Längsschnittliche intravitale Bildgebung durch klare Silikonfenster

Dieses Verfahren zum Gießen und Einsetzen von Silikonfenstern senkt die technischen Barrieren für die intravitale Längsbildgebung. Unser Protokoll erzeugt robuste, leicht anpassbare Fenster, die von den Tieren gut vertragen werden. Mit dieser Technik haben wir Krebs und Immunzellen in Leber, Bauchspeicheldrüse und Brustdrüse abgebildet.

Mit minimalen Anpassungen konnte es an viele anatomische Standorte und biologische Fragestellungen angepasst werden. Für diejenigen, die diese Technik zum ersten Mal ausprobieren, üben Sie, kleine Mengen Klebstoff aus der Spritze zu lösen. Das Auftragen von zu viel Klebstoff trübt das Bildgebungsfeld und erschwert die Arbeit mit dem chirurgischen Bereich.

Beginnen Sie mit dem Gießen des Silikonfensters, indem Sie eine kleine Menge des frisch hergestellten Silikonpolymers Polydimethylsiloxan von PDMS auf eine saubere, glatte Oberfläche abscheiden und das Verhältnis von Volumen zu Fläche einstellen, um die gewünschte Dicke zu erhalten. Sobald das PDMS auf der gewünschten Gießoberfläche abgeschieden ist, drücken Sie leicht ein Edelstahlgitter in das Silikon, um Orientierungspunkte für die wiederholte Abbildung derselben Geweberegionen bereitzustellen. Um die Luftblasen zu entfernen und das Silikonpolymer zu entgasen, legen Sie die beschichtete Oberfläche für 45 Minuten in einen Vakuum-Exsikkator.

Wenn Sie fertig sind, härten Sie das Polymer in einem Ofen bei 75 bis 80 Grad Celsius für 45 Minuten aus. Ritzen Sie das Polymer an den Rändern der Form und verwenden Sie eine Pinzette, um die ausgehärteten Fenster vorsichtig von der Oberfläche zu schälen, die für den Guss verwendet wird. Platzieren Sie die Maus auf der linken seitlichen Dekubitusposition.

Bereiten Sie die betäubte Maus für die Operation vor, indem Sie dreimal hintereinander 10% Volumen pro Volumen Povidon-Jodlösung und 70% Volumen Ethanol auf die rasierte Operationsstelle auftragen. Es muss darauf geachtet werden, dass ein steriles Operationsfeld aufrechterhalten wird. Als nächstes verwenden Sie sterile Schere und Pinzette, um einen 10-Millimeter-Schnitt an der rechten Flanke drei Millimeter unterhalb des Rippenbogens zu machen.

Entfernen Sie einen um einen Quadratzentimeter großen Hautabschnitt und entfernen Sie mit einer zweiten sterilen Schere und Pinzette einen Abschnitt des Peritoneums, der etwas kleiner ist als der Hautabschnitt. Legen Sie eine kleine Menge chirurgischen Klebstoffs auf eine sterile Brunnenplatte und ziehen Sie sie mit einer 31-Gauge-Spritze ab, um sie auf die Oberfläche der Leber an den Rändern des abzubildenden Bereichs aufzutragen, positionieren Sie dann das Fenster auf dem gewünschten Bereich und halten Sie es etwa zwei Minuten lang fest an der Leber, bis der Klebstoff getrocknet ist. Nachdem Sie die Kanten des Fensters unter dem Peritoneum gefaltet haben, legen Sie eine kleine Menge des chirurgischen Klebstoffs auf die Kanten des Fensters, die sich jetzt unter dem Peritoneum befinden, drücken Sie es mit einer Pinzette auf das Peritoneum, um es am Fenster zu befestigen.

Versiegeln Sie das Peritoneum, indem Sie eine kleine Menge des chirurgischen Klebstoffs abscheiden, bevor Sie die Haut nach unten drücken, und tragen Sie dann Kleber um die Kanten des Fensters auf, um einen Rand zu schaffen, der verhindert, dass die Haut über das Fenster zurückwächst. Um das Fenster in die Bauchspeicheldrüse einzuführen, platzieren Sie die Maus auf der rechten lateralen Dekubitusposition und machen Sie den Schnitt an der linken Flanke, bevor Sie einen Abschnitt des Peritoneums entfernen, wie zuvor gezeigt. Mit sterilen Wattestäbchen, die mit steriler Kochsalzlösung getränkt waren, zog die Milz vorsichtig, um die Bauchspeicheldrüse zu visualisieren.

Positionieren Sie die Bauchspeicheldrüse mit den angefeuchteten Wattestäbchen neu, um durch den Schnitt mehr Oberfläche sichtbar zu machen. Sobald auf die Bauchspeicheldrüse zugegriffen wird, setzen Sie das Bildfenster auf dem gewünschten Bereich ein und versiegeln Sie es, wie zuvor erläutert. Um auf die Brustdrüse zuzugreifen, platzieren Sie die Maus in Rückenlage und machen Sie einen 10-Millimeter-Schnitt medial zu einer der Leistenbrustwarzen mit steriler Schere und Pinzette.

Entfernen Sie einen 0,5 Quadratzentimeter großen Hautabschnitt über der Brustdrüse und trennen Sie dann vorsichtig die Brustdrüse von der Haut, indem Sie die sterile Schere zwischen den beiden Oberflächen verteilen, um die Haftung zu stören. Verwenden Sie eine 31-Gauge-Spritze, um eine kleine Menge des chirurgischen Klebstoffs auf die Oberfläche der Brustdrüse an den Rändern des abzubildenden Bereichs aufzutragen. Positionieren und halten Sie das Fenster fest an der Brustdrüse, bis der Klebstoff trocknet.

Nachdem Sie die Kanten des Fensters unter die Haut gefaltet haben, tragen Sie eine kleine Menge chirurgischen Klebstoffs auf die Kanten des Fensters auf, die sich jetzt unter der Haut befinden, und drücken Sie sie mit einer Pinzette auf die Haut, um die Haut am Fenster zu befestigen. Tragen Sie den Kleber um die Kanten des Fensters auf, um einen Rand zu erzeugen, der verhindert, dass die Haut über das Fenster zurückwächst. Bevor Sie mit der Bildgebungssitzung beginnen, reinigen Sie das Fenster von Restablagerungen, indem Sie es vorsichtig mit einem Wattestäbchen abwischen, das in 70% Ethanol getaucht ist.

Wenn Sie eine Wassertauchlinse verwenden, tragen Sie das Ultraschallgel auf das Fenster auf und vermeiden Sie Blasen. Um die Bildgebung zu starten, lokalisieren und platzieren Sie das Raster durch das Okular im Fokus. Bestimmen Sie dann die ungefähre Gewebebildgebungstiefe, indem Sie den unteren Rand des Gitters auf Null setzen.

Die Informationen helfen bei der Lokalisierung der entsprechenden Z-Ebene in nachfolgenden Bildgebungssitzungen. Um dieselbe Position über mehrere Bildgebungssitzungen hinweg zu identifizieren, verwenden Sie die Quadrate auf dem Raster als Referenzpunkt. Notieren Sie sich während der Imaging-Sitzung die Rasterausrichtung und die Position jedes Sichtfelds, das im Raster abgebildet ist.

Das Raster kann verwendet werden, um beim Erfolg von Bildgebungssitzungen zu bestimmten Rasterbereichen und Bildgebungsfeldern zurückzukehren. Entfernen Sie nach jeder Bildgebungssitzung alle verbleibenden Linsentauchmedien und Ablagerungen, indem Sie das Fenster vorsichtig mit einem Wattestäbchen abwischen, das in 70% Ethanol getaucht ist. Das Silikonfenster ermöglicht es, die dynamische Infiltration von Immunzellen im Laufe der Zeit zu erfassen.

Die repräsentative Analyse veranschaulicht die neutrophile Infiltration innerhalb des sich umbauenden Brustdrüsengewebes an den Tagen zwei und vier. Das Silikonfenster ermöglicht es, Tumore zu mehreren Zeitpunkten über Wochen nach dem Fenstereinsetzen zu visualisieren. Die mit 200 Milligramm PDMS gegossenen Fenster eignen sich im Allgemeinen besser für die chirurgische Implantation, da sie eine deutlich höhere Zähigkeit aufweisen als die Fenster mit 150 Milligramm.

Bemerkenswert ist, dass die PDMS-Fenster nicht so starr waren wie Standardglas, was durch den Elastizitätsmodul der Glasfenster dargestellt wird, der deutlich größer ist als PDMS. Das Einsetzen des Fensters in verschiedene Organe wurde gut vertragen, da die meisten Mäuse im Laufe der Zeit weiter an Gewicht zunahmen. Das Wichtigste, woran Sie sich erinnern sollten, wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist, das Fenster vollständig mit Klebstoff abzudichten.

Dies verhindert eine Infektion, das Austrocknen des Gewebes und die Verschiebung des Fensters. Nach dem Eingriff können orthotope Injektionen durch das Silikonfenster durchgeführt werden, so dass die Forscher eine Vielzahl von Themen wie Zellproliferation, Zell-Zell-Interaktionen und therapeutische Wirksamkeit untersuchen können.