Generierung von orthotopischen Pankreastumoren und Ex-vivo-Charakterisierung der tumorinfiltrierenden T-Zell-Zytotoxizität

Dieses Protokoll beschreibt die chirurgische Entstehung von orthotopischen Bauchspeicheldrüsentumoren und die schnelle Verdauung von frisch isolierten murinen Bauchspeicheldrüsentumoren. Nach der Verdauung können lebensfähige Immunzellpopulationen für weitere nachgelagerte Analysen verwendet werden, einschließlich der Ex-vivo-Stimulation von T-Zellen zur intrazellulären Zytokindetektion durch Durchflusszytometrie.

Diese Methode kann verwendet werden, um zu befragen, wie neuartige therapeutische Wirkstoffe oder Strategien die zytotoxische T-Zell-Reaktion bei Bauchspeicheldrüsenkrebs beeinflussen oder erweitern. Diese Technik ermöglicht eine schnelle Verdauung und Stimulation von Tumoren in vitro, wodurch mehrere Parameter der T-Zell-Reaktion gleichzeitig analysiert werden können, die leicht für andere Anwendungen angepasst werden können. Um zu beginnen, verwenden Sie Zange, übertragen Sie den Tumor auf eine Petrischale.

Fünf Milliliter Verdauungsmedium in einer 50-Milliliter-Röhre auf Eis aufbewahren, um Enzymaktivität zu verhindern. Nehmen Sie ein kleines Aliquot dieser Lösung, um den Tumor auf der Petrischale zu bedecken. Verwenden Sie ein steriles Skalpell und Zangen, um den Tumor in kleine Stücke zu schneiden, etwa weniger als drei Millimeter lang.

Die Tumorstücke in die Röhre kratzen und das Rohr vorsichtig umkehren, bis alle Teile in Verdauungsmedien getaucht sind. Übertragen Sie die Röhre für 20 Minuten bei 37 Grad Celsius auf ein Schüttelgerät, um sie zu verdauen. Stellen Sie sicher, dass alle Tumorstücke untergetaucht sind und nicht am Rand des Rohres kleben.

Unmittelbar nach dem Verdauungsschritt die Röhre auf Eis legen, um die Enzymaktivität zu verlangsamen. Fügen Sie EDTA hinzu, um eine Endkonzentration von 20 Millimolaren zu erreichen, und wirbeln Sie die Zumischung der Probe kurz, um die Enzymaktivität weiter zu verlangsamen. Öffnen Sie das Rohr und spülen Sie jeden Tumor digest aus dem Deckel des Rohres mit frischem RPMI Medium.

Dann bereiten Sie ein 70 Mikron Sieb, legen Sie es auf einem 50 Milliliter offenen Rohr auf Eis. Den Filter mit Medium vorbefeuchten. Setzen Sie die verdauten Zellen wieder auf und waschen Sie die Seiten des Rohres mit einem 25 Milliliter oder einer größeren Stripette.

Die breitere Öffnung der Stripette lässt den dicken Digest leicht passieren. Übertragen Sie den gesamten Digest mit der 25 Milliliter Stripette auf das Sieb. Den Tumor auf dem Filter mit einem Ein-Milliliter-Spritzenkolben nach oben und unten mischen.

Waschen Sie Zellen kontinuierlich durch das Sieb mit RPMI. Achten Sie darauf, mit genügend Kraft zu waschen, um die Zellen durch zu schieben. Waschen Sie weiter, bis alle Zellen durch das Sieb gegangen sind.

Zentrifugieren Sie das Rohr für fünf Minuten bei 300 mal G und vier Grad Celsius. Setzen Sie das Zellpellet vorsichtig wieder aus, und schließen Sie RPMI ab, und passieren Sie direkt einen anderen Filter, um extrazelluläre Matrix oder große Zellklumpen zu entfernen, die nicht ausreichend resuspendiert werden können. Wenn keine Stimulation erforderlich ist, färben Sie die isolierten Zellen sofort für die Durchflusszytometrieanalyse, oder setzen Sie sie im Gefriermedium von 10% DMSO und FBS wieder auf und lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius.

Um die Stimulation durchzuführen, zählen Sie zuerst die Zellen. Verdünnen Sie die Zellen in vollständigem Medium, um eine Konzentration von zwei mal zehn bis sechs pro 100 Mikroliter zu erreichen. Platte 100 Mikroliter Zellen in jedem Brunnen einer U-Boden 96 Well Platte.

Fügen Sie 100 Mikroliter des kompletten Mediums hinzu, das eine 2-fache Zubereitung von PMA und Ionomycin enthält. Legen Sie die Platte in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius, aber 5% Kohlendioxid für eine Stunde. Dann, bei 20 Mikroliter einer 10X Vorbereitung von Brefeldin A, und Monensin, und komplette Medien, um eine endgültige Konzentration von 1,06 Mikromolar zu erreichen, bzw. 2,0 Mikromolar.

Legen Sie die Platte für weitere vier Stunden wieder in den Inkubator. Nach der Injektion von 1000 TB32048 Zellen in die Bauchspeicheldrüse, orthotopische Tumoren dauern etwa 30 Tage, um sich zu entwickeln. Nach der Verdauung und Stimulation der geernteten orthotopischen Tumoren wurde eine Fluoreszenz minus eins durchgeführt, um die Hintergrundfluoreszenz für das Gating zu bestimmen.

Und Brefeldin A Monensin nur Kontrolle wurde durchgeführt, um die basale Produktion von Zytokinen zu bestimmen. Für Die Interferon-Gamma-Inkubation mit Brefeldin A und Monensin führte zu keiner Zunahme des Interferon-Gammas gegenüber der FMO-Kontrolle, sowohl in Milz- als auch in Tumorproben. Jedoch, die Zugabe von PMA und Ionomycin, erhöhte den Prozentsatz der intrazellulären Interferon Gamma nachweisbar in Milz und Tumor-abgeleiteten CD4-positive und CD8-positive T-Zellen.

Splenic CD4 positive und CD8 positive T-Zellen, die als Positivkontrolle verwendet werden, haben eine relativ höhere Interferon-Gamma-Produktion als tumorinfiltrierende T-Zell-Teilmengen. Die Anzeige der Immunsuppression tritt innerhalb des Tumors auf. Mit der gleichen Strategie für TNF alpha, ein hoher Prozentsatz der Milz CD4 positive T-Zellen waren positiv für intrazelluläre TNF alpha.

Im Vergleich zu tumorinfiltrierenden CD4-positiven T-Zellen. Splenic und Tumor-infiltrierende CD8-positive T-Zellen produzierten ähnliche Mengen an TNF-Alpha. Stellen Sie sicher, dass der Tumor ausreichend gehackt ist und dass alle Teile in Verdauungsmedien getaucht sind.

Achten Sie beim Maischen des Tumors darauf, sanft zu sein, und waschen Sie die Zellen gründlich durch. Das Tumorverdauungsprotokoll kann mit einer strömungsunterstützten Zellsortierung kombiniert werden, um einzelne Immunzellteilmengen für zusätzliche, funktionelle oder Genexpressionsanalysen zu reinigen. Wir haben diese Methode verwendet, um zu charakterisieren, wie B-Zellen die Immunantwort bei Bauchspeicheldrüsenkrebs formen und orthotopische Tumoren sowohl in B-Zell-Knockout als auch bei B-Zell-depleted Mäusen erzeugen.