Name: Generierung von orthotopischen Pankreastumoren und Ex-vivo-Charakterisierung der tumorinfiltrierenden T-Zell-Zytotoxizität (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-12-07T17:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 16 s
Description: Lernen Sie die chirurgische Erzeugung orthotoper Pankreastumoren und die Ex-vivo-Stimulation tumorinfiltrierender T-Zellen zur Analyse der Zytotoxizität mittels Durchflusszytometrie. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung immuntherapeutischer Strategien.

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Wir danken dem Animal Technician Service und Dr. Alzbeta Talarovicova (Barts Cancer Institute, Queen Mary University of London, Vereinigtes Königreich) für ihre Unterstützung während der orthotopischen Chirurgie. Wir danken auch Dr. Jennifer Morton (Beatson Institute for Cancer Research, Glasgow, Vereinigtes Königreich) für ihre Anleitung in der chirurgischen Technik, Dr. Cristina Ghirelli (Barts Cancer Institute, Queen Mary University of London, London, Vereinigtes Königreich) für ihre Beratung zur Tumorverdauung und Dr. Fabienne McClanahan (Barts Cancer Institute, Queen Mary University of London, London, Vereinigtes Königreich) für ihre Beratung zu Ex-vivo-T-Zellstimulationsprotokollen. Wir möchten auch dem Medical Research Council (MRC), dem Pancreatic Cancer Research Fund (PCFR) und der Ovarian Cancer Action danken, die diese Forschung finanziert haben.

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Die Autoren haben nichts zu verraten.

In-vivo-Modelle von Bauchspeicheldrüsenkrebs bieten unschätzbare Werkzeuge, um das Fortschreiten der Krankheit zu verstehen und neue Therapeutika ziele3zu bewerten. Insbesondere das orthotopische Modell ist ein kostengünstiges und reproduzierbares Modell, das in großen Mäusekohorten gleichzeitig angewendet werden kann4,27. Das orthotopische Modell bietet auch die kognitierte Mikroumgebung und das intakte Immunsystem für das Tumorwachstum, was es besser geeignet macht als die subkutanen und PDX-Modelle. Wir haben jedoch festgestellt, dass einige Elemente der Immuninfiltration zwischen dem orthotopischen Modell und KPC-Mäusen, dem Goldstandard-Murine-Modell10,unterscheiden können. Ein Grund dafür könnte das beschleunigte Tumorwachstum im orthotopischen Modell sein. Weitere Unterschiede in der Dichte von Immunzell-Untergruppen wurden zwischen den orthotopischen und subkutanen Modellen3,28beschrieben. Obwohl das transgene KPC-Modell teurer und variabel6ist, sollten wichtige Befunde nach Möglichkeit in einer kleinen Kohorte von KPC-Mäusen überprüft werden.
Die Vorbereitung von Tumorzellen für die orthotopische Chirurgie ist ein kritischer Schritt im Protokoll. Zellen sollten sich immer in der Logphase des Wachstums und mykoplasma- und infektionsfrei befinden. Orthotopische Chirurgie sollte verschoben werden, wenn es irgendwelche Bedenken über Tumorzellwachstum gibt. Die Verwendung von Kellermembran verbessert die Tumorinzidenzrate gegenüber injizierenden Zellen ohne sie29 und reduziert Zelllecks und damit peritoneale Ausbreitung27. Sobald sie jedoch in der Kellermembran ausgesetzt sind, sollten Tumorzellen schnell injiziert werden (innerhalb von 2 Stunden), um Zellverlust zu vermeiden. Die Anzahl der Tumorzellen, die zur Erzeugung von Tumoren benötigt werden, ist wahrscheinlich zelllinienabhängig, und es sollte ein Bereich von Zellnummern getestet werden (z. B. von 100 – 100.000), die auch die Zeit bestimmen können, um den Endpunkt zu erreichen. Es ist wahrscheinlich, dass es eine Fehlermarge bei der Vorbereitung von 1.000 Zellen pro Maus für die Injektion geben wird; Daher sollte die Behandlung von Gruppen, wenn mehrere Tage operiert werden müssen, gleichmäßig auf Tage verteilt werden, um Chargeneffekte zu kontrollieren. Die meisten chirurgischen Schritte können je nach Vorlieben geändert werden; Es ist jedoch darauf zu achten, dass die Kellermembran nicht gestört wird, wenn die Bauchspeicheldrüse in der Bauchhöhle ersetzt oder die Peritonealwand geschlossen wird. Kellermembranlecks können Tumorzellwachstum an der Peritonealwand verursachen, die sich schnell bilden und dazu führen können, dass das Tier früher geopfert werden muss.
Idealerweise sollten Bauchspeicheldrüsentumoren nach der Ernte schnell verdaut und sofort auf ex vivo-Stimulation vorbereitet werden. Dies ist jedoch möglicherweise nicht möglich, wenn es eine große Charge von Tumoren zu ernten, in diesem Fall Tumoren sollten auf Eis gehalten und in Chargen verdaut werden. Art, Konzentration und Dauer der Exposition gegenüber Verdauungsenzymen haben gezeigt, dass sie eine große Anzahl von Oberflächenmolekülen auf den Immunzellen30,31,32beeinflussen. Die Verdauungszeit ist auch absichtlich kurz, um den Zelltod zu begrenzen33. Verdautierte Zellen können im Gefriermedium für die langfristige Lagerung eingefroren werden; jedoch tritt beim Auftauen ein gewisser Zellverlust auf. Der Verdauungsprozess kann weniger optimal sein, wenn die Tumorstücke vor der Kollagenase-Inkubation nicht ausreichend gewürfelt sind, und dies wird offensichtlich sein, da harte Tumorstücke nach der Verdauung im Filter verbleiben. Die Kollagenase-Konzentration kann gesenkt werden, wenn sie mit gesunden Bauchspeicheldrüsen- oder Tumoren im Frühstadium arbeitet; Berichte über die Extraktion gesunder Pankreasduktalzellen verwenden deutlich niedrigere Konzentrationen34. Ein hohes Maß an Epithelzelltod ist während der Verdauung zu erwarten; Immunzellen sollten den Prozess jedoch gut vertragen. Alternative Methoden existieren, um lebensfähige Epithelzellen für organoides Wachstum zu isolieren35 oder um Gewebearchitektur zu erhalten36.
Änderungen am Stimulationsprotokoll können je nach gewünschtem Auslesen und analysierten Immunzellen (z.B. Makrophagen oder B-Zellen) problemlos vorgenommen werden. Die Verwendung von Panstimulationreagenzien PMA/Ionomycin diskriminiert nicht die TCR-Antigen-Spezifität, was sie nützlich macht, wenn das Antigen nicht bekannt ist. Die Produktion von IFN ist jedoch eng mit dem TCR-Engagement37 verbunden, und sowohl die IFN-Produktion als auch die TNF-Produktion sind bei den PDAC-Antitumorreaktionen von entscheidender Bedeutung38. Die PMA/Ionomycin-Stimulation spiegelt die maximale Fähigkeit von T-Zellen zur Herstellung von Zytokinen wider, die von den T-Zellen innerhalb der Tumormikroumgebung erzeugt werden könnten oder auch nicht. Die endogene Produktion kann ohne Stimulation gemessen werden; Die Pegel können jedoch weit niedriger oder nicht nachweisbar sein. Es gibt alternative Methoden, um T-Zellen zu stimulieren: Anti-CD3/28-beschichtete Perlen, die auch kein Antigen oder sogar andere Immunzellpopulationen benötigen. Der Vorteil dieser Methode besteht darin, die Quantifizierung der Zytokinproduktion durch bestimmte T-Zell-Teilmengen ohne Trennmethoden zu ermöglichen. Andere Marker der Zytotoxizität (Granzym B und Perforin A), Aktivität (IL-2) oder Immunsuppression (IL-10) können ebenfalls21hinzugefügt werden. Es stehen jedoch nicht alle Zytokine und Interessensfaktoren zur Verfügung, um hochwertige Strömungszytometrie-Antikörper zu erkennen. Daher, wenn es andere Anwendungen wie ELISA erforderlich gibt, kann die Stimulation ohne die Einbeziehung von Brefeldin A/Monensin durchgeführt werden, so dass Zytokin in den Überstand freigesetzt werden kann. Allerdings wird dies eine vollständige Freisetzung von Zellzytokin ermöglichen und es wird nicht möglich sein, zu bestimmen, welche Zellpopulationen dazu beigetragen haben.
Die IFN-Produktion ist ein dominantes Merkmal einer antitumoralen T-Zell-Antwort, die häufig als Ersatz für die TCR-Antigenerkennung37,38verwendet wird. Andere In-vivo-Methoden, die antigenspezifische Reaktionen genauer definieren, nutzen Tumorzellen, die ein bekanntes Antigen exdrücken, wie Ovalbumin oder SV40. Das universelle Antigen kann dann ex vivo zur Prüfung der T-Zellerkennung oder in Kombination mit einer TCR-beschränkten Wirtsmaus verwendet werden. Wenn das Antigen unbekannt ist, kann die Quantifizierung der klonalen T-Zell-Erweiterung durch Bulk-TCR-Sequenzierung oder neuerdings durch einzellige TCR-Sequenzierung39,40durchgeführt werden. Um den Zustand der intratumoralen T-Zell-Antwort vollständig zu verstehen, sollten auch Marker gemessen werden, die auf Erschöpfung oder hemmende Rezeptoren hinweisen, einschließlich: CTLA-4, PD-1, LAG-3, TIM3, 2B4. Neben Markern von Effektor-T-Zellen (CD44hi, CD62lo) und proliferativer Aktivität, Ki67+ oder CSFE-Verdünnung41,42,43,44. Insgesamt bietet das orthotopische Modell eine nützliche Plattform, um therapeutische Strategien schnell zu testen, insbesondere, die die antitumorale T-Zell-Antwort modulieren können, die dann auf einer kleineren Kohorte von transgenen, KPC-Mäusen validiert werden kann.

Diese Methode beschreibt vom Start bis zum Ende das chirurgische Verfahren zur Erzeugung orthotopischer Bauchspeicheldrüsentumoren mit einer minimalen Menge an zellulärem Material und die anschließende schnelle Dissoziation etablierter Tumoren für eine umfassende Durchflusszytometrieanalyse von Immunzellpopulationen, einschließlich ex vivo-Analyse der T-Zellfunktion.
Pankreasduktodalsocarkinom (PDAC) ist ein aggressives Karzinom mit nur 8 % der Patienten, die 5 Jahreüberleben 1. Da weniger als 20 % der Patienten für die chirurgische Resektion2in Frage kommen, sind frische Patientenproben für die Forschung nicht leicht zugänglich und daher bieten In-vivo-Modelle wesentliche Instrumente zur Untersuchung dieser Krankheit. Es gibt mehrere murine Modelle von PDAC: orthotopisch, subkutan, transgene, intravenöse und patientenabgeleitete Xenograft (PDX), ausführlich beschrieben hier3. Das hier beschriebene orthotopische Modell ermöglicht die Injektion syngenischer PDAC-Zellen in die Bauchspeicheldrüse immunkompetenter Mäuse. Dies kann in großen Kohorten von Wildtyp- oder Mutantenmäusen durchgeführt werden und bietet somit ein kostengünstiges und konsistentes Modell für den Vergleich von therapeutischen Wirkstoffen. Wichtig ist, dass das orthotopische Modell die kognitierte Mikroumgebung für das Wachstum von Tumorzellen und Metastasen in unseren Händen und anderen4 an klinisch relevante Stellen (z. B. Leber) liefert und damit klinisch relevanter ist als die subkutanen oder chemisch induzierten Modelle. Orthotopische Tumoren zeigen wichtige Merkmale von PDAC, wie eine starke desmoplastische Reaktion mit einer Fülle von Fibroblasten und extrazelluläre Matrixabscheidung5. Transgene Modelle von PDAC sind der Goldstandard des murinen Modells und das am häufigsten verwendete ist das KPC-Modell, das mutierte KrasG12D/+ und Trp53R172H/+ unter dem Pankreas-spezifischen Pdx-1-Cre Promoter6ausdrückt. Weitere KPC- und andere in vivo PDAC-Modelle werden hier überprüft7. KPC-Mäuse entwickeln spontan Bauchspeicheldrüsentumoren mit einem Krankheitsverlauf, der die Merkmale des menschlichen PDAC6originalgetreu nachbildet. Wie bei allen transgenen Modellen ist das Zuchtprogramm jedoch kostspielig, die Tumorprogression ist variabel und erfordert daher oft große Mäusekohorten. PDX-Modelle verwenden patientenabgeleitete Tumorzellen oder -stücke, die dann entweder orthotopisch oder häufiger subkutan in immungeschwächten Mäusen angebaut werden. Xenograft-Modelle bieten nützliche Werkzeuge zum Screening therapeutischer Verbindungen und berücksichtigen die Heterogenität der Patienten. Sie bieten jedoch keine vollständige Immunmikroumgebung und beschränken damit ihre Anwendungen8,9.
Einmal etabliert, orthotopische Tumoren in der Regel etwa 1 Monat oder mehr zu wachsen (abhängig von der verwendeten Zelllinie) und bilden große Tumoren, die leicht durch Ultraschall oder MRT abgebildet werden können, um progression zu verfolgen und die Behandlungswirksamkeit4,5,10. Sobald jedoch exponentielles Wachstum, die letzte Phase des Tumorwachstums kann schnell sein, so dass die meisten Behandlungsschemas relativ früh begonnen werden (z.B. 14 Tage)11,12. Das Immunsystem spielt eine entscheidende Rolle bei der Tumorentwicklung, auch bei PDAC, das durch einen immunsuppressiven Tumor gekennzeichnet ist, der mit relativer Knappheit von T-Zellen und häufiger Anwesenheit von myeloiden Zellen13infiltriert ist. Eine hohe Präsenz von T-Zellen in PDAC verleiht eine bessere Prognose14,15. Als Einzelwirkstoffe haben Immun-Checkpoint-Inhibitoren, die die Immunsuppression von T-Zellen lindern, wie Anti-CTLA-416 und Anti-PD-L117,jedoch keinen klinischen Nutzen bei PDAC-Patienten gezeigt, wahrscheinlich weil die reaktivität der T-Zellen insgesamt sehr gering ist. Jedoch, Agenten, die Prime T-Zell-Antworten, wie Anti-CD40, Anti-PD-L1/CTLA-4-Resistenz18,19 und Impfung mit GM-CSF-sekretierenden allogenen PDAC-Impfstoff (GVAX) kann die Immunogenität der PDAC-Tumoren20erhöhen , was darauf hindeutet, dass die Verbesserung der T-Zell-Antworten wichtige therapeutische Möglichkeit bildet.
Entscheidend für eine antitumorale T-Zell-Antwort ist die Erkennung von tumorabgeleiteten Antigenen über den T-Zell-Rezeptor (TCR) und die anschließende Produktion von zytotoxischen Zytokinen und Granulaten. Während die T-Zell-Antigen-Erkennung durch TCR-Sequenzierung bestimmt werden kann, ist dieser Ansatz kostspielig und zeitaufwändig. Die Quantifizierung von tumorinfiltrierenden T-Zell-Teilmengen liefert jedoch einen guten Hinweis auf eine antitumorale Reaktion. Eine weitere Untersuchung der T-Zellaktivität ex vivo in Bezug auf Degranulation, Zytokinproduktion und andere zytotoxische Faktoren liefert eine tiefere funktionelle Analyse. Diese Assays können an frischen Tumorproben durchgeführt werden und viele Parameter der T-Zellfunktion können schnell durch Durchflusszytometrie gemessen werden.
CD8+ und CD4+ T-Zellen produzieren Zytokine wie IFN und TNF, um eine Immunantwort zu potenzieren21. IFN-induziert MHCI-Upregulation auf Zielzellen, induziert Differenzierung und Rekrutierung von Immunzellen und unterstützt den Zelltod. Die IFN-Produktion durch CD8+ T-Zellen ist gut charakterisiert, um Teil einer antitumoralen Reaktion zu sein und korreliert mit der Tumorregression22,23. TNF ist ein weiteres proinflammatorisches Zytokin, das sowohl von CD8+ als auch von CD4+ T-Zellen hergestellt wird. Es verbessert die TCR-abhängige Aktivierung und die Proliferation von T-Zellen und unterstützt die antitumorale Reaktion. Bei TCR-Engagement können zytotoxische CD8+ T-Zellen einer Degranulation unterzogen werden, bei der vorgebildete sekretore Lysosomen, die zytotoxische Moleküle enthalten, in die immunologische Synapse freigesetzt werden, um einen Zielzellabbau zu verursachen21. Zu diesen Molekülen gehört Perforin, ein Protein, das an die Zielzellmembran bindet und Poren bildet, die dann die Membranintegrität stören und die Diffusion21 oder Endozytose24 anderer zytotoxischer Moleküle, wie Granzyme B, direkt in das Zytoplasma der Zielzelle ermöglichen. Granzyme B ist eine Protease, die den Abbau mehrerer Proteine innerhalb der Zielzelle inszeniert, was zum Zelltodführt 21. Die Freisetzung solcher Moleküle erfordert eine Exozytose von Endosomen an die Zelloberfläche, wo der endosomale Marker CD107a (auch bekannt als LAMP-1) vorübergehend in die Zellmembran25eingearbeitet wird.
Die Messung der Zytokinsekretion durch T-Zellen erfordert deren Isolierung durch strömungsunterstützte Zellsortierung oder perlenbasierte Separationstests, die bei einer großen Anzahl von Proben gleichzeitig nicht ohne weiteres durchgeführt werden können. Die Messung von intrazellulären Zytokinen erfordert jedoch keine Vorisolationsschritte und kann leicht an mehreren Proben gleichzeitig durchgeführt werden, was einen höheren Durchsatz ermöglicht. Da Zytokine schnell von T-Zellen abgesondert werden, können die intrazellulären Ebenen nicht nachweisbar sein und daher benötigt die T-Zelle Stimulation, um die Basalzytokinproduktion zu erhöhen. Um die antigengetriebene Zytokinproduktion zu bewerten, muss das von der TCR anerkannte Antigen der T-Zelle durch ein grundiertes APC in vitro vorgelegt werden. In Fällen, in denen die Antigenspezifität nicht bekannt ist, ist ein breiter Stimulationsansatz erforderlich. Die TCR-Stimulation kann mit Anti-CD3/28-Perlen nachgeahmt werden, die sowohl TCR-Aktivierung als auch Costimulation bieten, was die Zytokinproduktion und -proliferation induziert. Eine kostengünstigere Alternative ist jedoch die Verwendung von PMA und Ionomycin, die zusammen Signalwege, die zur Synthese und Freisetzung von intrazellulären Zytokinen führen, weitgehend aktivieren. Insbesondere aktiviert PMA die Proteinkinase C (PKC) und Ionomycin erhöht intrazelluläre Ca2+-Ionen, was zu einer erhöhten Zellsignalisierung führt. Um den intrazellulären Gehalt an Zytokinen zu erhalten, kann diese Stimulation effektiv mit den Protein-Transport-Inhibitoren Brefeldin A und Monensin kombiniert werden, die Proteine im Golgi blockieren und so eine extrazelluläre Freisetzung verhindern. Die Verwendung von PMA/Ionomycin ist eine etablierte Methode zur Stimulierung von T-Zellen und es besteht eine starke Korrelation zwischen extrazellulär freigesetzten und intrazellulären Zytokinen26. Die Stimulation von T-Zellen mit PMA und Ionomycin erhöht auch den Lysosomenhandel zur Zellmembran und so wird CD107a vorübergehend auf die Zelloberfläche integriert, bevor es in die Zelle recycelt wird. Durch die Einbeziehung eines Anti-CD107a-Antikörpers während der Stimulation ist es möglich, ihn als Marker der Degranulationsaktivität25zu verwenden.
Diese Methode verdaut die Tumore schnell, um eine einzellige Suspension zu ermöglichen. An dieser Stelle können einzelne Populationen direkt für die Durchflusszytometrie gebeizt oder mit nachgeschalteten Methoden gereinigt werden: strömungsunterstützte Zellsortierung oder Magnetperlentrennung. Die Vorbereitung einer einzelzelligen Suspension für die Durchflusszytometrieanalyse ermöglicht eine Hochdurchsatzanalyse mehrerer Immunzellpopulationen und ihrer phänotypischen Marker und liefert eine genaue Quantifizierung der Immunzellzahl und des Phänotyps.
Schließlich verhindert das hier beschriebene Verdauungsprotokoll den Verlust von Zell-Oberflächen-Markern und hält die Lebensfähigkeit der Immunzellen aufrecht, so dass Immunzellen weitere Zellreinigungsschritte und Kultur nach Bedarf durchlaufen können. Diese Methode wurde jedoch nicht auf die Ableitung von Epithelzellen aus dieser Verdauung getestet.

<table><tbody><tr><td>6/0 Gauge beschichtetes Vicryl resorbierbares Nahtmaterial</td><td>Ethicon</td><td>W9500T</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; m porengroßes Zellsieb</td><td>Fisher Scientific</td><td>11597522</td><td></td></tr><tr><td>9 mm Clay Adams Clips</td><td>VetTech Solutions</td><td>IN015A</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD107a PE (Klon 1D4B)</td><td>Biolegend</td><td>121612</td><td>1:100 zu Nährmedien</td></tr><tr><td>anti-CD16/CD32</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td>Verwendung bei Endverdünnung 1:200</td></tr><tr><td>anti-CD3 PerCP eFluor710 (Klon 17A2)</td><td>Biolegend</td><td>46-0032</td><td>Verwendung bei Endverdünnung 1:50</td></tr><tr><td>anti-CD4 FITC (Klon GK1.5)</td><td>eBioscience</td><td>11-0041</td><td>Verwendung bei Endverdünnung 1:100</td></tr><tr><td>anti-CD45 Brilliant Violet 605 (Klon 30-F11)</td><td>Biolegend</td><td>103140</td><td>Verwendung bei Endverdünnung 1:200</td></tr><tr><td>anti-CD8 Brilliant Violet 421 (Klon 53-6.7)</td><td>Biolegend</td><td>100738</td><td>Verwendung bei Endverdünnung 1:100</td></tr><tr><td>anti-IFN-gamma PE/Cy7 (Klon XMG1.2)</td><td>Biolegend</td><td>505826</td><td>Verwendung in der Endverdünnung 1:50</td></tr><tr><td>anti-TNF-alpha Alexa Fluor 647 (Klon MP6-X)</td><td>Biolegend</td><td>506314</td><td>Verwendung in der Endverdünnung 1:50</td></tr><tr><td>BD Matrigel Basalmembran Matrix Hohe Konzentration</td><td>BD Biosciences</td><td>354248</td><td>Aliquot auf Eis und lagern in -20 & Grad; C</td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>Zellstimulationscocktail (500x) (Phorbol 12-Myristat-13-acetat (PMA) und Ionomycin)</td><td>eBioscience</td><td>00-4970-03</td><td>1x Endkonzentration PMA 0,081 &mu; M, Ionomycin 1,34 &mu; M</td></tr><tr><td>Clay Adams Autoclip Applier</td><td>VetTech Solutions</td><td>IN015B</td><td></td></tr><tr><td>Clay Adams Autoclip Entferner</td><td>VetTech Solutions</td><td>IN015B</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase Typ V aus Clostridium histolyticum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9263</td><td>2 mg/mL im Medium</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650-100mL</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Hohe Glukose (4,5 g/L) mit L-Glutamin</td><td>PAA</td><td>E15-810</td><td></td></tr><tr><td>DNase (Desoxyribonuklease I aus der bovinen Bauchspeicheldrüse Typ II-S) Stamm 10 mg/ml in 0,15 M NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4513</td><td>Endkonzentration in Aufschlussmedien 0,025 mg/ml</td></tr><tr><td>Fixierbarer Viabilitätsfarbstoff 506 (FVD506)</td><td>eBioscience</td><td>65-0866</td><td>Anwendung bei 1:200 in PBS</td></tr><tr><td>Fötales Kälberserum (FCS)</td><td>GE Healthcare</td><td>A15-104</td><td>10% in RPMI</td></tr><tr><td>Hamilton Spritze 700 Serie, 25 &mu; L Volumen, 22s Gauge Nadel mit schräger Spitze</td><td>Fisher Scientific</td><td>10100332</td><td></td></tr><tr><td>Intrazellulärer Fixierungspuffer und Intrazellulärer Permeabilisierungspuffer</td><td>eBioscience</td><td>88-8824-00</td><td>Verdünnter Permeabilisierungspuffer auf 1x in H2O</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>PAA</td><td>15140122</td><td>100 Einheiten/ml Penicillin, 100 &mu; g/mL Streptomycin</td></tr><tr><td>Proteintransport-Inhibitor-Cocktail (500x) (Brefeldin A und Monesin)</td><td>eBioscience</td><td>00-4980-03</td><td>1x Endkonzentration Brefeldin A 10,6 &mu; M, Monensin 2 &mu; M</td></tr><tr><td>RPMI-1640 (enthält 0,3 g/l Glutamin)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische Skalpellklinge Nr. 10</td><td>Swann-Morton</td><td>0501</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA-Lösung 10x</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>594-18C</td><td>Trypsin (0,1 %) EDTA (0,4 %) Endkonzentration</td></tr><tr><td>96-Mikrotiterplatte mit U-Boden</td><td>VWR</td><td>734-2080</td><td></td></tr><tr><td>Universal-Applikatoren mit Wattespitze - 6 Zoll x 100</td><td>Medisave</td><td>UN982</td><td></td></tr><tr><td>96 Mikrotiterplatte mit V-Boden</td><td>VWR</td><td>735-0184</td><td></td></tr></tbody></table>

generierung von orthotopischen pankreastumoren und ex-vivo-charakterisierung der tumorinfiltrierenden t-zell-zytotoxizität

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

In-vivo-Modelle von Bauchspeicheldrüsenkrebs bieten unschätzbare Werkzeuge zur Untersuchung von Krankheitsdynamik, Immuninfiltration und neuen therapeutischen Strategien. Das orthotopische Murinmodell kann gleichzeitig an großen Kohorten immunkompetenter Mäuse durchgeführt werden, ist relativ kostengünstig und bewahrt die Mikroumgebung des Kognaatgewebes. Die Quantifizierung von T-Zell-Infiltration und zytotoxischer Aktivität bei orthotopen Tumoren liefert einen nützlichen Indikator für eine antitumorale Reaktion.
Dieses Protokoll beschreibt die Methodik für die chirurgische Erzeugung von orthotopischen Bauchspeicheldrüsentumoren durch Injektion einer geringen Anzahl syngenischer Tumorzellen, die in einer 5-L-Kellermembran direkt in die Bauchspeicheldrüse resuspendiert werden. Mäuse, die orthotopische Tumoren tragen, brauchen etwa 30 Tage, um den Endpunkt zu erreichen, an dem Tumoren geerntet und verarbeitet werden können, um die tumorinfiltrierende T-Zellaktivität zu charakterisieren. Die schnelle enzymatische Verdauung mit Kollagenase und DNase ermöglicht die Extraktion einer einzelzelligen Suspension aus Tumoren. Die Lebensfähigkeit und Zelloberflächenmarker von Immunzellen, die aus dem Tumor extrahiert werden, bleiben erhalten; Daher ist es für mehrere nachgeschaltete Anwendungen geeignet, einschließlich der durchflussunterstützten Zellsortierung von Immunzellen für die Kultur- oder RNA-Extraktion, die Durchflusszytometrie-Analyse von Immunzellpopulationen. Hier beschreiben wir die Ex-vivo-Stimulation von T-Zellpopulationen zur intrazellulären Zytokinquantifizierung (IFN und TNF) und Degranulationsaktivität (CD107a) als Maß für die Gesamtzytotoxizität. Ganztumor-Digests wurden mit Phorbol-Myristateacetat und Ionomycin für 5 h in Gegenwart von Anti-CD107a-Antikörper n. Chr. stimuliert, um die Zytokinproduktion und Degranulation zu regulieren. Die Zugabe von Brefeldin A und Monensin für die letzten 4 h wurde durchgeführt, um den extrazellulären Transport zu blockieren und die Zytokindetektion zu maximieren. Die extra- und intrazelluläre Färbung von Zellen wurde dann für die Durchflusszytometrieanalyse durchgeführt, bei der der Anteil der IFN-Zellen+, TNF+ und CD107a+ CD4+ und CD8+ T quantifiziert wurde.
Diese Methode bietet eine Ausgangsbasis für eine umfassende Analyse der Tumormikroumgebung.

Nach der Injektion von 1000 TB32048 Zellen in die Bauchspeicheldrüse, orthotopische Tumoren brauchen etwa 30 Tage, um zu entwickeln (Abbildung 1A,B). Kellermembranlecks während der Operation können dazu führen, dass sich große Tumore direkt an der Peritonealwand bilden, die durch die Haut deutlich sichtbar sind (Abbildung 1C). Wir würden diese Mäuse aus der Studie entfernen. Bei guten chirurgischen Fähigkeiten wird die Inzidenz von Leckagen jedoch minimiert. Orthotopische Tumoren, die am Endpunkt geerntet werden, können bei C57BL/6 Wildtypmäusen zu einer beträchtlichen Größe heranwachsen(Abbildung 1D). Geerntete orthotopische Tumoren erfordern eine Verdauung in Kollagenase/ DNase für 20 min, um eine einzellige Suspension zu erreichen (Abbildung 2). An dieser Stelle können tumorabgeleitete Zellen in einer U-Boden-Platte bei 2 x 106 Zellen/Well plattiert werden. Die Anzahl der plattierten Zellen kann in Abhängigkeit von der Prävalenz der T-Zellen innerhalb der Probe verändert werden; Die Zellzahl kann verringert werden, wenn T-Zellen eine hohe Dichte aufweisen. Kontrollmilz- oder Lymphknotenproben können an dieser Stelle auch zur Stimulation plattiert werden. Jeder Brunnen wird mit PMA und Ionomycin für 5 h stimuliert und nach 1 h Inkubation werden Brefeldin A und Monensin hinzugefügt, um die extrazelluläre Freisetzung von Zytokinen zu blockieren (Abbildung 2). Nach der Inkubation werden Proben für extrazelluläre Epitope und intrazelluläre Zytokine zur Analyse mittels Durchflusszytometrie gefärbt (Abbildung 2).
Proben von Milz und Tumoren von Mäusen mit orthotopischen Tumoren wurden mittels Durchflusszytometrie analysiert. Die in der Strömungszytometrie-Analyse für die Milz- und orthotopische Tumoren verwendete Gating-Strategie schließt Ablagerungen mit FSC-A, SSC-A, Doublets von FSC-A/FSC-H und SSC-A/SSC-W, dann tote oder apoptotische Zellen als positiv für fixierbare Lebensfähigkeitsfarbstoffe aus (Abbildung 3A). Immunzellen werden dann als CD45+und T-Zellen weiter als CD3+ abgegrenzt, von denen CD4+ und CD8+ Teilmengen definiert sind (Abbildung 3A). Zur Bestimmung der Hintergrundfluoreszenz für gating wird eine Fluoreszenz minus eins (FMO) durchgeführt, und es wird eine reine Brefeldin-A/Monensin-Kontrolle durchgeführt, um die Basalproduktion von Zytokinen zu bestimmen (Abbildung 3B-D).
Für IFN führte die Inkubation mit Brefeldin A/ Monensin zu keiner Zunahme von IFN über die FMO-Kontrolle sowohl in Milz- als auch in Tumorproben. Die Zugabe von PMA und Ionomycin erhöhte jedoch den % der intrazellulären IFN-Detektion in Milz- und Tumor-abgeleiteten CD4+- und CD8+ T-Zellen.
Splenic CD4+ und CD8+ T-Zellen, die als Positivkontrolle verwendet werden, haben eine relativ höhere IFN-Produktion als tumorinfiltrierende T-Zell-Teilmengen, mit einem Durchschnitt von 6,60 x 1,5 % und 12,97 % bei 3,4 % im Vergleich zu 4,81 % bei 1,0 % und 4,13 % bei 1,3 %, was darauf hindeutet, dass eine Immunsuppression innerhalb des Tumors auftritt(Abbildung 3B und 4A). Mit der gleichen Strategie für TNF haben wir visualisiert, dass ein hoher Anteil an Milz-CD4+ T-Zellen für intrazelluläre TNF -(65,93 x 2,3%) positiv ist, verglichen mit tumorinfiltrierenden CD4+ T-Zellen (22,45 x 5,4%). Splenic und tumorinfiltrierende CD8+ T-Zellen erzeugen ähnliche TNF-Werte (25,15 % bis 3,7 % bzw. 19,91 % bzw. 5,1 %) (Abbildung 3C, Abbildung 4B).
Schließlich ist CD107a ein endosomaler Marker, der während der Exozytose von zytotoxischen Granulaten und Zytokinen vorübergehend auf der Zelloberfläche exprimiert wird, als solches wird er als Ersatzmarker für Zytotoxizität verwendet. Der Vorteil der Färbung für CD107a während der Stimulation besteht darin, dass alle vorübergehend zelloberflächenausgedrückten CD107a vom Fluoreszenz-Antikörper erfasst werden. Die Basalwerte von CD107a werden in Brefeldin A/Monensin nur behandelten Zellen gezeigt. Bei Milz-CD8+ T-Zellen erhöht die Stimulation mit PMA/Ionomycin den nachgewiesenen CD107a-Spiegel, wobei die stärkste Aufregulationinregulation in CD8+ Zellen, die 23,95 x 3,5 % CD107a+waren, im Vergleich zu 5,8 x 1,9 % bei tumorinfiltrierenden CD8+ Zellen, was auf eine größere Degranulationsrate hindeutet. Auf der anderen Seite, Splenic und Tumor-infiltrierende CD4+ ausgedrückt vergleichbare Niveaus von CD107a 9,37 - 1,5 % und 11,50 x 1,8 % (Abbildung 3D und 4C).
Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, dass orthotopische Tumoren aus der Injektion einer sehr geringen Anzahl (1.000) Tumorzellen in die Bauchspeicheldrüse erzeugt werden können. Diese Tumoren können schnell für die Isolierung von T-Zellen zur Ex-vivo-Stimulation verdaut werden. Der Nachweis von intrazellulären Zytokinen ist möglich und hebt den Basalgehalt der Immunsuppression infiltrierender T-Zellen hervor, verglichen mit T-Zellen in sekundären Lymphorganen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60622/60622fig01.jpg"> Abbildung 1: Erzeugung orthotopischer Bauchspeicheldrüsentumoren. (A) Zeitplan der In-vivo-Experimente. (B) Das makroskopische Auftreten von orthotopischen Tumoren in der Bauchhöhle (links) und nach der Exzision (rechts), bei der der gezeigte Tumor halbiert wurde. (C) Hinweise auf Kellermembranlecks während der Operation können tumoren verursachen, die durch die Haut sichtbar sind (oberes Foto) und sich an der Peritonealwand bilden (unteres Foto). (D) Orthotopische Bauchspeicheldrüsentumorgewichte, die von Mäusen geerntet wurden, die einen Endpunkt erreicht hatten (n=22). Jeder Datenpunkt stellt eine einzelne Maus dar, Balkendiagramm zeigt den Mittelwert sem. Die Daten in dieser Abbildung wurden aus der zuvor veröffentlichten Arbeit10geändert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60622/60622fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60622/60622fig02.jpg"> Abbildung 2: Schematic der Verarbeitung von orthotopischen Tumoren zur Ex-vivo-T-Zellstimulation. Nach der Ernte werden Bauchspeicheldrüsentumoren in Kollagennase (2 mg/ml) und DNase (0,025 mg/ml) 20 min bei 37 °C schnell verdaut. Anschließend werden die Zellen bei 2 x 106/ml in kompletten RPMI-Medien resuspendiert und in einer U-Bodenplatte plattiert. Ein Stimulationscocktail aus PMA und Ionomycin wird für 5 h hinzugefügt, an dem punktgleich auch der Anti-Maus-CD107a-Antikörper in die Kultur aufgenommen werden kann. Nach 1 h Inkubation werden die intrazellulären Transportblocker, Brefeldin A und Monensin, hinzugefügt. Nach ex vivo Stimulation werden die Zellen für 20 min 4 °C in eine V-Bodenplatte zur Färbung mit dem fixierbaren Lebensfähigkeitsfarbstoff (in PBS) übertragen. Die Zellen werden im FACS-Puffer gewaschen und in Anti-CD16/32 (FcR-Block) für 15 min (im FACS-Puffer) inkubiert und dann mit extrazellulärfluoreszierend konjugierten Antikörpern für weitere 30 min (im FACS-Puffer) inkubiert. Die Zellen werden im FACS-Puffer wieder gewaschen und im intrazellulären Fixationspuffer für 20 min wieder ausgesetzt. Danach werden Zellen einmal im FACS-Puffer und einmal im 1x Permeabilisierungspuffer gewaschen. Zellen werden bei RT für 1 h in intrazellulär-fluoreszierend konjugierten Antikörpern für 1 h (in 1x Permeabilisationspuffer) resuspendiert. Zellen werden einmal im 1x Permeabilisationspuffer und einmal im FACS-Puffer gewaschen, bevor sie im FACS-Puffer zur Erfassung auf dem Durchflusszytometer innerhalb von 24 h wieder <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60622/60622fig02large.jpg" target="_blank">aufhängen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60622/60622fig3.jpg"> Abbildung 3: Durchflusszytometrieanalyse von ex vivo stimulierten Milz- und tumorabgeleiteten T-Zellen. (A) Flow Zytometrie-Gating-Strategie für Milz (Positive Kontrolle) und orthotopische Tumorproben verwendet. Zellen werden mit FSC-A/SSC-A von Ablagerungen diskriminiert und einzelne Zellen werden mit FSC-A/FSC-H und SSC-A/SSC-W weiter isoliert. Tote oder apoptotische Zellen werden mit dem fixierbaren Lebensfähigkeitsfarbstoff -FVD506 ausgeschlossen und Immunzellen werden mit CD45+abgezäut. Im Anschluss daran werden CD3+ T-Zellen und CD4+ und CD8+ Teilmengen definiert. Die Daten wurden auf einer BD Fortessa erfasst. (B) Die Gating-Strategie zur Quantifizierung von IFN-Zellen+ CD4+ und CD8+ T. Eine fluoreszierende Minus-Eins-Steuerung (FMO) wird bei vollständig stimulierten Proben (PMA/ionomycin/brefeldin A/monensin) verwendet, um die Hintergrundfluoreszenz zu bestimmen. Zur Bestimmung der Basalzytokinproduktion wird eine brefeldin A/monensin only control (nur B+M) verwendet. Die vollständig stimulierte Probe wird dann verwendet, um die % IFN- + T-Zellen zu berechnen. (C) Die Gating-Strategie zur Quantifizierung von TNF-+ CD4+ und CD8+ T-Zellen. Eine FMO-Kontrolle wird an vollständig stimulierten Proben (PMA/ionomycin/brefeldin A/monensin) verwendet, um die Hintergrundfluoreszenz zu bestimmen. Zur Bestimmung der Basalzytokinproduktion wird eine brefeldin A/monensin only control (nur B+M) verwendet. Die vollständig stimulierte Probe wird dann verwendet, um die % TNF+ T-Zellen zu berechnen. (D) Die Gating-Strategie zur Definition von CD107a+ CD4+ und CD8+ T-Zellen. Eine FMO-Kontrolle wird an vollständig stimulierten Proben (PMA/ionomycin/brefeldin A/monensin) verwendet, um die Hintergrundfluoreszenz zu bestimmen. Zur Bestimmung der Basaldegranulation wird eine Brefeldin-A/Monensin-Kontrolle (nur B+M) verwendet. Die vollständig stimulierte Probe wird dann verwendet, um die % CD107a+ T-Zellen zu berechnen. Alle Flow-Zytometrie-Daten wurden auf FlowJo Version 10.6.1 analysiert. Die Daten in dieser Abbildung wurden aus der zuvor veröffentlichten Arbeit10geändert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60622/60622fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60622/60622fig04.jpg"> Abbildung 4: Quantifizierung der Ex-vivo-Milz- und Tumor-abgeleiteten T-Zellaktivität. Der Anteil der CD4+ und CD8+ T-Zellen positiv für (A) IFN- (B) TNF-+ und (C) CD107a+ wurde in der Milz (n=4) und Tumor (n=7) von orthotopisch-tumortragenden Mäusen quantifiziert. Jeder Datenpunkt stellt einen individuellen Maus- und Fehlerbalken-Anzeigemittelwert - SEM dar. Statistische Signifikanz wurde mit einem ungepaarten t-Test getestet, wobei * = p&lt;0.05 und *** = p&lt;0.001. Alle Daten wurden mit Prism 8 analysiert. Die Daten in dieser Abbildung wurden aus der zuvor veröffentlichten Arbeit10geändert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60622/60622fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

Dieses Protokoll beschreibt die chirurgische Entstehung von orthotopischen Bauchspeicheldrüsentumoren und die schnelle Verdauung von frisch isolierten murinen Bauchspeicheldrüsentumoren. Nach der Verdauung können lebensfähige Immunzellpopulationen für weitere nachgelagerte Analysen verwendet werden, einschließlich der Ex-vivo-Stimulation von T-Zellen zur intrazellulären Zytokindetektion durch Durchflusszytometrie.

Generierung von orthotopischen Pankreastumoren und Ex-vivo-Charakterisierung der tumorinfiltrierenden T-Zell-Zytotoxizität

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

Diese Methode kann verwendet werden, um zu befragen, wie neuartige therapeutische Wirkstoffe oder Strategien die zytotoxische T-Zell-Reaktion bei Bauchspeicheldrüsenkrebs beeinflussen oder erweitern. Diese Technik ermöglicht eine schnelle Verdauung und Stimulation von Tumoren in vitro, wodurch mehrere Parameter der T-Zell-Reaktion gleichzeitig analysiert werden können, die leicht für andere Anwendungen angepasst werden können. Um zu beginnen, verwenden Sie Zange, übertragen Sie den Tumor auf eine Petrischale.Fünf Milliliter Verdauungsmedium in einer 50-Milliliter-Röhre auf Eis aufbewahren, um Enzymaktivität zu verhindern. Nehmen Sie ein kleines Aliquot dieser Lösung, um den Tumor auf der Petrischale zu bedecken. Verwenden Sie ein steriles Skalpell und Zangen, um den Tumor in kleine Stücke zu schneiden, etwa weniger als drei Millimeter lang.Die Tumorstücke in die Röhre kratzen und das Rohr vorsichtig umkehren, bis alle Teile in Verdauungsmedien getaucht sind. Übertragen Sie die Röhre für 20 Minuten bei 37 Grad Celsius auf ein Schüttelgerät, um sie zu verdauen. Stellen Sie sicher, dass alle Tumorstücke untergetaucht sind und nicht am Rand des Rohres kleben.Unmittelbar nach dem Verdauungsschritt die Röhre auf Eis legen, um die Enzymaktivität zu verlangsamen. Fügen Sie EDTA hinzu, um eine Endkonzentration von 20 Millimolaren zu erreichen, und wirbeln Sie die Zumischung der Probe kurz, um die Enzymaktivität weiter zu verlangsamen. Öffnen Sie das Rohr und spülen Sie jeden Tumor digest aus dem Deckel des Rohres mit frischem RPMI Medium.Dann bereiten Sie ein 70 Mikron Sieb, legen Sie es auf einem 50 Milliliter offenen Rohr auf Eis. Den Filter mit Medium vorbefeuchten. Setzen Sie die verdauten Zellen wieder auf und waschen Sie die Seiten des Rohres mit einem 25 Milliliter oder einer größeren Stripette.Die breitere Öffnung der Stripette lässt den dicken Digest leicht passieren. Übertragen Sie den gesamten Digest mit der 25 Milliliter Stripette auf das Sieb. Den Tumor auf dem Filter mit einem Ein-Milliliter-Spritzenkolben nach oben und unten mischen.Waschen Sie Zellen kontinuierlich durch das Sieb mit RPMI. Achten Sie darauf, mit genügend Kraft zu waschen, um die Zellen durch zu schieben. Waschen Sie weiter, bis alle Zellen durch das Sieb gegangen sind.Zentrifugieren Sie das Rohr für fünf Minuten bei 300 mal G und vier Grad Celsius. Setzen Sie das Zellpellet vorsichtig wieder aus, und schließen Sie RPMI ab, und passieren Sie direkt einen anderen Filter, um extrazelluläre Matrix oder große Zellklumpen zu entfernen, die nicht ausreichend resuspendiert werden können. Wenn keine Stimulation erforderlich ist, färben Sie die isolierten Zellen sofort für die Durchflusszytometrieanalyse, oder setzen Sie sie im Gefriermedium von 10% DMSO und FBS wieder auf und lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius.Um die Stimulation durchzuführen, zählen Sie zuerst die Zellen. Verdünnen Sie die Zellen in vollständigem Medium, um eine Konzentration von zwei mal zehn bis sechs pro 100 Mikroliter zu erreichen. Platte 100 Mikroliter Zellen in jedem Brunnen einer U-Boden 96 Well Platte.Fügen Sie 100 Mikroliter des kompletten Mediums hinzu, das eine 2-fache Zubereitung von PMA und Ionomycin enthält. Legen Sie die Platte in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius, aber 5% Kohlendioxid für eine Stunde. Dann, bei 20 Mikroliter einer 10X Vorbereitung von Brefeldin A, und Monensin, und komplette Medien, um eine endgültige Konzentration von 1,06 Mikromolar zu erreichen, bzw. 2,0 Mikromolar.Legen Sie die Platte für weitere vier Stunden wieder in den Inkubator. Nach der Injektion von 1000 TB32048 Zellen in die Bauchspeicheldrüse, orthotopische Tumoren dauern etwa 30 Tage, um sich zu entwickeln. Nach der Verdauung und Stimulation der geernteten orthotopischen Tumoren wurde eine Fluoreszenz minus eins durchgeführt, um die Hintergrundfluoreszenz für das Gating zu bestimmen.Und Brefeldin A Monensin nur Kontrolle wurde durchgeführt, um die basale Produktion von Zytokinen zu bestimmen. Für Die Interferon-Gamma-Inkubation mit Brefeldin A und Monensin führte zu keiner Zunahme des Interferon-Gammas gegenüber der FMO-Kontrolle, sowohl in Milz- als auch in Tumorproben. Jedoch, die Zugabe von PMA und Ionomycin, erhöhte den Prozentsatz der intrazellulären Interferon Gamma nachweisbar in Milz und Tumor-abgeleiteten CD4-positive und CD8-positive T-Zellen.Splenic CD4 positive und CD8 positive T-Zellen, die als Positivkontrolle verwendet werden, haben eine relativ höhere Interferon-Gamma-Produktion als tumorinfiltrierende T-Zell-Teilmengen. Die Anzeige der Immunsuppression tritt innerhalb des Tumors auf. Mit der gleichen Strategie für TNF alpha, ein hoher Prozentsatz der Milz CD4 positive T-Zellen waren positiv für intrazelluläre TNF alpha.Im Vergleich zu tumorinfiltrierenden CD4-positiven T-Zellen. Splenic und Tumor-infiltrierende CD8-positive T-Zellen produzierten ähnliche Mengen an TNF-Alpha. Stellen Sie sicher, dass der Tumor ausreichend gehackt ist und dass alle Teile in Verdauungsmedien getaucht sind.Achten Sie beim Maischen des Tumors darauf, sanft zu sein, und waschen Sie die Zellen gründlich durch. Das Tumorverdauungsprotokoll kann mit einer strömungsunterstützten Zellsortierung kombiniert werden, um einzelne Immunzellteilmengen für zusätzliche, funktionelle oder Genexpressionsanalysen zu reinigen. Wir haben diese Methode verwendet, um zu charakterisieren, wie B-Zellen die Immunantwort bei Bauchspeicheldrüsenkrebs formen und orthotopische Tumoren sowohl in B-Zell-Knockout als auch bei B-Zell-depleted Mäusen erzeugen.

generation-orthotopic-pancreatic-tumors-ex-vivo-characterization

Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

Dieser Artikel beschreibt die Technik zur ex vivo T-Zell-Stimulation, um die intrazelluläre Konzentration von Zytokinen wie Interferon-gamma oder IFN-gamma und Tumornekrosefaktor-alpha oder TNF-alpha in der T-Zelle zu erhöhen. Diese Zytokine vermitteln eine wirksame Anti-Tumor-Antwort und können eine therapeutische Rolle im Tumor spielen.

ex vivo T-Zell-Stimulation im Pankreastumor: Eine Methode zur Steigerung der Zytokinproduktion in T-Zellen

Das Video erklärt eine schrittweise chirurgische Methode zur orthotopen Implantation eines Tumorfragments von einem krebsartigen Spender in die Bauchspeicheldrüse einer nicht krebsartigen Empfängermäuse zur Entwicklung von Bauchspeicheldrüsenkrebs. Orthotopisch implantiertes PDAC könnte die Gewebemikroumgebung von menschlichem Bauchspeicheldrüsenkrebs genauer erfassen als herkömmliche subkutane (SC) Modelle.

Orthotope homotransplantierte Tumortransplantation: Eine Technik zur Generierung von Mausmodellen für Pankreastumoren

Verbessertes Verständnis von Bauchspeicheldrüsenkrebs Biologie ist dringend erforderlich, um die Entwicklung von besseren therapeutischen Optionen zur Behandlung von Bauchspeicheldrüsenkrebs zu ermöglichen. Um diesen Bedarf zu demonstrieren wir eine orthotopic Modell von Bauchspeicheldrüsenkrebs, die nicht-invasive Überwachung der Tumorprogression ermöglicht...

Bioluminescent orthotopen Modell von Bauchspeicheldrüsenkrebs Progression

Die Versuchsdurchführung auf die Immunphänotypisierung der murinen orthotopen PDAC Homografts bezweckt die Profilierung der Tumor Immuno-Mikroumgebung. Tumoren sind Orthotopically über Operation implantiert. Tumoren von 200 – 600 mm3 in der Größe wurden geerntet und distanzierte um einzellige Suspensionen, gefolgt von Multi-immun FACS Markeranalyse mit verschiedenen fluoreszent-markierten Antikörpern vorzubereiten.

Die Immunphänotypisierung der Orthotopen Homograft (Phänomen) der murinen primäre KPC duktales Pankreaskarzinom durch Durchflusszytometrie

Wir beschreiben ein Protokoll für die ultraschallgeführte Implantation von murinabgeleiteten duktodrischen Adenokarzinom-Zelllinien direkt in die native Tumorstelle. Dieser Ansatz führte zu Pankreastumoren, die durch Ultraschall-Scanning innerhalb von 2-4 Wochen nach der Injektion nachweisbar waren, und reduzierte den Anteil der Tumorzellsaatierung an der Peritonealwand im Vergleich zur chirurgischen orthotopischen Implantation signifikant.

Ultraschallgeführte orthotopische Implantation von murine Pankreas-Ductalsocarcinom

Im klinischen Kontext werden Patienten mit lokalisierten Bauchspeicheldrüsenkrebs einer Pankreastektomie unterzogen, gefolgt von einer adjuvanten Behandlung. Dieses hier berichtete Protokoll zielt darauf ab, eine sichere und effektive Methode zur Modellierung dieses klinischen Szenarios bei nackten Mäusen durch orthotopische Implantation von Bauchspeicheldrüsenkrebs zu etablieren, gefolgt von distaler Pankreatektomie und Splenektomie.

Ein orthotopisches Resektions-Mausmodell für Bauchspeicheldrüsenkrebs

Hier stellen wir ein Tumortransplantationsprotokoll zur Charakterisierung von tumorinhärenten und peripherieabgeleiteten tumorinfiltrierten Lymphozyten in einem Maustumormodell vor. Die spezifische Verfolgung des Zustroms von Empfänger-abgeleiteten Immunzellen mit Durchflusszytometrie zeigt die Dynamik der phänotypischen und funktionellen Veränderungen dieser Zellen während der Antitumor-Immunantwort.

Tumortransplantation zur Beurteilung der Dynamik tumorinfiltrierender CD8+ T-Zellen in Mäusen

Dieses Protokoll beschreibt die Aufbereitung von organotypischen Schnittkulturen (OTSCs). Diese Technik ermöglicht die ex vivo-Kultivierung von intaktem mehrzelligem Gewebe. OTSCs können sofort eingesetzt werden, um ihr jeweiliges Ansprechen auf Medikamente in einer multizellulären Umgebung zu testen.

Organotypische Schnittkulturen als präklinische Modelle der Tumormikroumgebung bei primärem Pankreaskarzinom und Metastasierung

Wir präsentieren ein Protokoll zur Erstellung eines minimalinvasiven orthotopen Bauchspeicheldrüsenkrebsmodells durch ultraschallgesteuerte Injektion menschlicher Bauchspeicheldrüsenkrebszellen und die anschließende Überwachung des Tumorwachstums in vivo durch Ultraschallbildgebung.

Generierung eines orthotopen Xenografts von Bauchspeicheldrüsenkrebszellen durch ultraschallgeführte Injektion

Syngene orthotope Allotransplantate der Maus des duktalen Adenokarzinoms der Bauchspeicheldrüse (PDAC) rekapitulieren die Biologie, die Phänotypen und das therapeutische Ansprechen von Krankheitssubtypen. Aufgrund ihrer schnellen, reproduzierbaren Tumorprogression sind sie in präklinischen Studien weit verbreitet. In dieser Arbeit zeigen wir gängige Praktiken zur Generierung dieser Modelle, indem wir syngene murine PDAC-Kulturen in die Bauchspeicheldrüse injizieren.

Syngene orthotope Allotransplantate der Maus zur Modellierung von Bauchspeicheldrüsenkrebs

Wir beschreiben eine Methode, um tumorinfiltrierende Lymphozyten (TILs) von Mäusen mittels Durchflusszytometrie für den adoptiven Zelltransfer zu nutzen. Dieses Protokoll zielt darauf ab, die spezifische Zytotoxizität von TILs gegen Tumore in einem syngenen Pankreaskarzinom-Mausmodell zu verifizieren und Einblicke in die Entwicklung adoptiver Zelltherapien für Bauchspeicheldrüsenkrebs zu geben.

Durchflusszytometrie-basierte Isolierung und therapeutische Bewertung von tumorinfiltrierenden Lymphozyten in einem Mausmodell für Bauchspeicheldrüsenkrebs

Lernen Sie die chirurgische Erzeugung orthotoper Pankreastumoren und die Ex-vivo-Stimulation tumorinfiltrierender T-Zellen zur Analyse der Zytotoxizität mittels Durchflusszytometrie. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung immuntherapeutischer Strategien.

Generierung von orthotopischen Pankreastumoren und Ex-vivo-Charakterisierung der tumorinfiltrierenden T-Zell-Zytotoxizität

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