Ein präklinisches Modell für kontrollierte kortikale Auswirkungen bei traumatischen Blutungen, Prellungen und Neuroinflammation

Intraparenchymale Blutungen und Neuroinflammation, begleitet von einer zerebralen Kontusion, können schwere sekundäre Hirnverletzungen auslösen. Dieses Protokoll beschreibt ein Modell der kontrollierten kortikalen Wirkung (CCI) der Maus, das es Forschern ermöglicht, Blutungen, Prellungen und posttraumatische Immunreaktionen zu untersuchen und potenzielle Therapeutika zu erforschen.

Dieses Modell kann verwendet werden, um die mit der zerebralen Kontusion verbundenen Pathologien zu untersuchen, einschließlich intrakranieller Blutungen, Eisentoxizität, Neuronentod, axonaler Verletzung, neurologischem Defizit und neuronaler Entzündung. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Schwere der Hirnschädigung durch Manipulation der biochemischen Parameter wie Geschwindigkeit und Tod des Aufpralls auf das CCI-Gerät leicht kontrolliert werden kann. Die CCI-induzierte fokale kortikale Shatter-Verletzung ist hochgradig reproduzierbar.

Die richtige stereotaktische Technik und das Kraniotomieverfahren sind wichtige Determinanten für die Entstehung stabiler und reproduzierbarer CCI-induzierter Hirnverletzungen. Im Allgemeinen wird der Untersucher, der neu in diesem Verfahren ist, Schwierigkeiten haben, die Maus auf dem steriotexischen Rahmen zu stabilisieren und die entsprechende Kraniotomie durchzuführen. Das Verfahren wird von Frau Jhih Shuan Lin, einer Labortechnikerin aus meinem Labor, vorgeführt.

Beginnen Sie damit, das Fehlen eines Zehenkneifreflexes beim Tier zu bestätigen, um sicherzustellen, dass es richtig betäubt ist. Rasieren Sie den Kopf der Maus mit einer elektrischen Haarschneidemaschine in kaudaler bis rostraler Richtung. Schneiden Sie die Schnurrhaare jedoch nicht ab.

Setzen Sie die Maus auf den stereotaktischen Rahmen und führen Sie die Ohrbügel vorsichtig in die Gehörgänge ein, wobei Sie darauf achten, dass der Mauskopf durch beide Ohrbügel gleichmäßig stabilisiert wird. Halten Sie die Anästhesie für die Dauer der Operation bei einem bis 2 % Isofluran. Tragen Sie Vaseline auf beide Augen auf, um ein Austrocknen während der Operation zu verhindern.

Verwenden Sie dann sterile Wattestäbchen, um den rasierten Kopf mit Betadin gefolgt von 70% Ethanol zu desinfizieren. Verabreichen Sie 100 Mikroliter 0,25% Bupivacain subkutan mit einer 31-Gauge-Insulinnadel und massieren Sie die Injektionsstelle sanft, um eine bessere Absorption zu erzielen. Machen Sie mit einem Skalpell oder einer Schere einen Längsschnitt entlang der Mittellinie auf der Kopfhaut.

Ziehen Sie dann mit einem Blutstiller die Haut zur rechten Seite ab. Lassen Sie den freiliegenden Schädel eine Minute lang trocknen. Reinigen Sie dann alle Blut- und Gewebereste auf dem Schädel mit einem sterilen Wattestäbchen.

Vergewissern Sie sich, dass der Kopf des Tieres in der horizontalen Ebene waagerecht ist, und identifizieren Sie die anatomischen Orientierungspunkte Bregma und Lambda, indem Sie beide Positionen mit einem Bleistift markieren. Stellen Sie sicher, dass der Kopf des Tieres in rostral-kaudaler Richtung waagerecht ist, indem Sie die Z-Koordinaten von Bregma und Lambda messen. Gehen Sie auf die gleiche Weise vor, um den Kopf horizontal zu positionieren.

Verwenden Sie eine 31-Gauge-Insulinnadel, um die Kraniektomiestelle zu identifizieren. Setzen Sie den XY-Ursprung auf Bregma und bewegen Sie die Nadel seitlich drei Millimeter nach rechts. Markieren Sie diese Stelle als Ort der Kraniektomie und zeichnen Sie mit einem Bleistift einen Kreis von vier Millimetern Durchmesser auf den Schädel.

Schneiden Sie mit dem Trephin mit einem Hochgeschwindigkeits-Mikrobohrer entlang des mit Bleistift umrandeten Kreises, um ein offenes Loch mit einem Durchmesser von vier Millimetern zu erzeugen. Entfernen Sie die Knochenklappe mit einer Pinzette und bewahren Sie sie in eiskalter, normaler Kochsalzlösung auf. Spülen Sie das Loch vorsichtig mit Kochsalzlösung aus, bevor Sie Druck auf die Gehirnoberfläche ausüben, um die Blutung zu stoppen.

Stellen Sie am CCI-Gerät die abgerundete Schlagkörperspitze mit einem Durchmesser von 2,5 Millimetern auf einen Winkel von 22,5 Grad ein. Nullen Sie die Schlagspitze auf die Duralfläche, und stellen Sie die Aufprallparameter im Steuerfeld auf eine Geschwindigkeit von vier Metern pro Sekunde und eine Verformungstiefe von zwei Millimetern ein. Ziehen Sie die Metallspitze zurück.

Entladen Sie den Kolben, um eine Impaktion auf das Gehirn zu erzeugen. Legen Sie dann ein steriles Wattestäbchen auf die verletzte Stelle, um die Blutung zu stoppen. Setzen Sie den Knochenlappen wieder auf und befestigen Sie ihn mit Zahnzement.

Verschließen Sie die Kopfhaut mit Tuchkleber. Platzieren Sie die Maus unter der Wärmelampe in einem sauberen Erholungskäfig mit Einstreu, bis sie vollständig genesen ist. Die richtige stereotaktische Technik und das Kraniektomieverfahren sind wichtige Determinanten für die Entstehung stabiler und reproduzierbarer CCI-induzierter Hirnverletzungen.

Eine ideale Kraniektomie würde eine minimale histologische Schädigung des scheinoperierten Gehirns verursachen. Veränderungen der Hirnschädigung und des Corpus Callosum-Verlusts wurden an den Tagen 1, 3, 7 und 28 nach CCI beobachtet. Darüber hinaus wurde am Tag 28 nach dem CCI eine einseitige Hirnatrophie auf der Prellungsseite beobachtet.

Die Neuroinflammation wurde durch Iba1-positive aktivierte Mikroglia und Makrophagenakkumulation am Rand des Contusionsbereichs nachgewiesen. Die intraparenchymale Blutung war auch durch die Ly76-positive Färbung von den Tagen eins bis sieben nach der CCI nachweisbar. Am siebten Tag nach der CCI wurde eine Mischung aus roten Blutkörperchen mit gerissener und intakter Zellmorphologie beobachtet, was darauf hindeutet, dass die Erythrozyten in diesem Stadium lysiert wurden.

Dieses Phänomen stimmte mit der Beobachtung überein, dass Eisenablagerungen in der Contusionsregion von den Tagen sieben bis 28 nach dem CCI nachweisbar waren. Aktivierte Mikroglia und Makrophagen wurden im Striatum weit entfernt von der Kontusionsstelle von den Tagen drei bis 28 nach dem CCI beobachtet, was auf Corpus callosum und striatale Verletzungen hinweist. Diese Technik ebnet den Forschern den Weg, die durch Hirnblutungen induzierte Neuroinflammationsinteraktion weiter zu erforschen, indem sie die Reaktion der Immunzellen, wie z. B. Mikroglia, nach einer Blutungsprellung verstehen.