gaze. Tragen Sie Stücke von steriler Gaze auf die rasierte Kehle und Thorax auf, und tränken Sie die Gaze mit Iodopovidon.Stellen Sie das Beatmungsgerät auf ein Gezeitenvolumen von sieben Milliliter pro Kilogramm und eine Belüftungsrate von 140 Hüben pro Minute ein. Bewegen Sie die Maus unter einem Mikrochirurgie-Stereomikroskop. Halten Sie die Haut auf der Mitte des Halses, machen Sie einen 0,5-Zentimeter-Einschnitt entlang der kaudalen/cephalischen Linie, und trennen Sie die Lappen der Speicheldrüse.Verwenden Sie gekrümmte Zangen, um die Faszien des Sternohyoidmuskels sanft zu trennen, bis Kehlkopf und Luftröhre sichtbar sind. Dann sichern Sie die Kanten der Öffnung mit Retraktoren an elastischen Bändern befestigt. Ziehen Sie als nächstes die Zunge vorsichtig seitlich und setzen Sie die stumpfe Innennadel einer 16-Spur-Kanüle mit Zange in die Luftröhre ein.Visualisieren Sie eine korrekte Einfügung in die Luftröhre durch den Halsschnitt und schließen Sie die Kanüle an das Beatmungsgerät an. Legen Sie sterile 0,9%saline ergänzt mit Iodopovidon-getränkte Gaze auf den Schnitt, um das Gewebe während der Operation nass zu halten. Dann den Auspuffschlauch in Wasser geben.Das Vorhandensein von Blasen deutet auf eine erfolgreiche Intubation hin. Für die Ligation der linken vorderen absteigenden Koronararterie, oder LAD, bewegen Sie vorsichtig die Maus in die rechte Seite decubitus Position, und sichern Sie die linke vordere Gliedmaße in der neuen Position. Identifizieren Sie die Linie zwischen der linken pectoralis Minor und Hauptmuskeln, und machen Sie einen schrägen ein Zentimeter Hautschnitt entlang der Linie.Mit stumpf sezierenden Mikroscheren, trennen Sie die Faszien der Pectoralis Muskeln, ohne das Gewebe zu zerschneiden, und verwenden Sie Retraktoren, die an elastischen Bändern befestigt sind, um die Trennung aufrechtzuerhalten. Stellen Sie das Beatmungsgerät mit einem positiven Endexiratoratusdruck von drei Zentimetern Wasser ein. Verwenden Sie stumpfe Zangen, um die Brusthöhle im dritten interkostalen Raum zwischen der dritten und vierten Rippe zu öffnen.Legen Sie zwei Retraktoren in den Rippenkäfig, einen auf jede Rippe, und verwenden Sie eine gekrümmte feine Zange, um das Perikard vorsichtig zu entfernen, ohne das Herz und die Lunge zu schädigen. Suchen Sie den LAD als oberflächliche, leuchtend rote Linie, die vom Rand der linken Aurikel in Richtung Der Scheitelpunkt verläuft. Verwenden Sie einen Nadelhalter, um eine 7-0 Seidennaht unter dem LAD zwei bis drei Millimeter unterhalb der linken Vorhöfin zu passieren.Ziehen Sie die Seide langsam, um herzgewebe zu reißen, binden Sie die Ligatur mit drei Knoten. Der untere linke Teil des linken Ventrikels wird sofort blass auf Ligation. Lassen Sie nun die Rippenretraktoren los und halten Sie die dritte Rippe mit Zangen, machen zwei Pässe mit einer 6-0 Seidennaht unter der dritten und vierten Rippe.Legen Sie drei Tropfen 37-Grad Celsius 0,9%saline Lösung auf die Öffnung, und schließen Sie das Ablauf-Abgasrohr für zwei oder drei Atemwege Zyklen, um die Lunge richtig aufzublasen. Ziehen Sie die Naht mit zwei Würfen fest und lösen Sie die Retraktoren, die die Muskeln halten, und helfen Sie den Muskeln, an ihre richtige anatomische Position zurückzukehren. Dann schließen Sie die Brusthaut mit zwei Stichen und zwei Würfen von 5-0 Naht seide.Schließen Sie die Kehlhaut mit einem Stich von 5-0 Nahtseide und zwei Würfe. Am Ende des Verfahrens, entfernen Sie die Bandbänder von den Gliedmaßen, drehen Sie das Tier vorsichtig zu ventralen Dekubitus auf das Komprimus, und legen Sie eine Kompresse auf dem Heizkissen auf der rechten Seite des Tieres. Intraperitoneal injizieren 0,3 Milliliter 37-Grad-Celsius erwärmt 5%Glukose-Lösung.Stoppen Sie das Beatmungsgerät. Wenn die Maus spontan atmet, entfernen Sie vorsichtig die Kanüle. Subkutan injizieren 0,1 Milligramm pro Kilogramm Buprenorphin.Legen Sie die Maus in einen 30-Grad-Celsius-Käfig mit 100% Sauerstoff für mindestens eine Stunde mit Überwachung belüftet. Während der beiden ersten Tage nach der Operation, stellen Sie der Maus eine weiche Ernährung und Wasser ad libitum, Erwärmung des Tieres nach Bedarf. Sieben Tage nach der Operation bleiben die ischämischen Bereiche von Triphenyltetrazoliumchlorid unbefleckt, während das lebende Gewebe aufgrund von Dehydrogenasen rot färbt.Die ischämischen Bereiche können dann als Prozentsatz der weißen Fläche der linken Herzkammer in einem bildgebenden Softwareprogramm berechnet werden. Die Western Blot-Analyse für alpha-glattes Muskelaktin und SMAD2-Phosphorylierung, die jeweils wichtige Auslesungen von Myofibroblasten und der transformierenden Wachstumsfaktor-Beta-Signalaktivierung sind, kann verwendet werden, um das Ausmaß der Fibrose im Myokardgewebe der infarktierten Herzen zu bestimmen. Eine Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktionsanalyse des transformierenden Wachstumsfaktors Beta und seiner nachgelagerten Ziel-mRNA-Expression kann auch durchgeführt werden, um das Vorhandensein von Myokardfibrose zu bewerten.Pro-inflammatorische Signalwege und die Expression von pro-inflammatorischen Genen wird in der Regel gefunden, innerhalb der ersten Woche nach Myokardinfarkt aktiviert werden. mRNA-Expression von pro-inflammatorischen Genen und Monozyten-/Makrophagenmarkern wird ebenfalls beobachtet. Die Ligationshöhe wird das Überleben entscheidend beeinflussen und sollte an jede Sorte oder jeden Genotyp angepasst werden, da die LAD-Verzweigung variieren kann.Konstanten in der Ligation sind der Schlüssel, um reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen. Dieses Verfahren kann mit jeder Analysemethode gekoppelt werden und kann durch funktionelle Analyse, Gewebefixierung, Zellkultur oder jede Technik von Interesse gefolgt werden.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Dieses Video zeigt, wie eine schnelle und zuverlässige Modell nutzen, um pathobiologischen und pathophysiologischen Prozessen der Myokardischämie zu studieren.

LAD-Ligation: einem Mausmodell der Myokardinfarkt

Zahlreiche genetische Manipulationen und / oder intramyokardialen Injektionen von Genen, Proteinen, Zellen und / oder Biomaterialien basieren auf die Dimension der Zeit in Studien zur akuten Ischämie / Reperfusion und chronischer Umbau in Mäusen überlagert. Dieses Video zeigt die mikrochirurgische Verfahren für die Ischämie / Reperfusion, permanent koronare Ligation und intramyokardialen Injektion Studien.

Koronare Ligation und intramyokardialen Injection in einem Mausmodell der Infarkt

Das chirurgische Verfahren zum experimentellen Herzinfarkt in Mäusen zu induzieren beginnt mit linken Thorakotomie zwischen der dritten und der vierten Rippe, um die vordere Oberfläche des Herzens und linken Lunge visualisieren. Die linke Koronararterie ligiert ist, wird die Brust geschlossen und der Maus erlaubt ist, spontan zu erholen.

Geändert Technik für Coronary Artery Ligation in Mäuse

In diesem Video beschreiben wir einen chirurgischen Eingriff, um ein Mausmodell für einen Myokardinfarkt zu erstellen, indem die linke anteriore absteigende Koronararterie dauerhaft ligiert wird.

Generierung eines Mausmodells des Myokardinfarkts: Ein chirurgisches Verfahren zur dauerhaften Ligatur der linken vorderen absteigenden Koronararterie im Mausmodell

Wir stellen ein chirurgisches Verfahren, experimentelle Ischämie / Reperfusions (I / R) Schädigung induzieren Myokardinfarkt (MI) in Mausmodellen, die für mehr Klarheit in der Positionierung der Ligation an der linken vorderen absteigenden Arterie (LAD) simulieren können, um die Reproduzierbarkeit zu erhöhen MI Experimente in Mäusen.

Einem Mausmodell der myokardialen Ischämie-Reperfusion Injury durch Ligation des linken vorderen absteigenden Arterie

Herzinsuffizienz ist die Hauptursache für Krankenhausaufenthalte und eine der Haupttodesursachen. Ein Modell der permanenten Ligatur der linken anterioren absteigenden Koronararterie bei Mäusen wird angewendet, um den ventrikulären Umbau und die kardiale Dysfunktion nach einem Myokardinfarkt zu untersuchen. Die Technik der invasiven hämodynamischen Messungen an Mäusen wird vorgestellt.

Permanent Ligation des linken vorderen absteigenden Koronararterie bei Mäusen: Ein Modell der Post-Myokardinfarkt Umbau und Herzinsuffizienz

Wir bieten eine zuverlässige Methode für die Ligatur der linken vorderen absteigenden Arterie (LAD) in einem Mausmodell an. Diese Methode ist vergleichsweise weniger invasiv als andere Methoden, die eine endotracheale Intubation, einen linksseitigen Thorakotomieansatz und eine Thorakozentese umfassen. Diese Methode kann sowohl als Modell für akuten als auch für chronischen Myokardinfarkt (MI) verwendet werden.

Murine linken vorderen absteigenden (LAD) Koronararterienligatur: ein verbessertes und vereinfachtes Modell für Myokardinfarkts

Dieses Protokoll beschreibt die Schritte zur Induktion eines Myokardinfarkts bei Mäusen unter Beibehaltung des Perikards und seines Inhalts.

Ein intaktes ischämisches Nagetiermodell des Perikards

Hier beschreiben wir eine einfache und reproduzierbare Methode, die bei Mäusen durch Präzisionsligation der linken vorderen absteigenden Koronararterie durch Mikromanipulation einen Myokardinfarkt oder eine myokardiale Ischämie-Reperfusionsverletzung induzieren kann.

Induktion von Myokardinfarkt und myokardialer Ischämie-Reperfusionsschädigung bei Mäusen

Hier wird ein chirurgisches Verfahren zur permanenten Ligatur der linken Koronararterie bei Mäusen vorgestellt. Mit diesem Modell kann die Pathophysiologie und die damit verbundene Entzündungsreaktion nach Myokardinfarkt untersucht werden.

Linke Koronararterienligatur: Ein chirurgisches Mausmodell des Myokardinfarkts

Lernen Sie die permanente Ligatur der linken Anterior-Descending-Koronararterie bei Mäusen zur Untersuchung von Myokardinfarkt und Herzmuskelpathologie. Dieses chirurgische Verfahren ermöglicht reproduzierbare kardiovaskuläre Forschung.

Murine Myokardinfarkt Modell mit permanenten Ligation der linken Anterior absteigende Koronararterie

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