Cancer Research
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
بروتوكول ما قبل التحليل المسبق للخزعة السائلة الموحدة لتطبيقات الحمض النووي الخالية من التداول في المراحل النهائية
Chapters
Summary September 16th, 2022
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
لقد أحدثت الخزعة السائلة ثورة في نهجنا في الدراسات الانتقالية لعلم الأورام ، حيث يعد جمع العينات وجودتها وتخزينها خطوات حاسمة لتطبيقها السريري الناجح. هنا نصف بروتوكولا موحدا ومعتمدا لتطبيقات الحمض النووي الخالية من التداول في المراحل النهائية والتي يمكن تطبيقها في معظم مختبرات الأبحاث الانتقالية.
Transcript
هذا بروتوكول قياسي لمعالجة وتخزين عينات الدم لتطبيقات الخزعة السائلة في المصب على أساس تعميم الحمض النووي الحر. هذا هو أول بروتوكول قياسي يتم نشره ، على الرغم من أن هذه التقنية كانت قيد الاستخدام لعدة سنوات. من السهل اتباعها مع المعدات القياسية المتوفرة في معظم المختبرات الانتقالية أو العلمية.
ويمكن لجميع موظفي المختبر تنفيذ البروتوكول. يساعد البروتوكول على توحيد كيفية جمع العينات وتخزينها ، مما سيؤثر في النهاية في العيادة ويقلل من التباين بين المراكز المختلفة التي تجري نفس التحليل النهائي أو ما شابهه حيث تكون الدقة ذات أهمية قصوى. هذه الطريقة مفيدة بشكل خاص في أبحاث الأورام وأيضا في التطبيقات السريرية.
ومع ذلك ، يمكن تطبيقه أيضا في أمراض أخرى غير سرطانية حيث يتم استخدام الخزعة السائلة أيضا. بعد أن يتم طرد عينة الدم مركزيا ، قد يكون من الصعب معرفة كمية البلازما أو المصل المطلوب إزالتها ، ولكن اتباع هذه الإرشادات المحددة سيساعد في ذلك. من السهل جدا اتباع بقية البروتوكول مع خبرة محدودة في المختبر.
سيوضح الإجراء خورخي ، وهو فني من مختبرنا. للبدء ، قم بالطرد المركزي للأنبوب الذي يحتوي على دم طازج في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق عند 1600 مرة غرام ، مع تطبيق الحد الأقصى للكسر. قم بإزالة الأنبوب بعناية من جهاز الطرد المركزي.
ستظهر المرحلة العليا من supernatant المصل واضحة ومصفرة. تحقق مما إذا كانت العينة تظهر علامات انحلال الدم وسجل وجود انحلال الدم عند الاقتضاء. في خزانة السلامة الأحيائية من الفئة الثانية ، انقل المصل إلى أنابيب التجميع كأليكوتات سعة 250 ميكرولتر.
يجب تسمية الأليكوتات بشكل صحيح. قم بتجميد المصل على الفور في وضع مستقيم في صندوق التخزين عند 80 درجة مئوية تحت الصفر ، وسجل وقت تخزين العينة. تحقق من معالجة العينات خلال الإطار الزمني المطلوب البالغ أربع ساعات.
قم بطرد مركزي لأنبوب EDTA في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق عند 1600 مرة جم ، مع تطبيق الحد الأقصى للكسر. بعد الطرد المركزي ، سيظهر السوبرنات البلازما واضحا ومصفرا. تحقق مما إذا كانت العينة تظهر علامات انحلال الدم ونقل البلازما إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 ملليلتر دون إزعاج الطبقة الخلوية باستخدام ماصة مصلية يمكن التخلص منها.
اترك كمية صغيرة متبقية من البلازما فوق طبقة الخلية عند حوالي خمسة ملليمترات. إذا لوحظ انحلال الدم ، فتجاهل العينة لمزيد من التحليل. جهاز طرد مركزي للبلازما وأنبوب طرد مركزي سعة 15 ملليلتر لإزالة أي خلايا دم سليمة متبقية تم نقلها من خطوة الطرد المركزي الأولى.
قم بإزالة الأنبوب بعناية من جهاز الطرد المركزي ، وليس بيليه الخلية في الجزء السفلي من الأنبوب ، وانقل واحدا إلى أربعة ملليلترات من البلازما إلى واحد إلى أربعة ملليلتر من البولي بروبيلين المبرد أو Eppendorfs باستخدام ماصة مصلية يمكن التخلص منها. يجب ترك الحجم المتبقي من البلازما في أسفل الأنبوب لتجنب تلويث البلازما بخلايا الدم. قم بتجميد البلازما على الفور في وضع مستقيم في صندوق التخزين عند 80 درجة مئوية تحت الصفر ، وسجل وقت تخزين العينة.
تحقق من أن العينات قد تم تصنيفها بشكل صحيح وتمت معالجتها خلال الإطار الزمني المطلوب لمدة أربع ساعات. جمع الطبقة الخلوية باستخدام P1000 وطرف مصفى ونقلها إلى أنبوب 2 ملليلتر. تجمد على الفور وتخزينها في درجة حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر.
يظهر هنا مثال على استخراج cfDNA عالي الجودة الذي يمكن استخدامه في التطبيقات النهائية ، في حين تمثل هذه الصورة الرسومية مثالا على عينة غير مناسبة ذات مستوى عال من التلوث الجينومي. يجب أن يكون جزء البلازما أو المصل أصفر اللون. قد يختلف هذا اعتمادا على العينة الفردية.
يجب التخلص من العينات المصابة بانحلال الدم. احرص على عدم إزالة أي حبيبات خلية عند إزالة جزء البلازما. يمكن أيضا استخدام هذا البروتوكول في تطبيقات أخرى قائمة على الأحماض النووية والبروتينات ، مثل الكشف عن الحمض النووي الريبي غير المشفر أو البروتينات في عينات المصل والبلازما باستخدام تقنيات الكشف المناعي.
هذه تقنية قياسية للغاية تستخدم في العديد من المختبرات. يساعد هذا البروتوكول الباحثين على توحيد كيفية إجراء تحليلنا لأن هذا جانب حاسم وضروري للتطبيقات السريرية المستقبلية.
Related Videos
Sie haben unter Umständen bereits Zugriff auf diese Inhalte!
Bitte geben Sie Ihre institutionelle Emailadresse ein, um Ihren Zugriff zu überprüfen.
hat Zugriff auf
Bitte erstellen Sie einen Account, um Zugriff auf dieses Video zu erhalten.
Melden Sie sich an, um auf JoVE zuzugreifen
Please login to your JoVE account to get access
Wir verwenden / speichern diese Informationen, um sicherzustellen, dass Sie über einen ordnungsgemäßen Zugriff verfügen und Ihr Konto sicher ist. Wir können diese Informationen verwenden, um Ihnen Benachrichtigungen über Ihr Konto, Ihren institutionellen Zugang und / oder andere verwandte Produkte zu senden. Um mehr über unsere GDPR-Richtlinien zu erfahren, klicken Sie hier.
Wenn Sie weitere Informationen zur Datenspeicherung wünschen, wenden Sie sich bitte an gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
Wir verwenden / speichern diese Informationen, um sicherzustellen, dass Sie über einen ordnungsgemäßen Zugriff verfügen und Ihr Konto sicher ist. Wir können diese Informationen verwenden, um Ihnen Benachrichtigungen über Ihr Konto, Ihren institutionellen Zugang und / oder andere verwandte Produkte zu senden. Um mehr über unsere GDPR-Richtlinien zu erfahren, klicken Sie hier.
Wenn Sie weitere Informationen zur Datenspeicherung wünschen, wenden Sie sich bitte an gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Füllen Sie das Formular aus, um Ihre kostenlose Testversion anzufordern.
Wir verwenden / speichern diese Informationen, um sicherzustellen, dass Sie über einen ordnungsgemäßen Zugriff verfügen und Ihr Konto sicher ist. Wir können diese Informationen verwenden, um Ihnen Benachrichtigungen über Ihr Konto, Ihren institutionellen Zugang und / oder andere verwandte Produkte zu senden. Um mehr über unsere GDPR-Richtlinien zu erfahren, klicken Sie hier.
Wenn Sie weitere Informationen zur Datenspeicherung wünschen, wenden Sie sich bitte an gdpr@jove.com.
Vielen Dank
Ein JoVE-Vertreter wird sich in Kürze mit Ihnen in Verbindung setzen.
Vielen Dank
Sie haben bereits eine Testversion angefordert und ein JoVE-Vertreter wird sich in Kürze mit Ihnen in Verbindung setzen. Wenn Sie sofortige Hilfe benötigen, senden Sie uns bitte eine E-Mail an subscriptions@jove.com .
Vielen Dank
Genießen Sie eine kostenlose 2-stündige Testversion. Um zu beginnen, melden Sie bitte an.
Vielen Dank
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
