Name: Ein Protokoll für Immunhistochemie und RNA-in-situ-Verteilung im frühen Drosophila-Embryo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 34 s
Description: Lernen Sie Immunhistochemie und RNA-in-situ-Hybridisierung für Entwicklungsbiologie mit Drosophila melanogaster. Dieses Protokoll verbessert die Embryoanhaftung an Objektträgern für bessere Visualisierung.

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Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (#31771377/ 31571273/31371256), dem Foreign Distinguished Scientist Program des National Department of Education (#MS2014SXSF038), dem National Department of Education Central Universities Research Fund (#GK201301001/201701005/GERP-17-45) unterstützt, und XZ wird vom Outstanding Doctoral Thesis Fund (#2019TS082 /2019TS079), Key Program of Shaanxi Provincial Education Department (#20JS138), unterstützt. das Natural Science Basic Research Program Youth Project der Abteilung für Wissenschaft und Technologie der Provinz Shaanxi (#2020JQ-885).

1. Zubereitung von Traubensaft-Agar-Tellern
<ol><li>Fügen Sie 5 g Agar und 5 g Saccharose zu 150 ml destilliertem Wasser hinzu. Kochen Sie es mit einer Mikrowelle, bis Agar und Saccharose vollständig aufgelöst sind. Mischen Sie 50 ml 100% Traubensaft und die Lösung zusammen.</li>
	<li>Fügen Sie 1 ml 100% Propionsäure hinzu, um die Endkonzentration auf 0,5% Propionsäure zu erhöhen. Gießen Sie 25 ml der vorbereiteten Lösung in jede Platte. Nachdem das Agar erstarrt ist, lagern Sie das Medium bei 4 °C.</li>
</ol>2. Beschichtungsobjektträger
<ol><li>Vorbehandeln Sie Objektträger mit Reinigungsmittel. Waschen Sie die Rutschen 3 Mal mit Leitungswasser und einmal mit destilliertem Wasser. Anschließend trocknen Sie die Objektträger in einem 45 °C Ofen für 2 h.</li>
	<li>Tauchen Sie die Objektträger 24 Stunden lang in etwa 450 ml Kaliumdichromat-Schwefelsäurelösung (20 g Kaliumdichromat, 40 ml destilliertes Wasser und 400 ml konzentrierte Schwefelsäure). Waschen Sie die Rutschen 3 Mal mit Leitungswasser und einmal mit destilliertem Wasser.<ol>
<li>Trocknen Sie die Rutschen in einem 45 °C heißen Ofen zwei Stunden lang. Eintauchen in 95% Ethanol für mehr als 2 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>0,5 g Chromkaliumsulfat und 5 g Gelatine zu 1 l destilliertem Wasser hinzufügen. Vor Gebrauch in einem 60 °C warmen Wasserbad auflösen. Die Chromalaungelatine kann bei 4 °C über lange Zeiträume gelagert werden.</li>
	<li>Lassen Sie 10 μL der Chromalaungelatine auf den Objektträger fallen und bedecken Sie die gesamte Oberfläche des Objektträgers vollständig und gleichmäßig mit der Lösung. Legen Sie den Objektträger mit der Gelatineseite nach oben für 48 h in einen Ofen bei 42 °C. Die vorbereiteten Objektträger können zur späteren Verwendung bei 4 °C gelagert werden. HINWEIS: Dies ist ein kritischer Schritt. Die komplette Beschichtung ist notwendig. Für die Fruchtfliege und ihren Embryo erscheint dieser Gleitbeschichtungsansatz effizienter als die Polylysinbeschichtung.</li>
</ol>3. Einbettung des Drosophila-Embryos
<ol><li>
Sammlung von Drosophila-Embryonen HINWEIS: Wir sammelten Drosophila-Embryonen in vier Perioden von 0-2 Stunden (Synzytialblastoderm), 2-3 Stunden (zelluläres Blastoderm), 3-12 Stunden (frühe Gastrula) und 12-24 Stunden (späte Gastrula)18. Der Anteil der wichtigsten Embryonentypen in jeder Periode ist in Tabelle 1 dargestellt.<ol>
<li>Legen Sie 400-500 Fliegen in eine Plastiksammelflasche und bedecken Sie die Flasche mit der Traubensaft-Agarplatte, die Hefeextrakt enthält. Drosophila-Embryonen werden bei Raumtemperatur auf den Traubensaft-Agar gelegt.</li>
		<li>Sammeln Sie vier Perioden von Embryonen und fügen Sie vorsichtig 2 ml PBS (137 mM NaCl, 2,7 mM KCL, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4) zu jeder Platte hinzu, um die Embryonen schwimmen zu lassen. Übertragen Sie etwa 200 Embryonen in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen und halten Sie es 2 Minuten lang auf Eis, um die Embryonen zu beruhigen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voreinbettung<ol>
<li>Transfer von 200 Drosophila-Embryonen in ein 1,5 ml Zentrifugenröhrchen. Halten Sie die Röhre für 2 Minuten auf Eis, um die Embryonen zu beruhigen, und werfen Sie dann den Überstand vorsichtig mit der Pipette ab. Fügen Sie 1 ml 50% Bleichmittel in die Tube und schütteln Sie es vorsichtig für 2 min. HINWEIS: Das Bleichmittel sollte frisch zubereitet werden, und die Menge des Bleichmittels kann je nach Menge der gesammelten Embryonen variieren.</li>
		<li>Sammeln Sie vorsichtig Embryonen, indem Sie sie auf Filterpapier gießen und waschen Sie sie 3 Mal mit jeweils 1 ml PBS.</li>
		<li>Übertragen Sie die Embryonen mit Filterpapier auf etwa 5 ml n-Heptan.</li>
		<li>Die Mischung in ein frisches 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen geben. Fügen Sie 1 ml Methanol hinzu und schütteln Sie es vorsichtig. Sammle Embryonen nach der Sedimentation.</li>
		<li>Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie die Embryonen 3-5 Mal in 1 ml PBS.</li>
		<li>Fixieren Sie die Embryonen mit 400 μL Bouinlösung (71% gesättigte Picrinsäure, 24% Formalin, 5% Essigsäure) für 30 min. Waschen Sie die fixierten Embryonen 3 mal in 1 ml PBS für jeweils 5 Minuten.</li>
		<li>Um Embryonen zu aggregieren, übertragen Sie die Proben in einen Gummistopfen und entfernen Sie das PBS.</li>
		<li>Bereiten Sie 1,2% ige Agarose-PBS-Lösung vor und halten Sie die Lösung bei 60 ° C. Fügen Sie 200 μL 1,2% ige Agarose-PBS-Lösung in die Embryonen ein, um sie in einem Agarblock zu fixieren.</li>
		<li>Nehmen Sie den Block aus dem Stopper heraus und speichern Sie den Block in PBS. HINWEIS: Während des Ansatzes vor der Einbettung ist die Pro-Erwärmung entscheidend für den Erfolg. Wir empfehlen dringend, dass die Zentrifugenröhrchen und Mikropipettenspitzen, die in diesem Schritt verwendet werden, vor dem Betrieb vollständig vorgewärmt werden sollten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Paraffin-Einbettung<ol>
<li>Tauchen Sie den voreingebetteten Agarblock für jeweils 15 Minuten in 35 % Ethanol, 50 % Ethanol, 75 % Ethanol und 85 % Ethanol ein. Dann 2 mal in 95% Ethanol und 100% Ethanol tauchen. ANMERKUNGEN: Etwa 5-10x Blockvolumen von jedem, gefolgt von einem abgestuften Fixiermittel für 15-30 Minuten, ist abhängig von der Anzahl der Embryonen im Block notwendig.</li>
		<li>Tauchen Sie den Embryonenblock 15 min in 100% ige Ethanol- und Xylollösung (Verhältnis 1:1).</li>
		<li>Übertragen Sie den Block für 1 Minute auf Xylol, um das Embryogewebe transparent zu machen.</li>
		<li>Tauchen Sie den Block für 30 Minuten in Xylol und Paraffin (Verhältnis 1:1) ein.</li>
		<li>Tauchen Sie den Block jeweils für 2 Stunden in Paraffin I, Paraffin II und Paraffin III ein.</li>
		<li>Füllen Sie die Einbettungsbox vorher mit Paraffin und übertragen Sie den Block dann vorsichtig und horizontal in den Boden der Einbettungsbox. Nachdem das Paraffin auf natürliche Weise erstarrt ist, kann der erstarrte Paraffinblock bei 4 °C gelagert werden. HINWEISE: Die voreingebettete Probe kann in der Kryosektion verwendet werden, indem Sie die folgenden Schritte ausführen. Nachdem die Embryonen wie oben beschrieben mit Agarose voreingebettet wurden, werden die Proben einfach in OCT Compound eingebettet. Danach kann die Kryosektion nach dem routinemäßigen Kryosektionsprotokoll durchgeführt werden. Anschließend können regelmäßige Färbeansätze auf den Abschnitten verwendet werden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Hämatoxylin-Eosin-Färbung
<ol><li>Bereiten Sie Drosophila-Embryo-Abschnitte vor. Vorbereitete Abschnitte für 15 min in einen Ofen bei 60 °C legen und dann die Abschnitte 2 mal für jeweils 10 min in Xylol tauchen. Tauchen Sie die Abschnitte einmal für 2 min 100% Ethanol und Xylol (Verhältnis 1:1) ein.</li>
	<li>Hydratisieren Sie die Abschnitte in 100% Ethanol I, 100% Ethanol II, 95% Ethanol, 85% Ethanol, 75% Ethanol, 50% Ethanol und in destilliertem Wasser für 3 min.</li>
	<li>Färben Sie die Abschnitte mit Hämatoxylinlösung für 2 min. Tauchen Sie die Objektträger schnell in 1% ige saure Alkohollösung (1 ml Salzsäure, 100 ml 70% Ethanol) und waschen Sie die Objektträger in destilliertem Wasser.</li>
	<li>Tauchen Sie die Objektträger nacheinander in 50% Ethanol, 75% Ethanol, 85% Ethanol und 95% Ethanol ein.</li>
	<li>Färben Sie die Abschnitte mit Eosinlösung für 1 min.</li>
	<li>Dehydrieren Sie die Objektträger in 95% Ethanol I, 95% Ethanol II, 95% Ethanol III, 100% Ethanol I, 100% Ethanol II und 100% Ethanol III für jeweils 1 Minute.</li>
	<li>Löschen Sie die Objektträger in 100% Xylol I, 100% Xylol II und 100% Xylol III für jeweils 5 Minuten.</li>
	<li>Montieren Sie die Dias mit neutralem Balsam gemäß den Anweisungen des Herstellers.</li>
</ol>5. Periodische Säure-Silber-Methenamin-Färbung
<ol><li>Deparaffinisieren und hydratisieren Sie Paraffinabschnitte von Drosophila embryo zu destilliertem Wasser.</li>
	<li>Oxidieren Sie die Abschnitte in 1% periodischer Säure für 15 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Spülen Sie die Objektträger in destilliertem Wasser 3 Mal für jeweils 1 min ab.</li>
	<li>Die Objektträger in etwa 40 ml frisch gefilterter Silbermethenamin-Arbeitslösung (3% Methenamin, 5% Silbernitrat, 5% Natriumboratlösung) für 1 h und 20 Minuten bei 60 °C inkubieren. Dann spülen Sie die Rutschen in destilliertem Wasser für 1 min.</li>
	<li>Tonne die Objektträger in 0,2% Goldchlorid für 2 min und spüle dann die Objektträger in destilliertem Wasser für 1 min.</li>
	<li>Legen Sie die Objektträger für 3 min in 3% Natriumthiosulfat und spülen Sie die Objektträger dann für 1 min in destilliertem Wasser ab.</li>
	<li>Bekämpfen Sie die Objektträger in Hämatoxylin für 30 s. Waschen Sie die Rutschen in fließendem Leitungswasser für 3-5 min.</li>
	<li>Dehydrieren Sie die Objektträger in 70% Ethanol, 80% Ethanol, 95% Ethanol I, 95% Ethanol II, 95% Ethanol III, 100% Ethanol I und 100% Ethanol II für jeweils 5 Minuten.</li>
	<li>Löschen Sie die Objektträger in 100% Xylol I, 100% Xylol II und 100% Xylol III für jeweils 5 Minuten.</li>
	<li>Montieren Sie die Dias in neutralem Balsam gemäß den Anweisungen des Herstellers.</li>
</ol>6. Immunhistochemie
<ol><li>Deparaffinisieren und rehydrieren Sie Paraffinabschnitte von Drosophila embryo zu PBS gemäß dem Standardprotokoll19.</li>
	<li>Behandeln Sie Objektträger mit 0,3% H2O2 in Methanol für 10 min bei Raumtemperatur und vermeiden Sie Licht.</li>
	<li>Den entsprechenden Antigen-Retrieval-Puffer in einem Behälter mit den Objektträgern im Gemüsedämpfer auf ca. 100 °C vorheizen. Der Behälter sollte auch einen Deckel haben. Legen Sie die Folien in den Behälter. Schließen Sie den Deckel des Dampfers.<ol>
<li>Bewahren Sie den Behälter ab diesem Zeitpunkt für 20 Minuten im Dampfgarer auf. Beachten Sie, dass der Deckel des Gleitbehälters nicht vollständig angezogen werden sollte, damit während des Dämpfvorgangs Wasserdampf eindringen kann.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lassen Sie die Objektträger auf Raumtemperatur zurückkehren, bevor Sie sie vorsichtig in PBS-T (PBS mit Tween-20, pH 7,2) 3 Mal für jeweils 5 Minuten spülen und dann die Objektträger in PBS 3 Mal für jeweils 1 Minute spülen.</li>
	<li>Blockieren Sie die Objektträger mit 1% Rinderserumalbumin (BSA) in PBS für 60 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Objektträger mit einem primären Antikörper (Anti-FKBP12 bei 1:1000) über Nacht bei 4 °C oder bei Raumtemperatur für 4 h.</li>
	<li>Waschen Sie die Objektträger in PBS-T 4 Mal für jeweils 5 Minuten.</li>
	<li>Tragen Sie die Objektträger mit HRP-markiertem Polymer auf, das mit sekundären Antikörpern (Anti-Rabbit, 1:5.000) für 90 min bei Raumtemperatur konjugiert ist. Tun Sie dies im Dunkeln, um Fotobleichen zu vermeiden.</li>
	<li>Waschen Sie die Dias in PBS-T 3 Mal für jeweils 5 Minuten.</li>
	<li>Die Objektträger mit 5% 3,3'-Diaminobenzidin-tetrahydrochlorid (DAB) für 2-10 min inkubieren, bis die Farbe der Reaktionsprodukte unter dem Mikroskop angemessen ist.</li>
	<li>Färben Sie die Objektträger 30 s lang in Hämatoxylin und waschen Sie die Objektträger in destilliertem Wasser 2 Mal für jeweils 5 Minuten.</li>
	<li>Dehydrieren Sie die Objektträger in 50% Ethanol, 70% Ethanol, 90% Ethanol, 95% Ethanol und 100% Ethanol für jeweils 1 Minute.</li>
	<li>Löschen Sie die Objektträger in 100% Xylol I, 100% Xylol II und 100% Xylol III für jeweils 5 Minuten.</li>
	<li>Montieren Sie die Dias in neutralem Balsam gemäß den Anweisungen des Herstellers.</li>
</ol>7. In-situ-Hybridisierung 
HINWEIS: Drosophila-Embryo-Abschnitte wurden mit 0,01% Diethylpyrocarbonat (DEPC) behandeltem Wasser hergestellt. Alle Zubehörteile, die für die In-situ-Hybridisierung verwendet werden, wenden die DEPC-Behandlung über Nacht im Voraus an.
<ol><li>Riboprobe Präparation<ol>
<li>Linearisieren Sie die Vorlagen-DNA, indem Sie an einer Restriktionsenzymstelle stromabwärts vom klonierten Insert mit einem Restriktionsenzym schneiden, das 5'-Überhänge erzeugt. Nach der Linearisierung reinigen Sie die Vorlagen-DNA durch Phenol / Chloroform-Extraktion und anschließende Ethanolfällung. Verwenden Sie Standardprotokolle.</li>
		<li>1 μg gereinigte Template-DNA in ein RNase-freies Zentrifugenröhrchen geben. Stellen Sie das Zentrifugenrohr auf Eis. Fügen Sie dem Gesamtvolumen von 13 μL genügend DEPC-behandeltes Wasser hinzu.<ol>
<li>Fügen Sie dann die folgenden Reagenzien der Reihe nach hinzu: 2 μL 10x NTP-Markierungsmischung, 2 μL 10x Transkriptionspuffer, 1 μL Protektor-RNase-Inhibitor, 2 μL RNA-Polymerase SP6 oder RNA-Polymerase T7.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Mischen Sie die Reaktion durch Pipettieren und zentrifugieren Sie in Kürze. 2 h bei 37 °C inkubieren. HINWEIS: Längere Inkubationen erhöhen nicht die Ausbeute an markierter RNA. Ein kurzer Spin (~ 800 U / min), der auf das Reaktionsrohr angewendet wird, ist kritisch, bevor mit dem nächsten Schritt fortgefahren werden kann. Dieser Spin ermöglicht es, dass alle Inhalte, die sich aus der Inkubation ergeben könnten, auf den Boden der Röhre gelangen.</li>
		<li>Fügen Sie 2 μL RNase-freie DNase I hinzu, um die Vorlagen-DNA zu entfernen, und inkubieren Sie für 15 min bei 37 °C.</li>
		<li>Fügen Sie 2 μL 200 mM EDTA (pH 8,0) hinzu, um die Reaktion zu stoppen. HINWEIS: DIG-markierte RNA-Sonden können ein Jahr lang bei -15 bis -25 °C in Ethanol gelagert werden.</li>
	</ol></li>
	<li>Prähybridisierung des Drosophila-Embryonenschnitts<ol>
<li>Legen Sie Abschnitte des Drosophila-Embryos für 48 h in einen 42 ° C-Ofen.</li>
		<li>Deparaffinisieren Sie die Objektträger zweimal für 10 min in 100% Xylol.</li>
		<li>Hydratisieren Sie die Objektträger, indem Sie nacheinander in 100% Ethanol, 95% Ethanol, 90% Ethanol, 70% Ethanol und 50% Ethanol für 5 Minuten eintauchen.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Objektträger in PBS für 5 min 3 mal, um die Fixierlösung / Bouins Lösung aus dem Gewebe zu entfernen.</li>
		<li>Waschen Sie die Objektträger mit 100 mmol / L Glycin / PBS-Lösung 2 mal für jeweils 5 Minuten.</li>
		<li>Waschen Sie die Dias mit PBS 2 mal für jeweils 5 Minuten.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Objektträger mit 0,3% Triton X-100 in PBS für 15 Minuten, um die Membranen zu permeabilisieren.</li>
		<li>Waschen Sie die Dias mit PBS 3 mal für jeweils 5 Minuten.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Objektträger in 15 μg/ml RNase-freier Proteinase K für 30 Minuten bei 37 °C.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Objektträger mit 4% Paraformaldehyd in PBS für 3 Minuten, um die Verdauung zu stoppen.</li>
		<li>Waschen Sie die Dias mit PBS 2 mal für jeweils 5 Minuten.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Objektträger in 100 mM Triethanolamin-Puffer (pH 8,0) mit 0,25% (v/v) Essigsäureanhydrid 2 mal für jeweils 5 min.</li>
		<li>Geben Sie DEPC-Wasser in die Feuchtigkeitskammer des Objektträgers. Fügen Sie 20 μL Vorhybridisierungslösung (mit 100 μg/ml Lachssperma-DNA) auf die Objektträger hinzu. Legen Sie die Dias in die Feuchtigkeitskammer des Objektträgers. Inkubieren Sie die Dias bei 42 °C für 4 h. HINWEIS: Es ist notwendig, die Dichtheit des Deckels der Nassbox sicherzustellen und sicherzustellen, dass die Nassbox immer in einer Horizontalen gehalten wird, um eine Verflüchtigung und Abweichung vom Gewebe der Vorhybridisierungslösung und der folgenden Hybridisierungslösung zu verhindern.</li>
	</ol></li>
	<li>Hybridisierung des Drosophila-Embryonenschnitts<ol>
<li>Entfernen Sie die Vorhybridisierungslösung und waschen Sie die Objektträger mit 0,2x SSC (150 mM Natriumchlorid, 15 mM Natriumcitrat, pH 7,0) 3 mal für jeweils 5 Minuten. Wischen Sie überschüssige 0,2x SSC um die Gewebeproben ab.</li>
		<li>30 μL Sondenhybridisierungslösung (mit 2-6 ng Digoxin-markierter RNA-Sonde durch Verdünnung in Vorhybridisierungslösung) mit einer Pipette auftragen. Inkubieren Sie die Objektträger in der Objektträgerfeuchtekammer bei 42 °C für ca. 20 h. HINWEIS: Achten Sie auf die Dichtheit der Kappe als Vorschlag der letzten Note. Andernfalls erzeugt die Austrocknung, die durch das Auslaufen von entweder vor der Hybridisierung oder vor der Hybridisierung verursacht wird, einen schmutzigen Hintergrund, einschließlich pseudopositiver Folien.</li>
	</ol></li>
	<li>Hybridisierung<ol>
<li>Entfernen Sie die Hybridisierungslösung und waschen Sie die Objektträger mit 4x SSC-Lösung 4 mal für jeweils 15 min bei 37 °C.</li>
		<li>Waschen Sie die Objektträger in 2x SSC-Lösung mit 20 μg/ml RNase A für 30 min bei 37 °C.</li>
		<li>Waschen Sie die Objektträger in 1x SSC-Lösung für 15 min bei 37 °C.</li>
		<li>Waschen Sie die Objektträger in 0,5x SSC-Lösung für 15 min bei 37 °C.</li>
		<li>Waschen Sie die Objektträger in 0,1x SSC-Lösung für 15 min bei 37 °C.</li>
		<li>Waschen Sie die Dias mit PBS 3 mal für jeweils 5 Minuten.</li>
		<li>Waschen Sie die Objektträger in Waschpuffer (100 mM Maleinsäure, 150 mM NaCl, 0,3% (v/v) Tween 20, pH 7,5) für 1 min.</li>
		<li>Die Objektträger in 100 ml frisch zubereiteter Blockierlösung (2% Schafserum in Maleinsäurepuffer ohne Tween 20) 30 Minuten lang inkubieren.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Objektträger in 20 ml Antikörperlösung für 45 Minuten.<ol>
<li>Zentrifugieren Sie den Antikörper vor jedem Gebrauch 5 min bei 10.000 U / min in der Originaldurchstechflasche und pipettieren Sie die erforderliche Menge vorsichtig von der Oberfläche. Verdünnen Sie Anti-Digoxigenin-AP 1:5000 (150 mU/ml) in blockierender Lösung.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Waschen Sie die Objektträger in 100 ml Waschpuffer 2 Mal für jeweils 15 Minuten, um ungebundenes Antikörperkonjugat zu entfernen.</li>
		<li>Ausgleich der Objektträger in 20 mL Detektionspuffer (100 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, pH 9,5) für 2-5 min.</li>
		<li>Bebrüten Sie die Objektträger mit 10 ml frisch zubereiteter farbiger Substratlösung in der Objektträgerfeuchtekammer. Die Reaktion beginnt innerhalb weniger Minuten und ist nach 16 h abgeschlossen. Nicht schütteln oder mischen, während sich Farbe entwickelt.</li>
		<li>Waschen Sie die Objektträger mit 50 ml destilliertem Wasser für 5 Minuten, um die Reaktion zu stoppen.</li>
		<li>Trocknen Sie die Probe über Nacht im Dunkeln.</li>
		<li>Dehydrieren Sie die Objektträger in 70% Ethanol, 80% Ethanol, 90% Ethanol, 95% Ethanol, 100% Ethanol I und 100% Ethanol II für jeweils 3 Minuten.</li>
		<li>Löschen Sie die Objektträger in 100% Xylol I, 100% Xylol II und 100% Xylol III für jeweils 20 Minuten.</li>
		<li>Montieren Sie die Dias mit neutralem Balsam.</li>
		<li>Dokumentieren Sie Bilder und analysieren Sie sie mit der invertierten Mikroskopie- und Herstellersoftware. Führen Sie eine Verteilungsanalyse mit ImageJ entsprechend der Dichte des positiven Signals entweder entlang der Längsachse oder innerhalb der differentiellen Zone von Embryonen durch. HINWEIS: Während der Inkubation mit der frisch zubereiteten Farbsubstratlösung im Schritt 7.4.12 ist die Reaktionsfarbe bereits mit bloßem Auge zu erkennen. Diese Beobachtung, wie die Farbentwicklung unter Stereoskop inspiziert werden kann. Sobald die Reaktionsfarbe angemessen ist und der Schritt 7.4.13 durchgeführt werden kann, um die Reaktion zu stoppen.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Die durch RyRs und IP3Rs vermittelte Kalziumsignalisierung ist ein grundlegender Weg in vielen physiologischen und pathologischen Prozessen von Wirbeltieren und wirbellosen Tieren1,2,3,4. Beim Menschen führen Punktmutationen, wie die CPVT-assoziierte R4496C-Mutation, im RyR2-Gen zu einem Kalziumverlust aus dem sarkoplasmatischen Retikulum des Kardiomyozyten, was zu einer Herzfunktionsstörung fü...

Das Calcium Induced Calcium Release Signaling (CICR) spielt eine entscheidende Rolle in vielen biologischen Prozessen, wie z.B. Skelett-/glatte Muskulatur und kardiale Gefäßfunktion, Zellproliferation und Apoptose, Entwicklung, Alterung, neuronale synaptische Plastizität und Regeneration1,2,3,4,5,6 . Ryanodinrezeptoren (RyRs) und Inositol-1,4,5-Trisphosphatrezeptoren (IP3Rs) sind Hauptakteure im Calcium-Signalweg, der von ihren Regulatoren Proteinkinase A (PKA), Ca2+/Calmodulin-abhängige Proteinkinase II (CaMKII), FK506-bindende Proteine (FKBPs), Calsequestrin (CSQ), Triadin und Junitin1,2,3,4,5,6 kontrolliert wird. . Abnorme menschliche Expression und Mutationen in diesen Proteinen können zu pathologischer Physiologie wie Arrhythmien7 und onkogener Proliferation führen8,9.
FKBPs regulieren die Calciumfreisetzung aus dem endoplasmatischen retikulären (ER) durch RyRs. Dieser Prozess ist essentiell für den Kontraktionsmechanismus und somit verantwortlich für alle mechanischen Bewegungen, die durch die Myosin-Aktin-Kontraktion durch kalziuminduzierte Kalziumfreisetzung zusammen mit embryonalem RyRs1,2 erzeugt werden. In Mausmodellen ist der Mangel an RyR2 und seinem Regulator FKBP12/Calstabin ausnahmslos tödlich, entweder während der Embryonalentwicklung oder in der frühen postnatalen Periode10,11,12. FKBP12/Calstabin-Knockout-Mäuse weisen während der Embryonalentwicklung kritische Herzdefekte mit unregelmäßiger Erregungs-Kontraktions-Kopplung (EC) und Hirnödemen auf. Dies deutet darauf hin, dass FKBP12/Calstabin eine wesentliche Rolle bei der Regulierung der RyR2-Kanalexpression spielt, die sowohl für die kardiale als auch für die zerebrale Entwicklung wichtig ist10.
RyR-geleitete Kalziumfunken wurden zunächst in der Zygotenbildungsphase befruchteter Medaka-Eier entdeckt13,14. Es wurden jedoch nur wenige Untersuchungen zur Funktion der Calciumsignalisierung in der frühen Embryonalentwicklung durchgeführt. Bei Drosophila melanogaster liefern die Ergebnisse von DmFKBP12 S107-Mutanten starke Beweise für die Bedeutung dieses Gens für die Larvenentwicklung und eine gesunde Lebensdauer, die auf seine Funktion gegen oxidativen Stress zurückzuführen ist15,16. Vor kurzem haben wir die dynamische Lokalisation von FKBP12/Calstabin-Protein und Boten-RNA während der frühen Entwicklung von Drosophila melanogaster identifiziert17. Mit den in dieser Methodik beschriebenen Ansätzen konnten wir die Expression von FKBP12/Calstabin in D. melanogaster während des synzytialen Blastoderms (0-2 h), des zellulären Blastoderms (2-3 h), des frühen Gastrillas (3-12 h) und des späten Gastrula (12-24 h) verfolgen. In diesem Artikel stellen wir die detaillierten Protokolle aller Ansätze in der vorherigen Studie vor, einschließlich der Einbettung vor dem Embryo für die klassische Paraffinschnitte, der Vorbeschichtung von Objektträgern für embryonale Abschnitte, der histochemischen Färbung und Immunfärbung sowie der mRNA-In-situ-Hybridisierung zur Identifizierung der Genexpression.

<table><tbody><tr><td>-20°; C Kühlschrank</td><td>Meiling Biologie & Medizinisch</td><td>DW-YL270</td><td>Verwendet für Regent-Lagerung-80</td></tr> <tr><td>& Grad; C Ultratiefkühlschrank</td><td>Thermo</td><td>Forma 90 Serie</td><td>Wird für die Regentenlagerung</td></tr><tr><td></td><td>Agar Sigma-Aldrich</td><td>WXBB6360V</td><td>Präparation von Traubensaft-Agarplatten</td></tr><tr><td>Anti-Digoxigenin-AP, Fab-Fragmente</td><td>Roche</td><td>11093274910</td><td>Für den Nachweis von Digoxigenin-markierten Verbindungen</td></tr><tr><td>Biochemischer Inkubator</td><td>Shanghai Bluepard Instruments</td><td>LRH-250</td><td>In-situ Hybridisierung</td></tr><tr><td>Bouins Lösung</td><td>Sinopharm Chemisches Reagenz in Peking</td><td>69945460</td><td>Drosophila Embryo Embedding</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>540BH07808</td><td>In-situ Hybridisierung</td></tr><tr><td>Zentrifugenröhrchen</td><td>Denville</td><td>C-2170</td><td>Drosophila Embryo Collection</td></tr><tr><td>Chrom-Alaun</td><td>Sinopharm Chemisches Reagenz bei Beijing</td><td>10001018</td><td>Coating Slides</td></tr><tr><td>Wasserbad mit konstanter Temperatur</td><td>Jintan Henfeng Instruments</td><td>KW-1000DC</td><td>Hämatoxylin-Eosin-Färbung, Immunhistochemie, In-situ-Hybridisierung und periodische Säure-Silber-Methenamin-Färbung</td></tr><tr><td>Dako REAL EnVision Detektionssystem</td><td>Dako</td><td>K5007</td><td>In einer immunhistochemischen Reaktion oder einer in situ-Hybridisierungsreaktion bindet es an den primären Antigen-Antikörper, und das Ziel wird durch Färben markiert.</td></tr><tr><td>DEPC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5758</td><td>In-situ-Hybridisierungskit</td></tr><tr><td>für DIG-RNA-Markierung</td><td></td><td>Roche 11093274910-RNA-Markierung mit Diagoxigenin-UTP durch In-vitro-Transkription mit SP6- und T7-RNA-Polymerase</td><td></td></tr><tr><td>Drosophila melanogaster</td><td>Bloomington Stock Center</td><td>BDSC_16799, BDSC_19894, BDSC_11664</td><td>Die Bestände an Drosophila melanogaster Mutante</td></tr><tr><td>Elektrischer Hochtrocknungsofen</td><td>Tianjin Taiste Instruments</td><td>101-0AB</td><td>Zum Beschichten von Objektträgern und Einbetten von Paraffin</td></tr><tr><td>Eosin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>230251</td><td>Hämatoxylin-Eosin-Färbung</td></tr> von <tr><td>Ethanol</td><td>Sinopharm Chemisches Reagenz in Peking</td><td>100092680</td><td>Einbetten von Paraffin, Hämatoxylin-Eosin-Färbung, Immunhistochemie, In-situ-Hybridisierung und periodische Säure-Silber-Methenamin-Färbung</td></tr><tr><td>Gelatine</td><td>Sinopharm Chemisches Reagenz bei</td> Beijing <td>10010328</td><td>Coating Slides</td></tr><tr><td>Goldchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>379948</td><td>Periodische Säure-Silber-Methenamin-Färbung</td></tr><tr><td>Hämatoxylin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3136</td><td>Hämatoxylin-Eosin-Färbung</td></tr><tr><td>Hochreines PCR-Produktaufreinigungskit</td><td>Roche</td><td>11732668001</td> Für <td>die Aufreinigung von PCR-Produkten</td></tr><tr><td>Intelligente Box mit konstanter Temperatur und Luftfeuchtigkeit</td><td>Ningbo Jiangnan Instruments</td><td>HWS</td><td>Für die Fliegenpflege</td></tr><tr><td>LE Agarose</td><td>HyAgarose</td><td>14190108029</td><td>Pre-embedding</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sinopharm Chemisches Reagenz bei Beijing</td><td>10014108</td><td>Drosophila Embryo</td></tr><tr><td>Collection Mikroskop</td><td>ZEISS</td><td>Observer.A1</td><td>Hämatoxylin-Eosin-Färbung, Immunhistochemie, In-situ-Hybridisierung und periodische Säure-Silber-Methenamin-Färbung</td></tr><tr><td>Objektträger</td><td>MeVid Labware Manufacturing</td><td>P105-2001</td><td>Beschichtungsobjektträger</td></tr><tr><td>Chemisches Reagenz für neutrales Gummi Sinopharm in Peking</td><td>10004160</td><td>Hämatoxylin-Eosin-Färbung</td><td></td></tr><tr><td>Chemisches Reagenz für N-Heptan Sinopharm in Peking 40026768</td><td></td><td></td><td>Drosophila-Embryo Sammlung</td></tr><tr><td>Paraffinschneider</td><td>Huahai wissenschaftliches Instrument</td><td>HH-2508III</td><td>In-situ Hybridisierung</td></tr><tr><td>Paraffin</td><td>Sinopharm Chemisches Reagenz in Peking</td><td>69019461</td><td>Paraffin Einbettung</td></tr><tr><td>pH/mV Messgerät</td><td>Sartorius</td><td>PB-10</td><td>Zur Bestimmung des pH-Wertes einer Lösung</td></tr><tr><td>Silbernitrat</td><td>Sinopharm Chemisches Reagenz in Peking</td><td>10018461</td><td>Periodische Säure-Silber-Methenamin-Färbung</td></tr><tr><td>Reinstwassermessgerät</td><td>Thermo</td><td>AFXI-0501-P</td><td>In-situ Hybridisierung</td></tr><tr><td>Xylol-Sinopharm Chemisches Reagenz bei Beijing</td><td>10023418</td><td>Paraffineinbettung</td><td></td></tr></tbody></table>

ein protokoll für immunhistochemie und rna-in-situ-verteilung im frühen drosophila-embryo

A Protocol for Immunohistochemistry and RNA In-situ Distribution within Early Drosophila Embryo

Die Calcium-induzierte Kalziumfreisetzungssignalisierung (CICR) spielt in vielen biologischen Prozessen eine entscheidende Rolle. Jede zelluläre Aktivität von Zellproliferation und Apoptose, Entwicklung und Alterung bis hin zu neuronaler synaptischer Plastizität und Regeneration wurde mit Ryanodinrezeptoren (RyRs) in Verbindung gebracht. Trotz der Bedeutung der Calciumsignalisierung ist der genaue Mechanismus seiner Funktion in der frühen Entwicklung unklar. Als Organismus mit kurzer Schwangerschaft sind die Embryonen von Drosophila melanogaster erstklassige Studienobjekte, um die Verteilung und Lokalisation von CICR-assoziierten Proteinen und ihren Regulatoren während der Entwicklung zu untersuchen. Aufgrund ihrer lipidreichen Embryonen und ihres chitinreichen Chorions ist ihr Nutzen jedoch durch die Schwierigkeit begrenzt, Embryonen auf Glasoberflächen zu montieren. In dieser Arbeit stellen wir ein praktisches Protokoll vor, das die Bindung von Drosophila-Embryonen an Objektträger signifikant verbessert und Methoden für eine erfolgreiche Histochemie, Immunhistochemie und In-situ-Hybridisierung detailliert beschreibt. Die Chromalaun-Gelatine-Objektträgermethode und die Embryo-Voreinbettungsmethode erhöhen die Ausbeute bei der Untersuchung des Drosophila-Embryoproteins und der RNA-Expression dramatisch. Um diesen Ansatz zu demonstrieren, untersuchten wir DmFKBP12/Calstabin, einen bekannten Regulator von RyR während der frühen embryonalen Entwicklung von Drosophila melanogaster. Wir identifizierten DmFKBP12 bereits im synzytialen Blastodermstadium und berichteten über das dynamische Expressionsmuster von DmFKBP12 während der Entwicklung: zunächst als gleichmäßig verteiltes Protein im synzytialen Blastoderm, dann vorläufig lokalisiert es während des zellulären Blastoderms in der Basalschicht des Kortex, bevor es sich während der Drei-Edelsteinschicht-Phase in der frühen Gastrulation in der primitiven neuronalen und Verdauungsarchitektur verteilt. Diese Verteilung könnte die entscheidende Rolle erklären, die RyR in den lebenswichtigen Organsystemen spielt, die aus diesen Schichten stammen: dem subösophagealen und supraösophagealen Ganglion, dem ventralen Nervensystem und dem Bewegungsapparat.

Die Abbildungen beschreiben Protokolle, die verwendet werden, um die Herausforderung zu meistern, hochlipidreiche und chitinhaltige Chorion-Drosophila-Embryonen (Tabelle 1) zur Untersuchung und zum Experimentieren an der Glasobjektträgeroberfläche zu befestigen. Unter Verwendung der in Abbildung 1 gezeigten Chromalaun-Gelatine-Objektträgermethode haben wir die Bindung von Drosophila-Embryonen an die Oberfläche von Objektträgern verbessert, während die in <s...

Hier beschreiben wir ein Protokoll zum Nachweis und zur Lokalisierung von Drosophila-Embryoprotein und RNA von der Sammlung bis zur Voreinbettung und Einbettung, Immunfärbung und mRNA-in-situ-Hybridisierung.

Ein Protokoll für Immunhistochemie und RNA-in-situ-Verteilung im frühen Drosophila-Embryo

Calcium induced calcium release signaling (CICR) plays a critical role in many biological processes. Every cellular activity from cell proliferation and ...

Als Organismus mit kurzer Schwangerschaft sind die Embryonen von Drosophila melanogaster erstklassige Studienobjekte, um die Verteilung und Lokalisation von Proteinen und ihren Regulatoren während der Entwicklung zu untersuchen. Aufgrund ihrer lipidreichen Embryonen und ihres chitinreichen Chorions ist ihr Nutzen jedoch durch die Schwierigkeit begrenzt, Embryonen auf Glasoberflächen zu montieren. In dieser Arbeit stellen wir eine praktische Methode vor, die die Bindung von Drosophila-Embryonen auf Objektträgern signifikant verbessert und unsere Methoden für eine erfolgreiche Histochemie, Immunhistochemie und In-situ-Hybridisierung detailliert beschreibt.Vor den hier gezeigten Schritten sollten die Objektträger mit Reinigungsmittel gewaschen und dann in Leitungswasser und destilliertem Wasser gespült werden, bevor sie zum Trocknen in den Ofen gestellt werden. Trockenobjektträger sollten 24 Stunden lang vorsichtig in Kaliumdichromat einweichen, bevor sie erneut gespült und getrocknet und dann mindestens zwei Stunden lang in 95% Ethanol gegeben werden. In diesem Schritt können Sie weitere Objektträger oder die Chrom-Alaun-Gelatine nach unseren Methoden vorbereiten.Gelatine kann dann vor Gebrauch in 60 Grad Badewasser gelagert werden. Um Objektträger zu beschichten, lassen Sie eine kleine Menge Gelatine auf einen Rand des Objektträgers fallen. Verwenden Sie dann einen weiteren Glasschieber, um die Gelatine langsam und gleichmäßig über die Oberfläche des zu beschichtenden Objektträgers zu ziehen.Dadurch entsteht eine dünne, gleichmäßige Schicht. Bevor es in ein Gestell oder eine Trocknungsvorrichtung gelegt wird, um in einem Ofen gelagert zu werden, um eine weitere Trocknung über Nacht oder 48 Stunden zu ermöglichen. Embryonen werden mit einer Traubensaft-Agarplatte gesammelt, sobald sie fertig sind, kann die Traubensaft-Agarplatte dann entfernt werden.Überfluten Sie die Platte mit PBS und bürsten Sie vorsichtig mit einer weichen Bürste, um alle angeschlossenen Embryonen zu entfernen. Entfernen Sie den PBS-haltigen Embryo in ein 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und lassen Sie ihn auf Eis ruhen. Sobald sich die Embryonen auf Eis abgesetzt haben, entfernen Sie vorsichtig den überstehenden PBS.Achten Sie darauf, den Embryo am Boden der Röhre nicht zu stören. 1 ml 50% Bleichmittel in die Probe geben und zwei Minuten lang vorsichtig schütteln. Entfernen Sie das Bleichmittel durch Filtration und waschen Sie die Embryonen dreimal in PBS.Bereiten Sie n-Heptan vor. Sobald Sie fertig sind, waschen Sie die Embryonen aus dem Filterpapier in n-Heptan, indem Sie das Filterpapier vorsichtig in der Lösung schütteln. Lassen Sie die Embryonen sich am Boden der n-Heptanplatte niederlassen und sammeln Sie dieses n-Heptan in einem neuen 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.Fügen Sie einen Milliliter Methanol in die Tube hinzu, lassen Sie die Lösung ausfallen und saugen Sie dann das n-Heptan-Methanol ab. Waschen Sie den Embryo drei- bis fünfmal in PBS, um Restmethanol zu entfernen. Entfernen Sie dieses zusätzliche PBS und fügen Sie Bouins Fixiermittel hinzu und lassen Sie es 30 bis 60 Minuten einwirken, um die Embryonen zu fixieren.Entfernen Sie Bouins Fixiermittel und waschen Sie die Embryonen dreimal erneut in PBS. Bereiten Sie 1,2% Agarose in PBS vor und halten Sie es in einem 60-Grad-Wasserbad warm, dann bereiten Sie die Embryonen für die Einbettung vor, indem Sie vorsichtig zusätzliches PBS absaugen, in dem sie gelagert wurden. Achten Sie darauf, die Embryonen am Boden nicht zu stören, und saugen Sie dann den Embryostopfen am Boden der Lösung ab und legen Sie ihn vorsichtig in eine Flaschenverschlussform.Saugen Sie zusätzliches PBS aus dieser Form ab, bevor Sie 1,2% Agarosegel hinzufügen. Bereiten Sie eine PBS-Lösung vor, um diese Agarose-Plugs zu lagern. Sobald sich die Agarose verfestigt hat, können einzelne Stecker zur Lagerung in dieses PBS verschoben werden.Hier zeigen wir den sequentiellen Dehydratisierungsprozess. Erlaubt jedes Mal 15 Minuten für die Inkubation. Dann entfernen Sie das 100% ige Ethanol und fixieren Sie es in einer Eins-zu-Eins-Lösung aus Ethanol und Xylol für weitere 15 Minuten.Nach dem Entfernen aus dieser Eins-zu-Eins-Lösung für eine Minute in reines Xylol entfernen. Jetzt ist die Gewebeprobe bereit, in eine erwärmte Eins-zu-Eins-Xylolparaffinlösung gebracht zu werden. Vor der endgültigen Einbettung in 100% Paraffin 30 Minuten ruhen lassen.Bewegen Sie sich zum ersten von 100% Paraffin und ruhen Sie sich zwei Stunden aus. Wiederholen Sie diesen Vorgang in seinen zwei und drei Paraffinen. Die Probe ist nun bereit, in eine Form gebracht und die Form mit Wachs gefüllt zu werden, um den Einbettungsprozess abzuschließen.Einbettung von Drosophila-Embryonen. Legen Sie vorbereitete Paraffinabschnitte von Drosophila-Embryonen für 15 Minuten in einen 60-Grad-Ofen. Legen Sie sie in eine 100% ige Lösung von Xylol.Wir beginnen dann mit der Rehydratation. Platzieren Sie die Folien in jeder dieser Lösungen für jeweils drei Minuten. Sobald sich der Objektträger in destilliertem Wasser befindet, geben Sie ihn zwei Minuten lang in die Hämatoxylinlösung.Stellen Sie nach Abschluss sicher, dass Sie so viel wie möglich von der Lösung aus dem Objektträger abtropfen lassen. Sobald der Objektträger in destilliertem Wasser gewaschen wurde, färben Sie den Objektträger eine Minute lang in Eosin. Zum Schluss den Schieber aus dem Eosin nehmen und in destilliertem Wasser waschen.Sobald diese Folie sauber ist, beginnen wir nun mit unserem letzten Dehydratisierungsprozess. Schließlich für fünf Minuten in 100% Xylol gegeben. Dieser Vorgang wird in zwei neuen Lösungen von 100% Xylol wiederholt und lässt eine kleine Menge neutralen Kaugummis entlang einer Kante des Objektträgers fallen.Nehmen Sie diesen Abdeckschlitten und positionieren Sie ihn vorsichtig auf einer Kante des Objektträgers. Deparaffinisieren Sie zuerst die Objektträger, indem Sie sie in 100% Xylol legen. Sobald die Objektträger aus destilliertem Wasser entfernt wurden, sollten sie mit 1% periodischer Säurelösung bedeckt werden.Wir entsorgen dann die überschüssige Lösung und spülen sie in destilliertem Wasser ab. Indem Sie den Objektträger direkt in eine vorgewärmte Lösung legen. Sobald dies abgeschlossen ist, spülen wir den Objektträger in destilliertem Wasser ab und färben die Lösung dann mit 0,2% Goldchlorid für ein bis zwei Minuten.Als nächstes fixieren wir das Gewebe mit 3% Natriumthiosulfat für drei Minuten mit destilliertem Wasser. Und dann Flecken mit Hämatoxylin entgegenwirken. Nach dem Gegenfärben kann der Fleck mit beiden Röhrchen destilliertem Wasser gewaschen werden, wie hier gezeigt.Dann gehen wir zum Dehydratisierungsprozess über. Befolgen Sie dies, indem Sie die Dias direkt in 100% Xylol legen und dann eine kleine Menge neutralen Kaugummis auf die Ecke der Folie auftragen. Vorsichtig mit einem Deckglas abdecken.Beginnen Sie mit der Vorbereitung der Dias wie zuvor durch Deparaffinisieren und Xylol. Und dann in Eins-zu-eins-Xylol-Ethanol. Sobald die Objektträger deparaffinisiert sind, beginnen wir, ihr Gewebe zu rehydrieren und schließlich in PBS.Legen Sie die Objektträger für 10 Minuten in 0,3% Wasserstoffperoxid aus Methanol. Dann werden die Objektträger mit 20 ml Zielabruflösung bedeckt. Die Dias können dann in die Färbebox gelegt werden.Legen Sie die Färbebox in einen Dampfgarer, um sicherzustellen, dass keine Lösung entweicht und die Dias noch vollständig abgedeckt sind. Beachten Sie, dass der Deckel der Fleckenbox nicht vollständig geschlossen werden sollte, damit während des Dämpfvorgangs Wasserdampf entweichen kann. Und dann dreimal vorsichtig in PBS-T spülen.Verwerfen Sie die überschüssige Lösung und wiederholen Sie den Vorgang, diesmal mit PBS. Als nächstes inkubieren wir die Objektträger in einem Peroxidblock für fünf bis 10 Minuten und spülen dann mehrmals wieder in PBS-T und dann in PBS. Bereiten Sie den Antikörper vor und lassen Sie ihn direkt auf das Gewebe fallen.Diese Gewebe können dann vier Stunden lang oder bei Raumtemperatur inkubiert werden. Der sekundäre Antikörper sollte bei Raumtemperatur für 90 Minuten inkubiert werden, was zwei bis 10 Minuten lang mit 5% DAB färbt. Nachdem die entsprechende Farbe erhalten wurde, spülen Sie sie in destilliertem Wasser ab und bekämpfen Sie dann die Flecken in Hämatoxylin.Nach dieser Hämatoxylinfärbung können die Objektträger dann nacheinander dehydriert werden. Legen Sie die Dias in 100% Xylol und lassen Sie sie drei Minuten einweichen. Lassen Sie dann kleine Mengen neutralen Kaugummis auf einen Rand des Objektträgers fallen.Sobald ein Kaugummi platziert wurde, nehmen Sie die Diaabdeckung und legen Sie sie vorsichtig von einer Kante des Objektträgers ab. Fügen Sie ein Mikrogramm gereinigte linearisierte Vorlagen-DNA zu einer sterilen RNase-freien Reaktionsdurchstechflasche hinzu. Dann fügen Sie genügend steriles RNase-freies DEPC-behandeltes doppelt destilliertes Wasser hinzu, um ein Gesamtprobenvolumen von 13 Mikrolitern zu erhalten.Dann kurz zentrifugieren und zwei Stunden bei 37 Grad Celsius inkubieren. Für RNase-Schutzexperimente empfehlen wir, 15 Minuten lang mit zwei Mikrolitern Dnase-1, RNase-frei, zu inkubieren, um Template-DNA zu entfernen. Sobald der Inkubationsschritt abgeschlossen ist, stoppen Sie die Reaktion, indem Sie zwei Mikroliter 0,2 molare EDTA bei einem pH-Wert von acht hinzufügen.Vor den Schritten, die hier gezeigt werden, wurden die Dias nach unserem zuvor demonstrierten Protokoll deparaffinisiert und rehydriert. Nach der Rehydratation inkubieren Sie die Objektträger in 0,01 Mol pro Liter PBS bei einem pH-Wert von 7,4 für jeweils fünf Minuten, um die fixierende Lösung aus dem Gewebe zu entfernen. Nach dem Spülen in PBS spülen wir als nächstes zweimal fünf Minuten lang mit 100 Millimolar pro Liter Glycinlösung, um freie Aldehydgruppen aus dem Gewebe zu entfernen.Nach diesem Schritt spülen Sie die Objektträger fünf Minuten lang mit PBS ab. Als nächstes inkubieren Sie in PBS mit 0,3% Triton X-100 für 15 Minuten vor dem Spülen und inkubieren Sie dann erneut mit einem Mikrogramm pro Mikroliter Proteinase K.Als nächstes fixieren Sie Objektträger mit 4% Paraformaldehyd und PBS bei einem pH-Wert von 7,2 für drei Minuten. Dann waschen Sie die Objektträger vor der Inkubation mit 0,1 molaren Triethanolamin-Puffer pH 8, der 0,25% Essigsäureanhydrid enthält.Sie können die Box zu diesem Zeitpunkt kippen, um eine vollständige Abdeckung der Lösung zu gewährleisten. Die Box wird durch Zugabe von 20% Glycerin oder DEPC-Wasser auf den Boden einer trockenen Hybridisierungsbox hergestellt. Als nächstes bedecken Sie die Objektträger in 20 Mikrolitern Vorhybridisierungslösung.Lachssperma DNA in einer Konzentration von 100 Mikrogramm pro Milliliter zu jedem Objektträger. Und dann vier Stunden bei 42 Grad Celsius inkubieren. Dies geschieht in einer vorgefertigten befeuchteten Box, um sicherzustellen, dass die Lösung während dieses Prozesses nicht trocknet.In der Phase nach der Hybridisierung ist es sehr wichtig, dass die Hybridisierungslösung vollständig aus Ihren Proben gespült wird. Dies kann in aufeinanderfolgenden Spülungen von 15 Minuten bei 37 Grad erfolgen, wobei das Vierfache der Konzentration SSC, die zweifache Konzentration eine mal die Konzentration, die 0,5-fache Konzentration und die 0,1-fache Konzentration der SSC-Lösung verwendet wird. Jeder Inkubator für 15 Minuten bei 37 Grad Celsius.Nachdem dies erledigt ist, waschen Sie mit PBS dreimal für jeweils fünf Minuten, bevor Sie den Waschpuffer hinzufügen. Der Waschpuffer sollte vor den nächsten Schritten eine Minute lang gespült werden Stellen Sie sicher, dass der Waschpuffer vollständig von den Objektträgern trocken ist, bevor Sie die nächste Lösung hinzufügen. Fügen Sie jedem Objektträger 100 Milliliter Blockierlösung hinzu und inkubieren Sie den Objektträger 30 Minuten lang.Dies geschieht am besten in einer lichtfreien Umgebung, um eine gute Färbung zu gewährleisten. Als nächstes inkubieren Sie die Objektträger für 30 Minuten erneut in 20 ml Antikörperlösung. Tragen Sie die Antikörperlösung direkt auf Objektträger auf, um Ihr Gewebe vollständig abzudecken.Sobald die Inkubation abgeschlossen ist, tragen Sie 100 Milliliter Waschpuffer auf. Inkubieren Sie 15 Minuten lang unter lichtfreien Bedingungen, um ungebundene Antikörperkonjugate zu entfernen. Entfernen Sie den Waschpuffer.Als nächstes 20 Milliliter Detektionspuffer auftragen und etwa vier Minuten inkubieren lassen. Entfernen Sie nach vier Minuten den Erkennungspuffer. Trocknen Sie die Objektträger, um sicherzustellen, dass keine zusätzliche Lösung gefunden wird, und fügen Sie 10 Milliliter frisch zubereitete Farbsubstratlösung hinzu.Diese Reaktion beginnt innerhalb weniger Minuten, ist aber nach 16 Stunden abgeschlossen. Lassen Sie also für diesen Zeitraum in einem lichtfreien Zustand inkubieren. Sobald die gewünschten Stellen erkannt werden, waschen Sie den Objektträger mit 50 Millilitern TE-Puffer, um die Reaktion zu stoppen.Und dann schließen Sie unseren zuvor gezeigten Trocknungsprozess und Montageprozess für neutrales Kaugummi ab. Die Abbildungen eins und zwei zeigen das Chromaluminiumgelatine-Beschichtungsverfahren für Paraffinschnitte und das Einbettungsverfahren für das Expressionsprofil von FKBP12 und DmFKBP12 bei der Entwicklung von Drosophila-Embryonen. Abbildung drei zeigt die Proteinverteilung des Antikörpers FKBP12 in den synzytialen zellulären Blastoderm-Stadien.Aus diesen histochemischen Ergebnissen kann ersichtlich sein, dass die FKBP12-Expression im synzytialen Blastoderm weniger polarisiert ist und dann beginnt, sich innerhalb der Basalmembran unter dem Trophektodermepithel zu lokalisieren, informiert den Gradienten mit mehr Expression in den vorderen und hinteren Polen. Abbildung vier, die die frühen und späten Gasbeziehungsstadien des Drosophila-Embryos verfolgt, zeigt, dass das FKBP12-Protein auf bestimmte architektonische Komponenten des primitiven embryonalen Gewebes beschränkt wird. Mit geringerer extrazellulärer Verteilung als in frühen und späten gastronomischen Embryonalstadien.Interessanterweise wird die oben beschriebene dynamische Proteinverteilung nicht von entsprechenden Veränderungen der MRT-Spiegel von FKBP12 begleitet, wie in Abbildung fünf zu sehen ist. Zeigt an, dass die Proteinexpression das Ergebnis eines noch unbekannten posttranskriptionellen molekularen Mechanismus ist. Die Ryanodinrezeptor-vermittelte Kalziumsignalisierung ist ein grundlegender Weg in vielen physiologischen und pathologischen Prozessen von Wirbeltieren und wirbellosen Tieren.Es ist bekannt, dass Mutationen in diesem Gen viele physiologische Störungen verursachen, die zu Krankheiten oder einem frühen Herztod führen. Die Rolle, die dieses Gen bei der frühen Entwicklung von Drosophila spielt, war jedoch schwer zu untersuchen. Als Transitkomponente des Embryos erschweren der lipidreiche Embryo und das chitinreiche Chorion Untersuchungen der Protein- und Embryonalexpression in der frühen Drosophila-Entwicklung.Die in diesem Artikel beschriebene Objektträgerbeschichtung, Embryoeinbettung und immunhistochemische Techniken haben es uns ermöglicht, die dynamische Verteilung von Ryanodinrezeptorprotein und mRNA im Detail zu untersuchen. Wir teilen diese Techniken und die Hoffnung, dass sie es anderen ermöglichen werden, andere Proteine in frühen Entwicklungsstadien von Drosophila zu untersuchen.

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