Name: Darmorganoide für Hunde in einem durchlässigen Zweikammer-Trägersystem (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: Erfahren Sie die Kultivierung von Darmorganoiden bei Hunden in einem durchlässigen Zweikammer-Trägersystem. Diese Methode verbessert die Vorhersage der oralen Arzneimittelpermeabilität und liefert zuverlässigere Ergebnisse als herkömmliche 2D-Zelllinien.

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Wir möchten uns bei den Mitarbeitern des Veterinary Diagnostic Laboratory der Iowa State University, nämlich Haley Lambert, Emily Rahe, Rosalyn Branaman, Victoria Green und Jennifer Groeltz-Thrush, für die rechtzeitige Verarbeitung der Proben bedanken. Wir möchten uns auch bei Jodi Smith und Bethann Valentine für die Bereitstellung von Material für die Permeabilitätsexperimente bedanken. Wir möchten auch David Diaz-Reganon für seine Hilfe bei Abbildung 9 danken. Mit Ausnahme von Abbildung 6 wurden alle Zahlen im BioRender.com erstellt. Die Autoren möchten die Unterstützung des Faculty Startup, des ISU VPR Miller Award, des ISU VPR Miller Award und des NSF SBIR Subaward für ISU # 1912948 anerkennen.

K. Allenspach ist Mitbegründer von LifEngine Animal Health und 3D Health Solutions. Sie ist als Beraterin für Ceva Animal Health, Bioiberica, LifeDiagnostics, Antech Diagnostics, Deerland Probiotics und Mars tätig. J.P. Mochel ist Mitbegründer von LifEngine Animal Health und 3D Health Solutions und als Berater für Ceva Animal Health und Ethos Animal Health tätig. Dieser Artikel spiegelt die Ansichten der Autoren wider und sollte nicht so ausgelegt werden, dass er die Billigung, Ansicht oder Politik der Food and Drug Administration darstellt. Andere Autoren haben keinen Interessenkonflikt zu erklären.

Canine intestinale Organoidkulturen im permeablen Stützapparat sind ein einzigartiges Konzept, das traditionelle Wirkstoffpermeabilitätstests40 mit einem neuartigen In-vitro-Hundemodell 41 verbindet. Verschiedene Arten von intestinalen Organoiden bei Hunden können verwendet und basierend auf dem Ziel des Experiments mit minimalen Anpassungen bewertet werden. Es wird empfohlen, mehrere Konzentrationen des interessierenden Arzneimittels in 3-4 Vertiefungen pro Gruppe zu testen. Die Konzentrationen können auf der erwarteten Darmkonzentration des Arzneimittels basieren. Darüber hinaus kann die Verwendung früherer Forschungsergebnisse dazu beitragen, geeignete Zeitpunkte für das Studiendesign zu bestimmen. Eine angemessene Dokumentation des Studiendesigns sollte vorgenommen werden, um die Replizierbarkeit zu erhöhen und die Fehlerbehebung zu unterstützen.
Diese Technologie hat aufgrund der Neuheit der Methode42 mehrere Einschränkungen, hauptsächlich aufgrund der mangelnden Standardisierung bei der experimentellen Planung und Ausführung des Protokolls in allen Labors. Dieser Mangel an Standardisierung wurde von anderen Gruppen43 anerkannt, und die Canine 3D Organoid Monolayer Protocols werden zu einer Reproduzierbarkeit zwischen Laboratorien führen und die Standardisierung in dieses System einführen. Standardisierte Ansätze zur Datenanalyse verbessern die Replizierbarkeit und können die Ergebnisse vorläufiger Arzneimitteltests mit den Canine-Organoiden im permeablen Trägersystem in verschiedenen Labors verbessern. Dem 3D-Organoidmodell des Hundes fehlen auch Datensätze, die die In-vitro-P-App-Werte von Modellarzneimitteln mit ihrer bekannten in-vivo-Darmabsorption beim Menschen oder Hund vergleichen, ähnlich wie bei Caco-2-Zellen44,45,46. Sobald solche Daten generiert wurden, kann dieses Organoidmodell für Hunde verwendet werden, um die Darmpermeabilität während der Arzneimittelentwicklung zu bewerten.
Es ist wichtig, dass beim Aussäen der Organoide auf dem durchlässigen Unterstützungssystem darauf geachtet wird, eine ausreichend hohe Dichte an entsprechend dissoziierten Zellen zu säen. Die TEER-Werte des Systems sind zuverlässiger und reproduzierbarer, wenn sie in strengen Monolagen gezüchtet werden. Eine längere Kultur der Monoschichten kann zu einem exponentiellen Anstieg der TEER-Werte führen, der weiter von den physiologischen Werten des Darms entfernt ist. H &amp; E-Abschnitte solcher 3D-Strukturen zeigen dann mehrere Zellschichten übereinander mit veränderten Strukturen von Enterozyten, die näher an der Membran liegen.
Nach erfolgreicher Expansion der intestinalen Organoid-Monoschicht des Hundes können die Ergebnisse auf die gleiche Weise wie herkömmliche 2D-Zellassays analysiert werden, indem der scheinbare Permeabilitätskoeffizient (PApp) eines Arzneimittels Formel44 berechnet wird. DerP-App-Wert (siehe Eq (2)) beschreibt die Transportrate über die zelluläre Monoschicht47.
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63612/63612eq02.jpg" style="margin: auto;"> (2)
Die ist <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63612/63612eq03.jpg" style="margin: auto;"> die Anfangssteigung der Konzentration gegenüber der Zeitkurve (z. B. nmol/s). A ist die Fläche des Einsatzes (cm2) und C0 ist die Anfangskonzentration des Arzneimittels oder der Verbindung in der Spenderkammer37. Die zuverlässige Erkennung der Integrität der Monoschicht ist ein entscheidender Bestandteil des Permeabilitätsassays, der eine Standardisierung erfordert. Lichtmikroskopie und TEER-Messungen werden empfohlen, um Hundeorganoide in einem durchlässigen Stützsystem zu beurteilen und den richtigen Zeitpunkt des Experiments zu bestimmen. Zusätzlich können Null-Molekularpermeabilitätsmarker (z. B. FITC-Dextran, Lucifer Yellow, PEG-400) verwendet werden, um die Integrität der Organoid-Monoschicht funktionell zu bewerten. Es ist darauf zu achten, ob die getestete Verbindung von einem Transporter beeinflusst wird. P-Glykoprotein (P-gp) wird als häufiges Austrittspumpenbeispiel verwendet. Es muss ein Austrittsverhältnis erzeugt werden (Papp,BL-AP/P app,AP-BL) im Vergleich zu einem bekannten P-gp Sondensubstrat.
Die Lichtmikroskopie (glatt oder mit Phasenkontrast verstärkt) ist eine unschätzbare Methode, um die Integrität der 2D- oder 3D-Monoschicht und des Filtereinsatzes zu überprüfen und gleichzeitig ein mögliches zelluläres Überwachsen zu beurteilen. Abbildung 7 kann als Leitfaden für die Erkennung gesunder Organoid-Zellkulturen des Hundedarms dienen. TEER-Werte sind ein wichtiges Maß für die Bildung interzellulärer Verbindungen und die Differenzierung der Organoidkulturen zu einem intakten Darmepithel. Die intestinalen Organoide des Hundes differenzieren sich in Enterozyten und Becherzellen (Abbildung 6). Diese schleimproduzierenden Zellen ermöglichen die Untersuchung von Arzneimittel-Schleim-Interaktionen, was mit herkömmlichen 2D-Zellkulturen nur schwer zu erreichenwar 48. Das Vorhandensein enteroendokriner Zellen wurde zuvor in intestinalen Organoiden von Hunden durch Chandra et al.33 bestätigt.
Eine weitere Charakterisierung der kaninen Organoid-Monoschichten, die von jejunalen, ilealen und kolonalen Organoiden unter Verwendung von TEM abgeleitet sind, wird bereitgestellt. TEM-Bilder zeigen zelluläre Mikroarchitektur, einschließlich Tight Junctions und Mikrovilli-Bildung, was die Komplexität und Nützlichkeit dieser Organoidmodelle in der translationalen Medizin weiter veranschaulicht. Basierend auf den experimentellen Ergebnissen waren die Organoidkulturen auf dem permeablen Träger zwischen den Tagen 11 und Tag 13 nach der Aussaat experimentierbereit (Abbildung 9). Die TEER-Werte lagen zu diesem Zeitpunkt zwischen 1.500 und 2.500Ω,cm 2. Die Plateauphase der TEER-Werte dauert ein sehr begrenztes Zeitfenster, in dem das Experiment gestartet werden muss, bevor die TEER-Werte langsam sinken. TEER-Werte können auch ein entscheidender Bestandteil der Anzeige wichtiger experimenteller Ergebnisse sein, da einige Arzneimittel oder Hilfsstoffe für Arzneimittel mit der Monoschicht interagieren können (z. B. Engstellen), was sich stark auf die TEER-Wertauslesungen auswirken kann. Dies allein kann als Daten für ein Experiment dienen.
Canine Darmorganoide in einem Zweikammer-Zellkulturapparat können aufgrund der einzigartigen Architektur der resultierenden Zellmonoschicht in anderen Bereichen als der oralen Arzneimittelpermeabilität eingesetzt werden. Zum Beispiel können sie in der mikrobiologischen Forschung (z. B. die Auswirkungen der Veränderung der mikrobiellen Gi-Flora), viralen Aufnahmestudien, Arzneimittel-Arzneimittel-Wechselwirkungen und Arzneimitteltransportmechanismenverwendet werden 49. Die Spenderkammer ist typischerweise mit dem Testmedikament oder der Verbindung Ihrer Wahl gefüllt, und Aliquots aus der Empfängerkammer werden zu verschiedenen Zeitpunkten eingenommen. Diese Aliquots können mit Hochleistungsflüssigkeitschromatographie, Massenspektrometrie, enzymgebundenem Immunsorbensassay oder anderen Techniken analysiert werden, um die Menge und Geschwindigkeit zu bestimmen, mit der der gelöste Stoff die Monoschicht durchdringt.
Diese Studien erfordern eine intakte Monoschicht, um die Arzneimittelpermeabilität genau zu beurteilen. Dies erfordert in der Regel wachsende Monoschichten, die über die zur Berücksichtigung unbrauchbarer Bohrlöcher erforderlichen hinausgehen. Organoidzell-Monoschichten können auch verwendet werden, um die Virusaufnahme entweder von der apikalen oder basalen Seite einer Monoschicht aus zu messen, wobei Auslesungen einschließlich Immunfluoreszenz-Assays enthalten sind, bei denen Antikörper verwendet werden, um die zelluläre Aufnahme des Virus nachzuweisen. Schließlich können mehrere Medikamente (d. H. Substrat und Inhibitor) auf die Spenderkammer aufgetragen werden, um transporterbasierte Arzneimittel-Arzneimittel-Wechselwirkungen zu identifizieren.
Basierend auf den aktuellen Beobachtungen werden diese Methoden nicht nur auf Hundeorganoide in Kultureinlagen anwendbar sein, sondern auch für andere veterinärmedizinische Spezies und Organsysteme, wobei geringfügige Änderungen erforderlich sind, um der Spezies oder dem Organmodell der Wahl am besten zu entsprechen. Protokolle für das Organoidwachstum des Hundedarms mussten basierend auf den einzigartigen Eigenschaften der Kultur angepasst werden. So kann das Protokoll an eine andere Spezies angepasst werden, erfordert jedoch subtile Änderungen am Protokoll. Modifikationen können mit Änderungen der Zellaussaatdichte beginnen und sich auf Änderungen in der Medienzusammensetzung ausdehnen, um die interessierenden Organoide richtig zu differenzieren.
Die Standardisierung, die detaillierte Dokumentation der experimentellen Verfahren und die konsistente Überwachung der Zellmonoschichten sind entscheidende Praktiken, die für die durchlässigen Unterstützungsassays erforderlich sind und nicht auf das Hundesystem beschränkt sind. Diese möglichen Spezies- oder Organmodifikationen sind entscheidend für die Dokumentation und Berichterstattung für weitere Fortschritte auf diesem Gebiet. Dieses Modell hat mehrere Einschränkungen, z. B. seine Kostenanforderungen, die Variabilität zwischen den Ringen und begrenzte Daten über die Fähigkeit, die Darmabsorption in vivo vorherzusagen. Hunde besitzen in einigen Fällen andere Drogentransporter und metabolisierende Enzyme als Menschen50.
Darüber hinaus muss das Canine-Organoid-System an einer Vielzahl anderer Zweikammergeräte anderer Hersteller getestet werden, um die Eignung eines solchen Modells zu bestimmen (z. B. muss die Eignung verschiedener Filtermembranzusammensetzungen bestimmt werden). Ein weiterer Nachteil ist, dass der Teil des Drogenpermeabilitätsexperiments des Manuskripts weniger beschreibend ist als die vorherigen Teile. Dies wird durch einen Überschuss an Informationen in diesem Bereich verursacht. Das Ziel für diesen Teil des Manuskripts war es, diese Methoden auf modifizierbare Weise zu beschreiben, ohne die Eckpfeiler dieser Experimente zu schneiden. Detailliertere Informationen zu Permeabilitätsexperimenten wurden von Hubatsch et al.37 gesammelt. Darüber hinaus können durchlässige Einsätze in Kokultur-, Zellmigrations- und Invasionsassay-Experimentenverwendet werden 4.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die intestinalen Organoide des Hundes in Zweikammerkulturapparaten das Potenzial haben, in einer Vielzahl von Anwendungen eingesetzt zu werden, einschließlich biomedizinischer Bereiche und translationaler Medizin, um nur einige zu nennen. Die Protokolle schaffen mehrere Strategien, um ein Experiment zu planen und die Zuverlässigkeit von Ringdaten für Organoidmodelle im gesamten Bereich der Biologie zu fördern.

Permeable Unterstützungssysteme werden typischerweise verwendet, um die scheinbare Permeabilität von therapeutischen Wirkstoffkandidaten durch die Darmepithelbarriere 1,2 zu bestimmen. Sie können auch verwendet werden, um die Zellsekretion3, die Zellmigration4 und die Arzneimitteltoxizität5 zu beurteilen. In-vitro-Tests zur oralen Arzneimittelpermeabilität sind ein wichtiger Schritt im Arzneimittelentdeckungs- und -entwicklungsprozess2, wobei einzelne Arzneimittelkandidaten in einem frühen Stadium des Lebenszyklus der Arzneimittelforschung und -entwicklung getestetwerden 6. Das permeable Trägersystem ist ein Zweikammer-Zellkulturapparat, der aus einem Einsatz mit einer semiporösen Membran besteht, die in einer Mehrkammerplatte platziert ist. Dieses System ermöglicht den direkten Zugriff auf die apikalen und basolateralen Seiten einer Zell-Monoschicht, die im Insert7 gewachsen ist. Die in diesen Systemen verwendete Monoschicht wird typischerweise von gastrointestinalen Epithelzellen abgeleitet (z. B. humane kolorektale Adenokarzinom-Caco-2-Zelllinie)8. Zellkulturen wachsen in einem polarisierten Zustand, der die natürliche Mikroarchitektur von Darmepithelzellen nachahmt und eine weitere zelluläre Differenzierung, ähnliche Mikroanatomie und Funktionermöglicht 7. Details zum durchlässigen Stützeinsatz finden Sie in Abbildung 1. Die Aussaat der Einsätze mit 2D-Zellkulturen, die traditionell zur Beurteilung der Darmpermeabilität verwendet werden, ist relativ erschwinglich und leicht zu kultivieren9. Diese Systeme weisen mehrere große Einschränkungen auf, einschließlich ihrer begrenzten Fähigkeit, den Darmstoffwechsel von therapeutischen Arzneimittelkandidaten vorherzusagen10,11. Dies gilt für alle Mechanismen der Arzneimittelabsorption, sei es die passive Absorption durch die engen Verbindungen zwischen den Epithelzellen, die aktive transepitheliale Absorption durch Efflux oder Aufnahmetransporter (z. B. P-Glykoprotein, Monocarboxylat-Transporter 1) und Medikamente, die durch Enterozyten metabolisiert werden.
Hunde teilen eine gemeinsame Umgebung und Ernährung mit Menschen12. Die Darmanatomie und die Zusammensetzung des Mikrobioms von Hunden ähneln stark der des Menschen13, was der Domestizierung und der gemeinsamen Ernährung in den letzten 36.000 Jahren zugeschriebenwurde 14. Leider können diese Ähnlichkeiten auch häufige Ursachen/Auslöser für die Krankheitsentwicklung sein. Hunde entwickeln ähnliche chronische Morbiditäten wie Menschen, wie Fettleibigkeit15, entzündliche Darmerkrankung 16, kolorektales Adenokarzinom 17, gastrointestinaler Stromatumor (GIST)18 und verschiedene andere Pathologien, die mit ihrer relativen Langlebigkeitverbunden sind 19. Dementsprechend können canine Organoide im Sinne der One Health Initiative20 erfolgreich für die reverse translationale Erforschung dieser chronischen multifaktoriellen Erkrankungen eingesetzt werden.
Caco-2-Zellen sind die am häufigsten verwendeten Zelllinien für orale Absorptionsassays21. Diese Zellen gelten derzeit als das "Goldstandard"-Modell für In-vitro-Intestinalpermeabilitätsassays 2,22,23. Die Caco-2-Zelllinie exprimiert Efflux- und Aufnahmetransporter, die im menschlichen Darmtrakt vorkommen, wenn auch auf unterschiedlichen Expressionsniveaus24,25,26. Caco-2-Zellen werden auch häufig als Modelle verwendet, um festzustellen, ob ein Medikament ein Substrat oder ein Inhibitor von Darmeffluxtransportern ist22,27. Obwohl die Caco-2-Zellen kolonialen Ursprungs sind, ahmen sie eine Enterozytenzelle nach. Leider repräsentieren Caco-2-Zellen nur einen Zelltyp aus der Epithelschicht des Dünndarms9, der die komplexe Zusammensetzung des Darmepithelzelltyps nicht genau rekapituliert. Zum Beispiel fehlen Becherzellen, die der Schleimproduktion gewidmet sind, in Caco-2-Kulturen, so dass Schleim-Arzneimittel-Wechselwirkungen ohne Kokultur mit anderen Zelllinien nicht beurteilt werdenkönnen 28. Darüber hinaus exprimieren Caco-2-Kulturen nicht mehrere der wichtigen Kernrezeptoren, die typischerweise im Darm vorhanden sind, wie der X-Rezeptor der Schwangerschaft (PXR), der Steroid-X-Rezeptor (SXR) und der konstitutive Androstrezeptor (CAR)29. Folglich können Caco-2-Kulturen die Induktion von Wirkstofftransportern und -enzymen durch bestimmte Medikamente, die Induktoren dieser Rezeptoren sind (z. B. Rifampin), nicht modellieren30.
Die 3D-Darmorganoid-Technologie adressiert einige dieser Einschränkungen19. Organoide sind selbstzusammengesetzte Konstrukte, die aus adulten Stammzellen gewonnen werden und aus Gewebeproben gewonnen werden können, die mit mikroinvasiven Techniken entnommen wurden20. Humaninduzierte pluripotente Stammzellen werden für Darmpermeabilitätsmodelleverwendet 31,32. Canine Organoide bieten eine relevante Alternative zu menschlichen Organoiden, da die Forschung an menschlichen Stammzellen durch ethische Fragen eingeschränktist 33. Darüber hinaus bieten Hundeorganoide ein In-vitro-System zur Erforschung der Arzneimittelpermeabilität von Hunden, des Stoffwechsels, des aktiven Transports und der Wechselwirkungen zwischen Arzneimitteln und Arzneimitteln. Um diese Technologielücke zu schließen, wurde das konsistente und zuverlässige Wachstum von Darmorganoiden bei Hunden in einem durchlässigen Stützsystem beschrieben34. Ein Permeabilitätsassay mit intestinalen Organoiden bei Hunden kann möglicherweise die Darmpermeabilität des Hundes und den Metabolismus kleiner Wirkstoffmoleküle im Vergleich zu derzeit verwendeten Assays (Caco-2) vorhersagen. Die Bestätigung dieser entscheidenden Merkmale verleiht diesem neuartigen In-vitro-System zukünftige Arbeiten, die den möglichen Einfluss von Induktoren auf den intrazellulären Stoffwechsel und den aktiven Transport untersuchen.
Canine Organoide bestehen aus allen Zelltypen, die typischerweise in der Epithelschicht des Darms vorhanden sind. Aus funktioneller und mikroanatomischer Sicht bilden sie zuverlässig die Umgebung der Epithelschicht des Hundedarmsnach 19,35. Darüber hinaus ist das Vorhandensein von Schleim, hundespezifischen Wirkstofftransportern und -enzymen sowie die zelluläre Gesamtdifferenzierung in Darmorganoiden von Hunden vergleichbar mit dem, was in vivo bei Hundenbeobachtet wird 34. So können Organoide von erkrankten tierärztlichen Patienten isoliert und verwendet werden, um die Wirkung verschiedener Krankheitsprozesse (z. B. chronische Darmentzündung) auf die orale Arzneimittelpermeabilität von Hunden zu modellieren19,36. Das intestinale Organoidsystem des Hundes kann auch in anderen Umgebungen als Medikamentenpermeabilitätsexperimenten verwendet werden. Diese 3D-Strukturen können auch von erkrankten Patienten isoliert werden, wie zuvor von Chandra et al. für entzündliche Darmerkrankungen, kolorektale Adenokarzinome und gastrointestinale Stromatumoren19 beschrieben.
Das Permeable Support Seeding Protocol beschreibt Verfahren zur Etablierung von intestinalen Organoidkulturen bei Hunden in den Einsätzen. Dieses erste Protokoll beschreibt Methoden zur Dissoziierung etablierter Organoidkulturen bei Hunden, die in der extrazellulären Membranmatrix plattiert sind. Weiterhin wird in diesem Protokoll die Vorbeschichtung der Einsätze mit Kollagen I und der extrazellulären Membranmatrix diskutiert. Die Einbettung von Hundeorganoiden in die durchlässigen Stützeinsätze wird ebenfalls ausführlich beschrieben.
Das zweite Protokoll ist das Monolayer Maintenance Protocol, das die allgemeine Wartung von 3D-Organoiden bei Hunden umfasst, die in einem Einsatz plattiert sind. Die Häufigkeit und das Volumen der Organoidmedien, die zur Auffrischung der Kultur verwendet werden, und Möglichkeiten zur Verhinderung von Zellkulturschäden werden in diesem zweiten Protokoll zusammen mit experimentellen Methoden zur Beurteilung des Zusammenflusses der epithelialen Monoschicht vorgestellt.
Schließlich konzentriert sich das Permeability Experimental Protocol auf Möglichkeiten, um festzustellen, ob die 3D-Organoide des Hundedarms in einem Permeabilitätsassay für den experimentellen Einsatz bereit sind, und auf die Verifizierungsschritte, die vor der Durchführung eines Experiments erforderlich sind. Dieser Abschnitt beschreibt auch den Aufbau und die erfolgreiche Durchführung eines Permeabilitätsexperiments sowie die Inkubation und Probenahme von therapeutischen Wirkstoffkandidaten in den Kammern der Monolayer-Kultur. Die Verwendung des Fluoresceinisothiocyanats mit geringer Permeabilität (FITC-Dextran) zur Überwachung der Integrität der Monoschicht wird ebenfalls diskutiert. Abschließend wird eine in vitro Evaluationsmethode zur Validierung der Ergebnisse nach Abschluss eines Experiments beschrieben. Permeabilitätsexperimente sind ein äußerst umfangreiches Thema und werden von Hubatsch et al.37 sehr gut zusammengefasst. Der Workflow der Protokolle ist in Abbildung 2 zusammengefasst.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63612/63612fig01.jpg"> Abbildung 1: Darmorganoide bei Hunden auf einem durchlässigen Stützsystem. Der durchlässige Stützeinsatz befindet sich in einer Vertiefung einer 24-Well-Platte. Die mikroporöse Membran ermöglicht die Aussaat von dissoziierten Darmorganoiden bei Hunden, und diese Zellen bilden schließlich eine organoide 2D-Monoschicht. Diese Technologie ermöglicht den Zugriff sowohl auf die AP- als auch auf die BL-Seite der Monolayer. Organoides Medium wird sowohl in den AP- als auch in den BL-Kammern des durchlässigen Trägers eingeführt. Die Absorption (AP→BL) und Sekretion (BL→AP) des Wirkstoffkandidaten werden ebenso dargestellt wie zwei mögliche Arten des Arzneimitteltransports. Abkürzungen: AP = apikal; BL = basolateral. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/63612fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63612/63612fig02.jpg"> Abbildung 2: Workflow der organoiddurchlässigen Unterstützungsprotokolle für Hunde . Der durchlässige Stützeinsatz wird mit einer Mischung aus extrazellulärer Membranmatrix und Kollagen I vorbeschichtet und für 1 h inkubiert. Während des Inkubationsprozesses wird die Organoidkultur dissoziiert. Einzelne Organoidzellen werden im Insert ausgesät, Medium in der Basolateralkammer wird unmittelbar nach der Aussaat zugegeben, während Medium in die apikale Kammer 24 h nach Abschluss des Aussaatprozesses gegeben wird. Die Wartung und Überwachung der Organoide umfasst regelmäßige Mediumswechsel, TER-Wertmessungen und Lichtmikroskopie zur Bewertung der Integrität der Monoschicht. Vor dem Experiment müssen die Organoide unterschieden werden, indem ROCK-Inhibitor und GSKiβ aus dem Medium entfernt werden. Die TEER-Werte werden am Tag des Experiments gemessen und die Organoid-Monoschicht lichtmikroskopisch auf Schäden an den Zellen untersucht. Das Medium wird dann gegen einen geeigneten Puffer ausgetauscht und vor dem Experiment inkubiert. Der FITC-Dextran-Assay wird während der Darmpermeabilitätsexperimente39 als Marker für die Integrität der Monoschicht verwendet. TEER-Messungen werden nach dem Experiment durchgeführt, und die Lichtmikroskopie validiert die Ergebnisse nach 24 Stunden. Abkürzungen: TEER = transepithelialer elektrischer Widerstand; ROCK = rho-assoziierte Kinase; GSKiβ = Glykogensynthase-Kinase beta; F = Fluoreszenz. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/63612fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>

<table><tbody><tr><td><stark>Organoide Medien</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; ROCK-Inhibitor (Y-27632)</td><td>EMD Millipore Corp.</td><td>SCM 075</td><td></td></tr><tr><td>[Leu15]-Gastrin I human</td><td>Sigma</td><td>G9145-.5MG</td><td></td></tr><tr><td>A-83-01</td><td>PeproTech</td><td>9094360</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>B27 Supplement</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Corning</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>Glutaminersatz</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>VWR Life Science</td><td>J848-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Human R-Spondin-1</td><td>PeproTech</td><td>120-38-500UG</td><td></td></tr><tr><td>Maus EGF</td><td>PeproTech</td><td>315-09-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Maus Noggin</td><td>PeproTech</td><td>250-38-250UG</td><td></td></tr><tr><td>Maus Wnt-3a</td><td>PeproTech</td><td>315-20-10UG</td><td></td></tr><tr><td>N2 Nahrungsergänzungsmittel</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>N-Acetyl-L-Cystein</td><td>Sigma</td><td>A9165-25G</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamid</td><td>Sigma</td><td>N0636-100G</td><td></td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pm-1</td><td></td></tr><tr><td>SB202190 (P38-Inhibitor)</td><td>Sigma</td><td>S7067-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Stemolecule CHIR99021 (GSK3&beta;)</td><td>Reprocell</td><td>04-0004-base</td><td></td></tr><tr><td>TMS (Trimethoprimsulfat)</td><td>Sigma</td><td>T7883-5G</td><td></td></tr><tr><td><stark>Reagenzien</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Essigsäure, Glacial</td><td>Fisher Chemical</td><td>A38-500</td><td></td></tr><tr><td>alpha-D(+)-Glukose, 99+%, wasserfrei</td><td>Acros Organics</td><td>170080010</td><td></td></tr><tr><td>Zellwiederherstellungslösung</td><td>Corning</td><td></td><td></td>354253</tr><tr><td>Kollagen I, Rattenschwanz 3 mg/ml</td><td>Gibco</td><td>A10483-01</td><td></td></tr><tr><td>FITC-CM-Dextran</td><td>Millipore Sigma</td><td>68059-1G</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd (37%)</td><td>Fisher Chemical</td><td>F79P-4</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehydlösung</td><td>Sigma</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (1x)</td><td>Gibco</td><td>14025-076</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Matrix für Organoidkultur</td><td>Corning</td><td>356255</td><td>extrazelluläre Membranmatrix</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd, 97%</td><td>Alfa Aesar</td><td>A11313</td><td></td></tr><tr><td>PBS, 1x (phosphatgepufferte Kochsalzlösung)</td><td>Corning</td><td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Gibco</td><td>12604-021</td><td>Trypsin-ähnliche Protease</td></tr><tr><td><stark>Materialien und Ausrüstung</stark></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL Zentrifugenröhrchen</td><td>Corning</td><td>430766</td><td></td></tr><tr><td>9" Pasteur</td><td>Pipets Fisherbrand</td><td>13-678-6B</td><td></td></tr><tr><td>Corning Transwell 6,5 mm Polyester-Membraneinsätze Vorgeladen in 24-Well-Kulturplatten, Porengröße: 0,4 & Mikro; m, Steril</td><td>Corning</td><td>3470</td><td>Permeable</td></tr><tr><td>Support Millicell ERS (Sonden)</td><td>Millipore Sigma</td><td>MERSSTX01</td><td></td></tr><tr><td>Millicell ERS-2 Voltohmmeter</td><td>Millipore Sigma</td><td>MERS00002</td><td></td></tr><tr><td>Panasonic Inkubator</td><td>Panasonic</td><td>MCO-170ML-PA</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M Wrapping Film</td><td>Bemis Company Inc</td><td>PM996/EMD</td><td>Flexible Laborfolie</td></tr><tr><td>Gewebekulturplatte mit 24 Vertiefungen</td><td>Fisherbrand</td><td>FB012929</td><td></td></tr></tbody></table>

darmorganoide für hunde in einem durchlässigen zweikammer-trägersystem

Canine Intestinal Organoids in a Dual-Chamber Permeable Support System

Das permeable Trägersystem wird typischerweise in Verbindung mit traditionellen zweidimensionalen (2D) Zelllinien als In-vitro-Werkzeug zur Bewertung der oralen Permeabilität neuer therapeutischer Wirkstoffkandidaten verwendet. Die Verwendung dieser konventionellen Zelllinien hat jedoch Einschränkungen, wie die veränderte Expression von Tight Junctions, die partielle Zelldifferenzierung und das Fehlen wichtiger Kernrezeptoren. Trotz dieser Mängel sind die Caco-2- und MDCK-Modelle weithin akzeptiert und für die Vorhersage der oralen Permeabilität des Menschen in vivo validiert.
Hunde sind aufgrund ihrer Ähnlichkeiten in der gastrointestinalen Anatomie und der Darmflora mit dem Menschen ein relevantes translationales Modell für die biomedizinische Forschung. Dementsprechend und zur Unterstützung der parallelen Arzneimittelentwicklung ist die Ausarbeitung eines effizienten und genauen In-vitro-Tools zur Vorhersage von In-vivo-Arzneimittelpermeabilitätseigenschaften sowohl bei Hunden als auch bei Menschen sehr wünschenswert. Ein solches Werkzeug könnte das intestinale Organoidsystem des Hundes sein, das durch dreidimensionale (3D), selbstorganisierte Epithelstrukturen gekennzeichnet ist, die aus adulten Stammzellen stammen.
Das (1) Permeable Support Seeding Protocol beschreibt die experimentellen Methoden zur Dissoziation und Aussaat von Hundeorganoiden in den Einsätzen. Die Isolierung, Kultur und Ernte von Organoiden bei Hunden wurde zuvor in einer separaten Reihe von Protokollen in dieser Sonderausgabe beschrieben. Methoden zur allgemeinen Erhaltung der intestinalen Organoid-Monoschicht des Hundes werden im (2) Monolayer Maintenance Protocol ausführlich diskutiert. Darüber hinaus beschreibt dieses Protokoll Methoden zur Beurteilung der strukturellen Integrität der Monoschicht durch transepitheliale elektrische Widerstandsmessungen (TEER) und Lichtmikroskopie. Schließlich beschreibt das (3) Permeability Experimental Protocol die Aufgaben, die einem Experiment direkt vorausgehen, einschließlich der In-vitro-Validierung der experimentellen Ergebnisse.
Insgesamt überwindet das Organoidmodell für Hunde, kombiniert mit einer Zweikammer-Zellkulturtechnologie, die mit experimentellen 2D-Modellen verbundenen Einschränkungen und verbessert dadurch die Zuverlässigkeit der Vorhersagen der scheinbaren oralen Permeabilität therapeutischer Arzneimittelkandidaten sowohl beim Hund als auch beim menschlichen Patienten.

Standardarbeitsanweisungen für die Kultur von Canine-Organoiden wurdenzuvor 33 beschrieben, und das Canine Organoid Protocol wurde auch in dieser Sonderausgabe38 ausführlich diskutiert. Hundeintestinale Organoide, die auf durchlässigen Stützen kultiviert wurden, wurden fixiert und in Paraffin eingebettet, um die Mikroanatomie der Monoschicht und der Zellpopulationen zu untersuchen. Der Paraffin-Einbettungsprozess wurde zuvor von Gabriel et al.38 diskutiert. Es wurde eine routinemäßige Färbung (Hämatoxylin und Eosin) durchgeführt, und die Alcian Blue-Färbetechnik wurde verwendet, um Becherzellen in der organischen Monoschicht des Hundes nachzuweisen (siehe Abbildung 7).
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63612/63612fig07.jpg"> Abbildung 7: Einschichtige Organoid-Monolayer-Färbung des Darms bei Hunden. Hundeintestinale Organoide kolonialen Ursprungs in der durchlässigen Stütze wurden in Paraffin eingebettet und mit H &amp; E und AB gefärbt. Repräsentative Bilder wurden mittels Lichtmikroskopie bei 40-facher (A) und 60-facher (B) Vergrößerung aufgenommen. Die H &amp; E-Färbung zeigt eine säulenförmige Epithel-Monoschicht, und die Mikrovilli im apikalen Teil der Zellen können bei 60-facher Vergrößerung beobachtet werden. Die AB-Färbung enthüllt das Vorhandensein von Kelchzellen (dunkelblau) in der Organoid-Monoschicht des Hundedarms. Maßstabsstäbe = 20 μm (A), 50 μm (B). Abkürzungen: H&amp;E = Hämatoxylin und Eosin; AB = Alcian Blau. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/63612fig07large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
Die Organoidkultur auf dem permeablen Träger sollte für 10 bis 14 Tage gezüchtet werden, um für ein Permeabilitätsexperiment bereit zu sein. Die Lichtmikroskopie wird in Verbindung mit TER-Wertmessungen eingesetzt, um die Bereitschaft der Organoidkultur für Permeabilitätstests von Wirkstoffkandidaten zu bestätigen. Repräsentative lichtmikroskopische Aufnahmen verschiedener intestinaler Organoid-Monoschichten von gesunden und kranken Tieren sind in Abbildung 8 dargestellt.
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63612/63612fig08.jpg"> Abbildung 8: Canine intestinal organoid monolayer microscopy. Bilder von wachsenden Monolayern, wie sie unter Lichtmikroskopie zu sehen sind. Organoid-Monoschichten, die von gesunden Spendern stammen, werden durch jejunale enteroide (10x; 40x) und colonoide (20x; 40x) Kulturen dargestellt. Organoide Monoschichten erkrankter Spender werden durch zwölffingerdarmige (5x; 10x) und ileale (5x; 10x) Enteroide dargestellt, die von einem Hundepatienten stammen, bei dem PLE diagnostiziert wurde. Beide PLE-Organoidkulturen sind Beispiele für eine unsachgemäße Zellisolierung während der Aussaat von Organoiden, und diese Kulturen konnten aufgrund des Vorhandenseins von 3D-Organoiden nicht für Wirkstoffpermeabilitätstests verwendet werden. Beispiele für Abweichungen von der richtigen Monolayer-Bildung, wie z.B. Monolayer-Risse (5x), werden durch unvorsichtige Manipulation der biologischen Proben verursacht. Die verlängerte Kultur von Organoiden (10x; 20x) wird durch die lange Aufrechterhaltung der Organoide auf dem Einsatz verursacht, wenn die Organoide beginnen, ihrer ursprünglichen 3D-Struktur zu ähneln. Zum Vergleich werden Bilder von traditionellen 2D-Zelllinien auf den permeablen Trägern gezeigt, die üblicherweise für Arzneimittelpermeabilitätsstudien verwendet werden (MDCK-10x; 40x und Caco-2-10x; 20x). Abkürzungen: PLE = proteinverlierende Enteropathie; MDCK = Madin-Darby-Hundeniere. Maßstäbe = 500 μm (5x), 200 μm (10x), 100 μm (20x), 50 μm (40x). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/63612fig08large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
Organoid-Monoschichten wurden auch in 3% Paraformaldehyd-3% Glutaraldehyd in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) fixiert. Die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) wurde verwendet, um die Ultrastruktur der Organoidkultur auf den durchlässigen Trägern zu charakterisieren. Mikroanatomische Strukturen von Mikrovilli und Tight Junctions sind in Abbildung 9 zu sehen.
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63612/63612fig09.jpg"> Abbildung 9: TEM-Bilder von gesunden intestinalen Organoid-Monoschichten bei Hunden. TEM wurde verwendet, um die zelluläre Mikroarchitektur von jejunalen (A), ilealen (B) und kolonen (C) organoiden Monoschichten aufzudecken. Die mikroporöse Membran des durchlässigen Stützeinsatzes ist mit einem gelben Pfeil gekennzeichnet. Das Vorhandensein von Mikrovilli (blauer Pfeil) und Tight Junctions (roter Pfeil) ist in den Bildern dargestellt. Abkürzung: TEM = Transmissionselektronenmikroskopie. Maßstabsstäbe = 5 μm (A), 2 μm (B, C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/63612fig09large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
Sowohl TER-Messungen als auch Lichtmikroskopie sollten durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass das System für Permeabilitätstests bereit ist. Der Assay ist einsatzbereit, wenn TEER einen stationären Zustand erreicht, während die Lichtmikroskopie dazu beiträgt, Schäden oder Überwucherungen der Organoide auszuschließen. Eine Zusammenfassung typischer TEER-Messungen von fünf Gruppen, bestehend aus kaninen jejunalen Enteroiden und Kolonoiden, ist in Abbildung 6 dargestellt.
Tabelle 1: Zusammensetzung der Organoidmedien und FAA. Die vollständige Zusammensetzung von CMGF+, CMGF+ R/G und FAA ist in dieser Tabelle zusammengefasst. Abkürzungen: ROCK = rho-assoziierte Kinase; GSKiβ = Glykogensynthase-Kinase beta; CMGF + R/G = Vollständiges Medium mit Wachstumsfaktoren, angereichert mit ROCK-Inhibitor und GSKiβ; CMGF+ = Vollständiges Medium mit Wachstumsfaktoren, aber ohne ROCK-Inhibitor oder GSKiβ; FAA = Formalin-Essigsäure-Alkohol; EGF = epidermaler Wachstumsfaktor. Diese Tabelle ist von 38 adaptiert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/Table%201%20(8).xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>
Ergänzende Tabelle 1: Tabelle für die Notizen zum Organoid von Hunden, dem durchlässigen Unterstützungssystem. Abkürzungen: TEER = transepithelialer elektrischer Widerstand; ROCK = rho-assoziierte Kinase; GSKiβ = Glykogensynthase-Kinase beta; CMGF + R/G = Vollständiges Medium mit Wachstumsfaktoren, angereichert mit ROCK-Inhibitor und GSKiβ; CMGF+ = Vollständiges Medium mit Wachstumsfaktoren, aber ohne ROCK-Inhibitor oder GSKiβ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63612/Supplementary%20Table%201%20(1).xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das die Kultur der Darmorganoide von Hunden in einem durchlässigen Zweikammer-Stützsystem beschreibt. Die organoide Aussaat in den durchlässigen Trägern, die Monolayer-Wartung und nachfolgende Wirkstoffpermeabilitätsexperimente werden beschrieben.

Darmorganoide für Hunde in einem durchlässigen Zweikammer-Trägersystem

The permeable support system is typically used in conjunction with traditional two-dimensional (2D) cell lines as an in vitro tool for evaluating the oral ...

Die Kombination aus caniner Organoid-Technologie und einem permeablen Stützsystem mit zwei Kammern überwindet die Einschränkungen experimenteller 2D-Zelllinien, die traditionell in biomedizinischen Forschungsmodellen verwendet werden. Die Technologie kann die Zuverlässigkeit von Vorhersagen über die scheinbare orale Permeabilität von therapeutischen Wirkstoffkandidaten sowohl bei Hunden als auch bei menschlichen Patienten erhöhen. Das System kann auf andere Bereiche der biomedizinischen Forschung angewendet werden, einschließlich der mikrobiologischen Forschung, Studien zur Virusaufnahme, Arzneimittelwechselwirkungen und Arzneimitteltransportmechanismen. Die Standardisierung, die detaillierte Dokumentation der experimentellen Abläufe und die konsequente Überwachung der Zellmonoschichten sind entscheidende Praktiken, die für die permeablen Stützassays erforderlich sind. Lege die extrazelluläre Membranmatrix auf Eis, um mit dem Auftauen zu beginnen. Tauchen Sie es in Eis, um es vor schnellem Auftauen zu schützen und eine Verfestigung zu vermeiden. Eine gekühlte Zentrifuge auf 4 Grad vorkühlen

canine-intestinal-organoids-in-a-dual-chamber-permeable-support-system

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Experimentelle Methoden zur Gewinnung adulter Stammzellen aus dem Darm- und Lebergewebe von Hunden zur Etablierung von 3D-Organoidkulturen werden beschrieben. Darüber hinaus werden die Labortechniken diskutiert, um ein konsistentes Wachstum zu gewährleisten und Standardarbeitsanweisungen für die Ernte, Biobank und Wiederbelebung von Darm- und Leberorganoidkulturen bei Hunden bereitzustellen.

Standardisierung und Pflege von 3D-Organoidkulturen bei Hunden für den Einsatz in der biomedizinischen Forschung

Biopsie-abgeleitete Darmorganoide und Organ-on-a-Chips-Technologien werden zu einer mikrophysiologischen Plattform kombiniert, um die regionsspezifische Darmfunktionalität zu rekapitulieren.

Kombination von menschlichen Organoiden und Organ-on-a-Chip-Technologie zur Modellierung der intestinalen regionsspezifischen Funktionalität

Die Integration von caninen Darmorganoiden und einem mikrofluidischen Gut-on-a-Chip-System bietet relevante translationale Modelle für menschliche Darmerkrankungen. Die vorgestellten Protokolle ermöglichen eine 3D-Morphogenese und eine dynamische In-vitro-Modellierung des Darms und helfen so bei der Entwicklung wirksamer Behandlungen für Darmerkrankungen bei Hunden und Menschen mit One Health.

Dreidimensionale Morphogenese im Darm-on-a-Chip von Hunden unter Verwendung von Darmorganoiden, die von Patienten mit chronisch entzündlichen Darmerkrankungen stammen

Diese Studie stellt ein Protokoll zur Generierung von 2D-Monoschichten des Rinderdarms aus Organoiden vor, das einen verbesserten Zugang zur Untersuchung von Wirt-Pathogen-Interaktionen bietet. Es umfasst Methoden zur Bewertung der Membranintegrität und -funktionalität und entwickelt In-vitro-Modelle weiter, die die Magen-Darm-Physiologie von Rindern nachahmen. Dieser Ansatz verspricht erhebliche biomedizinische und landwirtschaftliche Vorteile, einschließlich verbesserter Behandlungsstrategien.

Fortschritte in der Rinder-Organoid-Technologie unter Verwendung von Dünn- und Dickdarm-Monolayer-Grenzflächen

Diese Studie skizziert ein Protokoll zur Erzeugung von 2D-Monolayern von Schweineorganoiden, die aus dem Dünn- und Dickdarm stammen. Das Wachstum dieser Monoschichten ist durch steigende TEER-Werte gekennzeichnet, was auf eine robuste epitheliale Integrität hinweist. Darüber hinaus zeigten diese Monoschichten physiologische sekretorische Reaktionen in Ussing-Kammerexperimenten nach der Anwendung von Forskolin.

Zweidimensionale Organoide des Schweine-Darms, die die physiologischen Eigenschaften des nativen Darms widerspiegeln

Wir berichten Entwicklung einer negativen Auslese-System...

Entwicklung eines Negativ Selektionsmarker für Entamoeba histolytica</em

Wir skizzieren Methoden für die effiziente und schnelle Isolierung / Kultur lebensfähiger Mikroglia aus dem Neugeborenen Hirnrinde und erwachsenen Rückenmark. Die Präparation und Beschichtung der kortikalen Mikroglia kann innerhalb von 90 Minuten erreicht werden, mit der anschließenden Mikroglia Ernte stattfindet ~ 10 Tage nach der ersten Sektion.

Kultivierung Mikroglia aus dem Neugeborenen und Erwachsenen Central Nervous System

Hier wird ein Protokoll zu ernten, zu pflegen und zu behandeln Maus kleine Darm-Organoide mit pathogen associated molecular patterns (PAMPs) und Listeria monocytogenes beschrieben, sowie Betonung auf die Genexpression und die richtige Normalisierungstechniken für Protein.

Das<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Kultur und Mustererkennung Rezeptor-Stimulation von Maus-Darm-Organoide

Hier wird ein Verfahren zur Herstellung einer permeablen Membran insert-basierten Infektionssystem die Auswirkungen von Streptolysin S zu untersuchen Verwendung eines sezernierten Toxin produziert von Gruppe A Streptococcus, auf Keratinozyten beschrieben. Dieses System kann leicht auf die Untersuchung von anderen sezernierten bakteriellen Proteinen auf verschiedenen Wirtszelltypen während der Infektion angewendet werden.

Implementierung eines Systems durchlässige Membran Insert-basierten Infektion der Auswirkungen von sekretierten bakteriellen Toxins zur Untersuchung auf Säugetierwirtszellen

Neutrophile extrazelluläre Fallen (NETs) sind Netzwerke von DNA, Histone und Neutrophilen-Proteine. Obwohl eine Komponente der angeborenen Immunantwort sind NETs in Autoimmun- und Thrombose beteiligt. Dieses Protokoll beschreibt ein einfaches Verfahren zur Hunde- Neutrophilen Isolierung und Quantifizierung von NETs Mikrotiterplatten-Fluoreszenztest verwendet wird.

Eine einfache Fluoreszenztest zur Quantifizierung von Canine Neutrophil Extracellular Einklemmschutz

Erfahren Sie die Kultivierung von Darmorganoiden bei Hunden in einem durchlässigen Zweikammer-Trägersystem. Diese Methode verbessert die Vorhersage der oralen Arzneimittelpermeabilität und liefert zuverlässigere Ergebnisse als herkömmliche 2D-Zelllinien.

Darmorganoide für Hunde in einem durchlässigen Zweikammer-Trägersystem

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