Überwachung der Protein-RNA-Interaktionsdynamik in vivo mit hoher zeitlicher Auflösung unter Verwendung von χCRAC

Kinetic CRAC kann verwendet werden, um zeitliche Assoziationen zwischen RNA und RNA-bindenden Proteinen auf einer beispiellos kurzen Zeitskala zu untersuchen. In Kombination mit unserem Vernetzer ist kinetic CRAC in der Lage, lebende Zellen innerhalb von Sekunden zu vernetzen. Dies reduziert die Reaktionen auf UV-Schäden und erleichtert die Untersuchung von Stressreaktionen mit einer Auflösung von winzigen Skalen.

Kinetic CRAC ist ein sehr langes Protokoll, das für neue Benutzer eine Herausforderung darstellen kann. Darüber hinaus bringt die Arbeit mit RNA ihre eigenen Herausforderungen mit sich. Um einen RNA-Abbau zu verhindern, sollte man alle Lösungen filtern, sterilisieren und sicherstellen, dass die Pipetten und der Labortisch sauber gehalten werden.

visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da einige der Schritte nicht sehr intuitiv sind. Dazu gehören die UV-Vernetzung und die Ernte von Zellen sowie die Extraktion von vernetzten RNAs aus dem Gel. Um eine UV-Vernetzung an Mikroorganismen in Lösung durchzuführen, inokulieren Sie 3,5 Liter des gewünschten Mediums mit Hefe auf einen Anfangs-OD 600 von 0,05 und züchten Sie die Kultur über Nacht bei 30 Grad Celsius unter ständigem Schütteln bei 180 U/min.

Sobald die Zellen den gewünschten OD erreicht haben, gießen Sie 500 Milliliter der Kultur direkt in den Vari-X-Linker-Vernetzer und bestrahlen Sie ihn mit 250 Millijoule 254 Nanometer UV. Verwenden Sie nach der Vernetzung ein Vakuumfiltrationsgerät, um die Zellen zu filtern. Rollen Sie die Membran mit den gefilterten Zellen auf und legen Sie sie in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen mit der Bezeichnung T0. Filtrieren Sie die restlichen Zellen auf sechs verschiedene Filter und geben Sie die Membranen in drei Liter vorgewärmtes stressinduzierendes Medium und mischen Sie sie 50 Sekunden lang kräftig mit einer Pipette. Setzen Sie die Vernetzung der Zellen in 500-Milliliter-Volumina zu den gewünschten Zeitpunkten fort und lagern Sie die Proben bei minus 80 Grad Celsius.

Um adhärente Zellen zu vernetzen, überführen Sie die Quarzkulturschale mit den Zellen in die spezielle Schale und bestrahlen Sie sie mit 300 Millijoule mit 254 Nanometern UV. Stellen Sie die Schüssel sofort auf Eis. Nehmen Sie das Wachstumsmedium aus der Schale und fügen Sie 10 Milliliter eiskaltes PBS hinzu. Sammeln Sie die Zellen durch Schaben und geben Sie sie in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen.

Dann pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 300 G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Nachdem Sie die Zellen mit PBS gewaschen haben, entfernen Sie das PBS und frieren Sie das Zellpellet auf Trockeneis ein. Lagern Sie die Probe bei Bedarf bei minus 80 Grad Celsius.

Stellen Sie die Zentrifuge auf vier Grad Celsius ein und bereiten Sie zwei Reihen mit 1,5-Milliliter-Röhrchen pro Probe für die Elution vor. Drehen Sie die Säulen schnell mit den Nickelperlen, um das Hohlraumvolumen zu entfernen. Platzieren Sie dann die Säulen in der ersten Reihe der Elutionsröhrchen und füllen Sie sie mit 200 Mikrolitern Elutionspuffer.

Nach zwei Minuten die Säulen schnell drehen und in die zweite Reihe der Röhren übertragen. Wiederholen Sie dann die Elution wie zuvor gezeigt. Wenn Sie fertig sind, kombinieren Sie alle Eluate in einem Fünf-Milliliter-Röhrchen und fügen Sie zwei Mikroliter mit 20 Milligramm pro Milliliter Glykogen hinzu.

Geben Sie dann 100 Mikroliter Trichloressigsäure in die Probe und wirbeln Sie sie 30 Sekunden lang ein. Nachdem Sie die Probe mit Aceton gewaschen haben, resuspendieren Sie sie in 30 Mikrolitern Proteinladepuffer. Überprüfen Sie dann die Radioaktivität mit dem Geigerzähler.

Erhitzen Sie die Probe 10 Minuten lang bei 65 Grad Celsius und laden Sie sie auf ein ein Millimeter dickes Bis-Tris-Gel mit vier bis 12 %. Lassen Sie das Gel 90 Minuten lang bei 125 Volt in MOPS-Puffer laufen. Wenn du fertig bist, wickle das Gel in Frischhaltefolie ein und befestige es mit Klebeband an der Innenseite einer lichtdichten Kassette.

Nachdem Sie das Gel dem autoradiographischen Film ausgesetzt haben, entwickeln Sie den Film, indem Sie die Frischhaltefolie, die das Gel bedeckt, wegschneiden und darauf achten, dass das Gel nicht bewegt und das Bild versetzt wird. Legen Sie die Folie über das Gel und schneiden Sie das interessierende Band heraus. Legen Sie die Gelscheibe in ein Zwei-Milliliter-Röhrchen und zerdrücken Sie sie mit einer P1000-Pipettenspitze.

Fügen Sie dann Proteinase K-Puffer und Proteinase K hinzu und inkubieren Sie die Probe bei 55 Grad Celsius unter kräftigem Schütteln. Lassen Sie die cDNA eine Stunde lang auf einem vorgefertigten 6%-TBE-Gel bei 100 Volt laufen, wobei eine geeignete Leiter für die Quantifizierung kurzer DNA-Fragmente verwendet wird. Wenn Sie fertig sind, geben Sie das Gel in einen flüssigkeitsdichten Behälter mit genügend FSME, um es zu bedecken, und fügen Sie eine angemessene Menge SYBR Safe Farbstoff hinzu.

Färben Sie das Gel 15 Minuten lang bei Raumtemperatur. Ersetzen Sie dann den SYBR-haltigen Puffer durch frische FSME. Waschen Sie das Gel 10 Minuten lang unter leichtem Schütteln.

Lassen Sie die FSME ab und legen Sie das Gel in eine durchsichtige Folie. Schneiden Sie den Ordner auf eine geeignete Größe zu und bilden Sie das Gel mit einem Bildquant ab. Schneiden Sie die DNA-Fragmente zwischen 175 und 400 Basenpaaren heraus und geben Sie das Gelstück in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen.

Zerdrücken Sie das Gel mit einer P1000-Pipettenspitze und fügen Sie 400 Mikroliter Wasser hinzu. Dann inkubieren Sie es eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius unter Schütteln. Frieren Sie die Probe 10 Minuten lang auf Trockeneis ein.

Wiederholen Sie dann die Inkubation bei 37 Grad Celsius. Setzen Sie zwei Mikrofaserfilter aus Glas in eine Filtersäule ein, die in einem Rohr platziert ist. Dann wird die FSME-Gelsuspension mit einer abgeschnittenen P1000-Pipettenspitze in die Filtereinheit überführt und 30 Sekunden lang bei 17.000 g heruntergeschleudert.

Dieses Protokoll wurde verwendet, um Nrd1-RNA-Wechselwirkungen in Hefezellen zu überwachen, die einer glukosearmen Umgebung ausgesetzt waren. Die Proben wurden vor dem Wechsel zu Medium ohne Glukose sowie ein, zwei, vier, acht, 14 und 20 Minuten danach vernetzt. Die Autoradiographen des Experiments zeigten ein intensives Signal bei dem erwarteten Molekulargewicht von Nrd1, das das Protein darstellt, das an kurze radiomarkierte RNAs gebunden ist, die nicht für die Sequenzierung geeignet sind.

Das Signal oberhalb dieser Bande, also das Protein, das mit längeren RNA-Fragmenten vernetzt ist, wurde isoliert. Um das kinetische CRAC-Protokoll für Säugetierzellen zu ergänzen, wurde eine spezielle Stufe entwickelt, die die UV-Bestrahlung von Schalen mit adhärenten Zellen ermöglicht. Die Effizienz dieses Aufbaus wurde durch Vernetzung und Einfangen von stabil markiertem GFP RBM7 gemessen.

Der Vernetzer war in der Lage, Protein-RNA-Komplexe aus Säugetierzellen mit 254-Nanometer-UV-Bestrahlung mit einer Effizienz zu gewinnen, die mit einem weit verbreiteten UV-Bestrahlungsgerät vergleichbar ist. Die Entwicklung einer UV-durchlässigen Quarz-Petrischale während der Vernetzung verbesserte die Rückgewinnung von Protein-RNA-Komplexen weiter. Nrd1-Daten zeigen, dass das Protein an viele nicht-kodierende RNA-Transkripte bindet, was darauf hindeutet, dass es am Abbau dieser Transkripte beteiligt ist.

Die Bindung an Transkripte, die für HXT6 und HXT7 kodieren, die beide während des Glukosemangels hochreguliert sind, wurde ebenfalls nachgewiesen. Kinetic CRAC ermöglicht es, die dynamischen Wechselwirkungen zwischen Protein-RNAs während der Zellentwicklung, der Stressreaktionen und des Zusammenbaus von makromolekularen Komplexen, wie dem Ribosom oder Spleißosom, zu messen.