Name: Patienten-abgeleitete Tumor-Explantate als Live präklinische Plattform zur Vorhersage von Arzneimittelresistenzen bei Patienten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Erfahren Sie die Methode der patientenabgeleiteten Tumor-Explantate für präklinische Arzneimitteltests. Diese 3D-Kultur ermöglicht präzise Vorhersagen von Patientenreaktionen und Biomarker-Identifikation.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wir danken den Chirurgen und Pathologen des University Hospitals of Leicester NHS Trust für die Bereitstellung von chirurgisch reseziertem Tumorgewebe. Wir danken auch der Histology-Einrichtung innerhalb von Core Biotechnology Services für die Hilfe bei der Gewebeverarbeitung und dem Schneiden von FFPE-Gewebeblöcken und Kees Straatman für die Unterstützung bei der Verwendung des Vectra Polaris. Diese Forschung wurde vom Explant Consortium unterstützt und finanziert, das aus vier Partnern besteht: der University of Leicester, der MRC Toxicology Unit, den Cancer Research UK Therapeutic Discovery Laboratories und LifeArc. Zusätzliche Unterstützung kam vom CRUK-NIHR Leicester Experimental Cancer Medicine Centre (C10604/A25151). Die Finanzierung für GM, CD und NA wurde durch das Catalyst-Programm von Breast Cancer Now (2017NOVPCC1066) bereitgestellt, das durch Eine Finanzierung von Pfizer unterstützt wird.

Nichts zu enthüllen

Dieser Beitrag beschreibt die Methoden zur Erzeugung, medikamentösen Behandlung und Analyse von PDEs und beleuchtet die Vorteile der Plattform als präklinisches Modellsystem. Die Ex-vivo-Kultivierung eines frisch resezierten Tumors, die keine Dekonstruktion beinhaltet, ermöglicht die Beibehaltung der Tumorarchitektur13,24 und damit der räumlichen Wechselwirkungen zellulärer Komponenten in der TME sowie der intratumoralen Heterogenität. Diese Methode zeigt, wie es...

Die Entwicklung wirksamer und sicherer Krebsmedikamente erfordert geeignete präklinische Modelle, die auch Einblicke in Wirkmechanismen geben können, die die Identifizierung prädiktiver und pharmakodynamischer Biomarker erleichtern können. Es istbekannt,dass die inter- und intratumorische Heterogenität1,2,3,4,5 und die TME6,7,8,9,10,11 ,12 die Reaktionen auf Krebsmedikamente beeinflussen, und viele bestehende präklinische Krebsmodelle wie Zelllinien, Organoide und Mausmodelle sind nicht in der Lage, diese entscheidenden Funktionen. Ein "ideales" Modell ist eines, das die komplexen räumlichen Interaktionen von malignen mit nicht-malignen Zellen innerhalb von Tumoren rekapitulieren und die regionalen Unterschiede innerhalb von Tumoren widerspiegeln kann. Dieser Artikel konzentriert sich auf PDEs als eine aufstrebende Plattform, die viele dieser Anforderungen erfüllen kann13.
Das erste Beispiel für die Verwendung menschlicher PDEs, auch histokulturen genannt, stammt aus den späten 1980er Jahren, als Hoffman et al. Scheiben von frisch resezierten menschlichen Tumoren erzeugten und in einer Kollagenmatrixkultivierten 14,15. Dies beinhaltete die Etablierung eines 3D-Kultursystems, das die Gewebearchitektur bewahrte und die Aufrechterhaltung der Stromakomponenten und Zellinteraktionen innerhalb der TME sicherstellte. Ohne den ursprünglichen Tumor zu dekonstruieren, läuteten Hoffman et al.16 einen neuen Ansatz der translationalen Forschung ein, und seit dieser Zeit haben viele Gruppen verschiedene Explantatmethoden optimiert, mit dem Ziel, die Gewebeintegrität zu erhalten und genaue Arzneimittelreaktionsdaten zu generieren17,18,19,20,21,22,23,24 , obwohl einige Unterschiede zwischen den Protokollen offensichtlich sind. Butler et al. kultivierten Expflanzen in Gelatineschwämmen, um die Diffusion von Nährstoffen und Medikamenten durch die Probe20,21,25zu unterstützen, während Majumder et al. ein Tumorökosystem schufen, indem sie Explantaten auf einer Matrix kultivierten, die aus Tumor- und Stromalproteinen in Gegenwart von autologem Serum bestand, das vom selben Patienten stammt22, 23.
In jüngerer Zeit hat unsere Gruppe ein Protokoll aufgestellt, bei dem Explantaten durch Fragmentierung von Tumoren in 2 - 3 mm3-großeStücke erzeugt werden, die dann ohne zusätzliche Komponenten auf durchlässigen Membranen an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche eines Kultursystems platziert werden24. Zusammengenommen haben diese zahlreichen Studien gezeigt, dass PDEs die Kultur intakter, lebender Fragmente menschlicher Tumoren ermöglichen, die die räumliche Architektur und regionale Heterogenität der ursprünglichen Tumoren beibehalten. In ursprünglichen Experimenten wurden Explantaten oder Histokulturen in der Regel nach einer medikamentösen Behandlung einer Homogenisierung unterzogen, wonach verschiedene Lebensfähigkeitstests auf die homogenisierten Proben angewendet wurden, wie der Histokultur-Wirkstoff-Response-Assay20,21, der MTT-Assay (3-(6)-2,5-Diphenyltetrazoliumbromid), der Lactatdehydrogenase-Assay oder der Resazurin-basierte Assay26,27,28 . Jüngste Fortschritte bei den Techniken der Endpunktanalyse, insbesondere der digitalen Pathologie, haben nun das Repertoire an Endpunkttests und Assays erweitert, die an Explantaten durchgeführt werden können29,30. Um diese neuen Technologien anzuwenden, werden Explantate anstelle der Homogenisierung in Formalin fixiert, in Paraffin (FFPE) eingebettet und dann mit Immunfärbungstechniken analysiert, was eine räumliche Profilierung ermöglicht. Beispiele für diesen Ansatz wurden für nicht-kleinzelligen Lungenkrebs (NSCLC), Brustkrebs, Darmkrebs und Mesotheliom-Explantaten dokumentiert, wobei die immunhistochemische Färbung für den Proliferationsmarker Ki67 und den apoptotischen Marker, die gespaltene Poly-ADP-Ribose-Polymerase (cPARP), verwendet wurde, um Veränderungen in der Zellproliferation und im Zelltod zu überwachen24,31,32,33,34.
Die multiplexierte Immunfluoreszenz ist besonders geeignet für die räumliche Profilierung von Arzneimittelreaktionen in Explantaten am Endpunkt35. Beispielsweise ist es möglich, die Relokalisierung und räumliche Verteilung bestimmter Klassen von Immunzellen, wie Makrophagen oder T-Zellen, innerhalb der TME bei medikamentöser Behandlung13 , 36,37,38zumessen und zu untersuchen, ob einTherapeutikumden Übergang vom "kalten Tumor" zum "heißen Tumor" begünstigen kann39 . In den letzten Jahren hat sich diese Gruppe auf die Ableitung von PDEs aus verschiedenen Tumorarten (NSCLC, Nierenkrebs, Brustkrebs, Darmkrebs, Melanom) und die Erprobung einer Reihe von Krebsmedikamenten konzentriert, darunter Chemotherapien, niedermolekulare Inhibitoren und Immun-Checkpoint-Inhibitoren (ICIs). Endpunktanalysemethoden wurden optimiert, um die multiplexierte Immunfluoreszenz einzubeziehen, um eine räumliche Profilierung von Biomarkern für die Lebensfähigkeit sowie von Biomarkern für verschiedene Bestandteile der TME zu ermöglichen.

<table><tbody><tr><td>Essigsäure</td><td>Sigma</td><td>320099</td><td>Färbereagenz</td></tr><tr><td>Antikörper Verdünnungsmittel / Block, 1x</td><td>Perkin Elmer</td><td>ARD1001EA</td><td>Antikörperverdünnungsmittel/Blockierungspuffer</td></tr><tr><td>Barnstead NANOpure Diamant</td><td>Barnstead</td><td></td><td>Ultra Pure (UP) H2O Maschine</td></tr><tr><td><stark> Zitronensäure-Monohydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7129</td><td>Reagenz für Citratpuffer</td></tr><tr><td>Costar Multi-Well-Zellkulturplatten</td><td>Corning Incorporated</td><td>3516</td><td>6 Multiwell-Platten</td></tr><tr><td>DAPI Dilactate</td><td>Life Technologies</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>100 x 17 mm Schale, Nunclon Delta</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>150350</td><td>Schale mit 100 mm Durchmesser für Gewebekultur</td></tr><tr><td>DMEM (1x) Dubelcco's Modified Eagle Medium + 4,5 g/L D-Glucose + 110 mg/mL Natriumpyruvat</td><td>Gibco (Life Technologies)</td><td>10569-010</td><td>Gewebekulturmedium (500 mL)</td></tr><tr><td>DPX Eindeckmittel</td><td>VWR</td><td>360294H</td><td>Eindeckmedium</td></tr><tr><td>DPX Eindeckmittel</td><td>Merck</td><td>6522</td><td>Einbettmedium</td></tr><tr><td>Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3609</td><td>Reagenz für TE-Puffer</td></tr><tr><td>Eosin</td><td>CellPath</td><td>RBC-0100-00A</td><td>Färbereagenz</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Gibco</td><td>10500-064</td><td>Zur Verwendung in Gewebekulturen mittelstark</td></tr><tr><td><stark>37 % Formaldehyd</stark></td><td>Fisher (Acros)</td><td>119690010</td><td>10 % Formalin</td></tr><tr><td><stark>iGenix, Mikrowellenherd IG2095</td><td>iGenix</td><td>IG2095</td><td>Mikrowelle zur Antigenrückgewinnung</td></tr> <tr><td><stark>industrieller Brennspiritus (IMS)</stark></td><td>Genta Medical</td><td>199050</td><td>99 % industrieller denaturierter Alkohol (IDA)</td></tr><tr><td>InForm Advanced Image Analysis Software</td><td>Akoya Biosciences</td><td>InForm</td><td></td></tr><tr><td>Leica ASP3000 Tissue Processor</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td>Automated Vacuum Tissue Processor</td></tr><tr><td>Leica Arcadia H and C</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td>Embedding wax</td></tr> bath<tr><td>Leica RM2125RT</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td>Rotationsmikrotom</td></tr><tr><td>Leica ST4040 Linearer Färbeer</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td>H& E stainer</td></tr><tr><td>Mayer's Haematoxylin</td><td>Sigma</td><td>GHS132-1L</td><td>Färbereagenz</td></tr><tr><td>Millicell Zellkultureinsätze, 30 mm, hydrophiles PTFE, 0,4 & Mikro; m</td><td>Merck Milipore</td><td>PICMORG50</td><td>Organotypisches Kultureinsatz-Disc</td></tr><tr><td>Novolink Polymer Detection System</td><td>Leica Biosystems</td><td>RE7150-K</td><td>DAB-Färbekit</td></tr><tr><td>OPAL 480</td><td>Akoya Biosciences</td><td>FP1500001KT</td><td>Fluorophor mit Dimethylsulfoxid (DMSO)-Verdünnungsmittel</td></tr><tr><td>OPAL 520</td><td>Akoya Biosciences</td><td>FP1487001KT</td><td>Fluorophor mit Dimethylsulfoxid (DMSO)-Verdünnungsmittel</td></tr><tr><td>OPAL 570</td><td>Akoya Biosciences</td><td>FP1488001KT</td><td>Fluorophor mit Dimethylsulfoxid (DMSO)-Verdünnungsmittel</td></tr><tr><td>OPAL 620</td><td>Akoya Biosciences</td><td>FP1495001KT</td><td>Fluorophor mit Dimethylsulfoxid (DMSO)-Verdünnungsmittel</td></tr><tr><td>OPAL 650 </td><td>Akoya Biosciences</td><td>FP1496001KT</td><td>Fluorophor mit Dimethylsulfoxid (DMSO)-Verdünnungsmittel</td></tr><tr><td>OPAL 690</td><td>Akoya Biosciences</td><td>FP1497001KT</td><td>Fluorophor mit Dimethylsulfoxid (DMSO)-Verdünnungsmittel</td></tr><tr><td>OPAL 780 / OPAL TSA-DIG Reagenz</td><td>Akoya Biosciences</td><td>FP1501001KT</td><td>Fluorophor mit Dimethylsulfoxid (DMSO)-Verdünnungsmittel und TSA-DIG-Reagenz</td></tr><tr><td>Opal Polymer HRP Ms Plus Rb, 1x</td><td>Perkin Elmer</td><td>ARH1001EA</td><td>HRP polymer</td></tr><tr><td>Penicillin/streptomycin solution</td><td>Fisher Scientific</td><td>11548876</td><td>Zur Verwendung in Gewebekulturmedium</td></tr><tr><td>PhenoChart Whole Slide Contextual Viewer</td><td>Akoya Biosciences</td><td>PhenoChart</td><td>Viewer Software für gescannte Bilder</td></tr><tr><td>Phosphat gepufferte Kochsalztabletten</td><td>Thermo Scientific Oxoid</td><td>BR0014G</td><td>PBS</td></tr><tr><td>1x Plus Amplification Diluent</td><td>Perkin Elmer</td><td>FP1498</td><td>Fluorophor<verdünnungsmittelstrong</td></tr><tr><td>>Prolong Diamond Antifade Eindeckmittel</stark></td><td>Invitrogen</td><td>P36961</td><td>Einbettmittel</td></tr><tr><td><stark>Objektträgerträger</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>Zum Einlegen von Dias in das Slide Carrier Hotel zum Scannen mit Vectra Polaris</td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Fisher</td><td>Scientific S/3160/63</td><td>10% Formalin</td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide Pellets</td><td>Fisher</td><td>Scientific S/4920/53</td><td>Reagenz für Citratpuffer</td></tr><tr><td>Tenatex Gehärtetes Wachs - Rosa (500 g)</td><td>KEMDENT</td><td>1-601</td><td>Dentalwachs-Oberfläche</td></tr><tr><td>Thermo Scientific&nbsp; Shandon Sequenza Slide Rack für Immunfärbung Center</td><td>Fisher</td><td>Scientific 10098889</td><td>Halter für Objektträger und Objektträgerclips</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Shandon Abdeckplatten aus Kunststoff</td><td>Fisher Scientific</td><td>11927774</td><td>Slide Clips</td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)aminomethan (Tris)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252859</td><td>Reagenz für TE-Puffer</td></tr><tr><td>VectaShield</td><td>Vecta Laboratories</td><td>H-1000-10</td><td>Eindeckmedium</td></tr><tr><td><stark>Vectra Polaris Slide Scanner</td><td>Perkin Elmer</td><td>Vectra</td><td>Polaris Slide Scanner</td></tr><tr><td>Xylol</td><td>Genta Medical</td><td>XYL050</td><td>Entwachsungsmittel</td></tr></tbody></table>

patienten-abgeleitete tumor-explantate als "live" präklinische plattform zur vorhersage von arzneimittelresistenzen bei patienten

Patient-Derived Tumor Explants As a "Live" Preclinical Platform for Predicting Drug Resistance in Patients

Das Verständnis der Arzneimittelresistenz und die Entwicklung neuartiger Strategien zur Sensibilisierung hochresistenter Krebsarten beruhen auf der Verfügbarkeit geeigneter präklinischer Modelle, die das Ansprechen der Patienten genau vorhersagen können. Einer der Nachteile bestehender präklinischer Modelle ist die Unfähigkeit, die menschliche Tumormikroumgebung (TME) kontextuell zu erhalten und die intratumorale Heterogenität genau darzustellen, wodurch die klinische Übersetzung von Daten eingeschränkt wird. Im Gegensatz dazu ermöglicht die PDE-Plattform (Patient Derived Explant) durch die Darstellung der Kultur lebender Fragmente menschlicher Tumoren die Untersuchung von Arzneimittelreaktionen in einem dreidimensionalen (3D) Kontext, der die pathologischen und architektonischen Merkmale der ursprünglichen Tumoren so genau wie möglich widerspiegelt. Frühere Berichte mit PDEs haben die Fähigkeit der Plattform dokumentiert, chemosensitive von chemoresistenten Tumoren zu unterscheiden, und es wurde gezeigt, dass diese Segregation prädiktiv für das Ansprechen von Patienten auf dieselben Chemotherapien ist. Gleichzeitig ermöglichen PDEs die Möglichkeit, molekulare, genetische und histologische Merkmale von Tumoren zu untersuchen, die Arzneimittelreaktionen vorhersagen, wodurch Biomarker für die Patientenstratifizierung sowie neuartige interventionelle Ansätze zur Sensibilisierung resistenter Tumore identifiziert werden. Dieses Papier berichtet ausführlich über die PDE-Methodik, von der Sammlung von Patientenproben bis hin zur Endpunktanalyse. Es enthält eine detaillierte Beschreibung der Explantatableitungs- und Kulturmethoden und hebt gegebenenfalls maßgeschneiderte Bedingungen für bestimmte Tumore hervor. Für die Endpunktanalyse liegt der Schwerpunkt auf der multiplexierten Immunfluoreszenz und der multispektralen Bildgebung für die räumliche Profilierung wichtiger Biomarker sowohl in tumoralen als auch in stromalen Regionen. Durch die Kombination dieser Methoden ist es möglich, quantitative und qualitative Drug-Response-Daten zu generieren, die mit verschiedenen klinisch-pathologischen Parametern in Beziehung gesetzt und somit potenziell für die Identifizierung von Biomarkern verwendet werden können.

Die multispektrale Bildgebung von mIF-gefärbten histologischen Schnitten ermöglicht die Identifizierung und Phänotypisierung einzelner Zellpopulationen sowie die Identifizierung von Tumor- und Stromakomponenten im explantierten TME (Abbildung 2). Die multispektrale Bildgebung ist besonders nützlich für die Analyse von Geweben mit hoher intrinsischer Autofluoreszenz, wie z. B. Gewebe mit hohem Kollagengehalt, da sie es ermöglicht, das Autofluoreszenzsignal von anderen Signalen zu entpacken un...

Dieser Beitrag beschreibt Methoden zur Generierung, medikamentösen Behandlung und Analyse von patientenabgeleiteten Explantaten zur Beurteilung von Tumormedikamentenreaktionen in einem lebenden, patientenrelevanten, präklinischen Modellsystem.

Patienten-abgeleitete Tumor-Explantate als "Live" präklinische Plattform zur Vorhersage von Arzneimittelresistenzen bei Patienten

An understanding of drug resistance and the development of novel strategies to sensitize highly resistant cancers rely on the availability of suitable ...

Die vom Patienten abgeleiteten Explantate sind eine kurzfristige Methode, die sofortige Arzneimittelansprechdaten liefert, die die Patientenergebnisse genau vorhersagen können. Die PD-Plattformen ermöglichen es, Arzneimittelreaktionen in einem 3D-Kontext zu untersuchen, der die pathologischen und architektonischen Merkmale der regionalen Tumoren so genau wie möglich widerspiegelt. Explantate haben das Potenzial, neue Einblicke in den Metabolismus und Wirkmechanismus eines Medikaments zu bieten und die Identifizierung neuer pharmakodynamischer Biomarker zu erleichtern.Bevor Sie mit dem Experiment beginnen, reinigen Sie alle chirurgischen Geräte mit 70% industrieller Methylbenzinlösung. Füllen Sie eine 10 Zentimeter große Kulturschale mit 25 Millilitern frischem Medium auf Eis. Übertragen Sie die Probe mit einer Pinzette auf eine Zahnwachsoberfläche und schneiden Sie das Gewebe mit zwei Hauttransplantatklingen in Fragmente von etwa zwei bis drei Kubikmillimetern.Die Explantate in eine 10-Zentimeter-Schale geben und sechs bis neun Stücke des Gewebes in ein Ein-Milliliter-Röhrchen mit 10% nicht gepufferter Formalinlösung für eine 24-stündige Inkubation bei Raumtemperatur geben. Füllen Sie die gewünschte Anzahl von Vertiefungen einer Sechs-Well-Platte mit 1,5 Millilitern frischem Medium pro Well. Und legen Sie eine organotypische Kulturschale in jeden Brunnen, so dass sie auf dem Medium schwebt.Legen Sie sechs bis neun Explantate auf jede Einlegescheibe und lagern Sie sie für eine 16-stündige Inkubation in einem 5% Kohlendioxid-Inkubator, um die Rückgewinnung zu ermöglichen. Am nächsten Tag fügen Sie frisches Medium und Droge zu jedem Brunnen eines neuen Tellers hinzu. Fügen Sie einen Brunnen für die Fahrzeugsteuerung hinzu.Wenn alle medikamentösen Behandlungen vorbereitet sind, verwenden Sie eine Pinzette, um einen Einsatz in jede Vertiefung der neuen Sechs-Well-Platte für eine 24- bis 48-stündige Inkubation im Kohlendioxid-Inkubator zu übertragen. Nach der medikamentösen Behandlung werden die Bandscheiben in neue sechs Vertiefungsplatten mit 10% Formalin übertragen. Und fügen Sie ein paar Tropfen 10% Formalin an die Oberseite jeder Explantation hinzu, um eine vollständige Abdeckung mit dem Fixiermittel für 24 Stunden Inkubation bei Raumtemperatur zu gewährleisten.Am nächsten Tag eine angemessene Anzahl kleiner Histologieschwämme in 70% industrieller Methylierungslösung einweichen. Und legen Sie die Schwämme in Histologiekassetten. Wenn alle Schwämme platziert wurden, übertragen Sie alle Explantate aus dem gleichen medikamentösen Behandlungszustand auf einen einzigen Schwamm, wobei die mit dem Medikament behandelte Seite jedes Explantats die eingeführte Bandscheibe berührt.Legen Sie einen weiteren vorgetränkten Schwamm auf jede Explant und schließen Sie die Kassette, um die Explantate in der Kassette zu sichern. Tauchen Sie dann die Kassetten in 70% industrielle Methylierungslösung, bevor Sie mit der histologischen Verarbeitung fortfahren. Führen Sie nach dem Scannen eine Trainingsanalyse durch und laden Sie die Scans mit den Stempeln für das Training in die entsprechende Analysesoftware.Navigieren Sie in der Singlemode-Ansicht durch die Bilder und wählen Sie die zu analysierenden Scans und den Scan mit intrinsischer Fluoreszenz aus. Klicken Sie mit dem intrinsischen Fluoreszenzscan in einer einzigen Ansicht auf die Autofluoreszenzauswahl, um ein Segment auf einem Bereich mit nicht gefärbtem Gewebe zu zeichnen. Klicken Sie auf Markierungen und Farben bearbeiten und geben Sie die Markernamen in das Feld ein, das jedem Fluorophor zugeordnet ist.Klicken Sie auf Bilder vorbereiten, damit die Software die Intensität der intrinsischen Fluoreszenz von allen hochgeladenen Bildern subtrahieren kann. Klicken Sie auf den Segmentgewebeschritt oben auf dem Bildschirm, um das Trainingsfenster für die Gewebesegmentierung zu öffnen. Geben Sie im Bereich Gewebekategorien den Namen jeder zu segmentierenden Gewebekategorie ein.Klicken Sie auf Zeichnen, um Bereiche um Gruppen von Zellen in der interessierenden Gewebekategorie zu zeichnen. Wechseln Sie dann zur nächsten Gewebekategorie und zeichnen Sie neue Regionen. Wenn alle Trainingsregionen definiert sind, verwenden Sie train tissue segmenter und warten Sie, bis sich die Trainingsgenauigkeit eingependelt hat.Möglicherweise bis zu einem Wert nahe 100% Klicken Sie auf das Segment, um die Gewebe zu segmentieren. Nachdem Sie die Qualität der Gewebesegmentierung überprüft haben, klicken Sie auf Zellsegmentierung und wählen Sie die zu segmentierenden Zellkompartimente aus. Um die Kernkomponente zu konfigurieren, verwenden Sie den typischen Intensitätsregler, um den Schwellenwert anzupassen, der zum Erkennen der Kernpixel verwendet wird.Live-Feedback wird vom Vorschaufenster bereitgestellt. Um die Cluster von Kernpixeln aufzuteilen, wählen Sie im Bedienfeld "Kernkomponentenaufteilung" die Schaltfläche aus, die die Färbequalität der Kerne am besten beschreibt, und verwenden Sie den Schieberegler, um die Teilungsempfindlichkeit anzupassen. Klicken Sie dann auf Alle segmentieren, um alle Bilder zu segmentieren.Wenn alle Bilder segmentiert wurden, fügen Sie im Phänotypbedienfeld die Liste der zu erkennenden Phänotypen hinzu und geben Sie den Namen der Phänotypen in das entsprechende Textfeld ein. Klicken Sie auf Phänotypen bearbeiten, um eine bestimmte Zelle auszuwählen, und wählen Sie den entsprechenden Phänotyp im Dropdown-Menü aus. Nachdem Sie die Auswahl für das Training abgeschlossen haben, klicken Sie auf den Zugklassifikator, um das Ergebnis jedes Phänotyps zu bewerten.Fahren Sie mit phenotype all fort, speichern Sie das Projekt und klicken Sie auf Exportieren. Wählen Sie die Registerkarte Stapelanalyse aus, und laden Sie das Projekt in den Stapelalgorithmus oder das Projektfeld. Um die Bilder und Tabellen zu exportieren, wählen Sie alle Felder in den Exportoptionen aus, klicken Sie auf Folien hinzufügen und laden Sie alle Bilder, die die Stempel für die zuvor vorbereiteten Stapel enthalten.Klicken Sie dann auf Ausführen, um die Stapelanalyse eines Stempels zu starten und die entsprechenden Daten zu exportieren, wenn er erfasst wurde. Die multispektrale Bildgebung von NSCLC-Explantatgewebe, das für Marker der Zelllebensfähigkeit gefärbt wurde, ermöglicht die Identifizierung und Phänotypisierung einzelner Zellpopulationen sowie die Identifizierung von Tumor- und Stromakomponenten innerhalb der explantierten Tumormikroumgebung. Gewebe- und Zellsegmentierung von Zelllebensfähigkeitsmarkerfärbungen multispektrale Bilder, wie gezeigt, können verwendet werden, um Zelltod und Proliferation in patientenabgeleiteten Explantaten zu quantifizieren, die mit Medikamenten von Interesse behandelt werden.Zum Beispiel wurde in dieser Analyse in Gewebeproben von Tumoren, die mit Nivolumab behandelt wurden, eine höhere Anzahl von sterbenden Zellen im Vergleich zu den kontrollbehandelten Tumorproben identifiziert. Darüber hinaus ermöglicht die Fähigkeit, räumliche Informationen aus gefärbten Dissektionen zu extrahieren, wie dargestellt, die Berechnung von Interzellenabständen. Explantate können auch für eine umfassende räumliche Profilierung oder Massenzytometrie verwendet werden, wodurch Hunderte von Biomarkern gleichzeitig mit einer subsidiären Auflösung profiliert werden können, während die 3D-Struktur der Probe erhalten bleibt.PDs könnten die Wirksamkeit der Immuntherapie vorhersagen. Beispielsweise könnte es möglich sein, empfindliche oder resistente Fälle von Immun-Checkpoint-Inhibitoren zu unterscheiden und die Mechanismen zu untersuchen, die dieser Unterscheidung zugrunde liegen.

patient-derived-tumor-explants-as-live-preclinical-platform-for

Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

Hier haben wir eine Methode zur Wirksamkeit von Medikamenten-Tests mit chirurgischen Proben von Hirntumoren, sogenannte "Tumor-Explantat-Methode". Mit dieser Methode können wir Wirksamkeit von Medikamenten ohne die Mikroumgebung von soliden Tumoren zu bewerten. Zur Validierung Zuverlässigkeit dieser Methode beschreiben wir repräsentative Daten mit unseren Gliom Probe mit der gängigen First-Line Chemotherapeutikum Temozolomid behandelt.

Verfahren zur Novel Anti-Cancer Drug Development mit Tumor Explantate von chirurgischen Proben

Gegründet Krebszelllinien und Heterotransplantate waren die Hauptstütze der Krebsforschung in den letzten Jahrzehnten. Jedoch schlägt letzten Beweis, dass therapeutische Reaktion wird durch die Tumorzelle Mikro beeinflusst. Daher haben wir eine ex vivo-Analyse des Primärtumorproben für die Arzneimittelentwicklung Zwecke entwickelt.

Ex-vivo-Ansprechen auf die Behandlung von Primärtumoren und / oder assoziierten Metastasen für die präklinische und klinische Entwicklung von Therapeutika

Unter Verwendung Patienten stammenden Tumoren in einem subkutanen präklinischen Modell ist eine hervorragende Möglichkeit, die Wirksamkeit neuer Therapien, prädiktive Biomarker Entdeckung und arzneimittelresistente Wege zu untersuchen. Dieses Modell, das in der Arzneimittelentwicklung wesentlich ist, das Schicksal vieler neuartiger Krebstherapien vor der klinischen Untersuchung zu bestimmen.

Entwicklung und Wartung eines Präklinische Patienten gewonnen Tumorxenotransplantates Modell für die Untersuchung von neuartigen Anti-Krebs-Therapien

Um hochempfindliche Detektion der Verbreitung von menschlichen colorectal Krebses (CRC) Zellen Gewebe besiedeln können, zeigen wir hier ein Protokoll zur effizienten Transduktion des grün fluoreszierenden Proteins (GFP) Lentivirale Partikel in PDX-abgeleitete CRC organoide Zellen vor der Injektion in Empfänger Mäuse mit Stereo-Fluoreszenz-mikroskopische Beobachtung.

Hochempfindlichen Nachweis von Fixierungsprotokoll von GFP Lentivirus ausgestrahlt Organellen kultiviert von einem Patienten abgeleitet Doppelpunkt Tumor erzeugt

Wir stellen eine Methode zur Energieerzeugung, Anbau und systematische Analyse der organotypischen Scheiben aus murinen Lungentumoren abgeleitet. Wir beschreiben auch für Scheibendicke optimieren und das Medikament Konzentrationen zur Behandlung von Tumor-Scheiben auswählen.

Einrichtung und Analyse der Tumor Slice Explants als Voraussetzung für diagnostische Tests

Patienten-abgeleitete Xenograft -Modelle (PDX) rekapitulieren die molekularen und biologischen Merkmale des Melanoms robuster und sind prädiktiver für die Therapiereaktion im Vergleich zu herkömmlichen auf Kunststoffgewebekulturen basierenden Assays. Hier beschreiben wir unser Standard-Betriebsprotokoll für die Etablierung neuer PDX-Modelle und die Charakterisierung/Experimentierung bestehender PDX-Modelle.

Ein melanompatientenabgeleitetes Xenograft-Modell

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um die Wirksamkeit gezielter Therapien zu testen, die auf der Grundlage der genomischen Zusammensetzung eines Tumors ausgewählt wurden. Das Protokoll beschreibt die Identifizierung und Validierung struktureller DNA-Umlagerungen, die Einplage von Patiententumoren in Mäuse und die Erprobung von Reaktionen auf entsprechende Medikamente.

Testen von gezielten Krebstherapien mit struktureller DNA-Alterationsanalyse und patientenabgeleiteten Xenografts

Wir führen ein Protokoll zur Messung der Echtzeit-Arzneimittelreaktion in organotypischen Tumorgewebescheiben ein. Die hier skizzierte experimentelle Strategie bietet eine Plattform, um mittelhohe Durchsatz-Medikamenten-Screens auf Gewebescheiben durchzuführen, die aus klinischen oder Maustumoren unter ex vivo-Bedingungen abgeleitet werden.

Messung der Echtzeit-Arzneimittelreaktion in organotypischen Tumorgewebescheiben

Patientenbasierte Xenograft-Modelle (PDX) und transplantierbare gentechnisch veränderte Mausmodelle rekapitulieren menschliche Krankheiten originalgetreu und sind bevorzugte Modelle für die grundlegende und translationale Brustkrebsforschung. Hier wird eine Methode beschrieben, Brusttumorfragmente orthotopisch in das Brustfettpolster zu transplantieren, um die Tumorbiologie zu untersuchen und die Arzneimittelreaktion zu bewerten.

Orthotope Transplantation von Brusttumoren als präklinische Modelle für Brustkrebs

Es wird eine Methode beschrieben, um Organoide unter Verwendung von patientenabgeleiteter Xenografts (PDX) für das In-vitro-Screening herzustellen, was zu übereinstimmenden Paaren von In-vivo/In-vitro-Modellen führt. PDX-Tumoren wurden mechanisch oder enzymatisch in kleine Stücke geerntet / verarbeitet, gefolgt von der Clevers-Methode, um Tumororganoide zu züchten, die passageiert, kryokonserviert und gegen das ursprüngliche PDX charakterisiert wurden.

Erstellung übereinstimmender In vivo/In vitro Patienten-abgeleiteter Modellpaare von PDX- und PDX-abgeleiteten Organoiden für die Krebspharmakologieforschung

Dieses Protokoll beschreibt eine standardisierte Bewertung von Arzneimittelsensitivitäten gegenüber zielgerichteten Signalinhibitoren in NSCLC-patientenabgeleiteten Organoidmodellen.

Profiling der Sensitivität gegenüber zielgerichteten Therapien in EGFR-mutierten NSCLC-patientenabgeleiteten Organoiden

Erfahren Sie die Methode der patientenabgeleiteten Tumor-Explantate für präklinische Arzneimitteltests. Diese 3D-Kultur ermöglicht präzise Vorhersagen von Patientenreaktionen und Biomarker-Identifikation.

Patienten-abgeleitete Tumor-Explantate als "Live" präklinische Plattform zur Vorhersage von Arzneimittelresistenzen bei Patienten

Weitere Videos entdecken