Erstellung eines Kniegelenk-on-a-Chips zur Modellierung von Gelenkerkrankungen und zur Erprobung von Medikamenten

Unsere Fähigkeit, genau vorherzusagen, wie Menschen während klinischer Studien auf Medikamente reagieren, ist aufgrund des Mangels an physiologisch relevanten präklinischen Modellen begrenzt. Dieses mikrophysiologische System kann diese Diskrepanz beheben. Dieses aus menschlichen Zellen gewonnene System ahmt die gesamte Art der Gelenkerkrankung der Arthrose im menschlichen Knie genau nach, was das Testen von krankheitsmodifizierenden Arthrosemedikamenten vor klinischen Studien ermöglicht, wodurch möglicherweise Millionen von Dollar eingespart werden.

Beginnen Sie mit der Zubereitung von Methacrylgelatine oder GelMA, indem Sie 17 Gramm Gelatine Typ B zu 500 Millilitern destilliertem Wasser hinzufügen. Mischen Sie es 30 Minuten lang auf einem Shaker bei 37 Grad Celsius und fügen Sie 13 Milliliter Methacrylanhydrid hinzu, bevor Sie es über Nacht auf einem Shaker mischen. Bereiten Sie am nächsten Tag ca. 60 Milliliter Aliquot des GelMA in Dialysebeutel vor.

Legen Sie alle Dialysebeutel sieben Tage lang in destilliertes Wasser mit einem Rührstab. Wechseln Sie das Wasser mehrmals täglich und lassen Sie die Beutel über Nacht bei vier Grad Celsius stehen. Gießen Sie das GelMA am siebten Tag in eine Schüssel und frieren Sie es vor der Gefriertrocknung bei minus 80 Grad Celsius ein.

Anschließend wird das GelMA lyophilisiert, indem man es in die Vakuumkammer eines Lyophilisators legt. Stellen Sie sicher, dass Sie vor der Entnahme aus dem Gefriertrockner vollständig getrocknet werden. Als nächstes löst man das lyophilisierte GelMA in Hanks' ausgewogener Salzlösung bei einer Konzentration von 15 % auf und stellt den pH-Wert mit einer kleinen Menge Natriumhydroxid auf 7,4 ein.

Ergänzen Sie die Lösung auf der Grundlage des aufgenommenen Volumens mit einem Antibiotikum Antimykotikum und 0,15 % Lithiumphenylphosphinat oder LAP. Schützen Sie die GelMA-Lösung vor Licht und lagern Sie sie bis zur weiteren Verwendung bei minus 20 Grad Celsius. Autoklav 3D-gedruckte Dual-Flow-Bioreaktorkammern, Deckel und Einsätze in Autoklavenbeuteln bei 121 Grad Celsius für 20 Minuten mit Dampf.

Und dann für 20 Minuten bei trockener Hitze. Nach der Sterilisation werden die Kammern, Deckel und Einsätze des Bioreaktors über Nacht in 15 Millilitern sterilem PBS in der Biosicherheitswerkbank eingeweicht, gefolgt von einer vollständigen Trocknung. Mit einer 1000-Mikroliter-Pipette resuspendieren Sie 20 mal 10 mesenchymale Stammzellen (MSCs) aus menschlichem Knochenmark pro Milliliterzellen in einer 15%igen GelMA-Lösung.

Drücken Sie dann eine sterile, trockene Silikonform mit sterilen Handschuhen gegen eine Petrischale. Setzen Sie mit einer Pinzette einen Einsatz in jedes Loch der Silikonform ein, wobei die Lochseite des Einsatzes nach unten zeigt. Wenn Sie fertig sind, fügen Sie mit einer 200-Mikroliter-Pipette etwa 50 Mikroliter der Zellsuspension pro Einsatz hinzu.

Vernetzen Sie das Gel im Inneren des Einsatzes, indem Sie die Oberseite 1,5 Minuten lang einer UV-Taschenlampe mit einer Wellenlänge von 395 Nanometern aussetzen und dann die andere Seite 30 Sekunden lang beleuchten. Übertragen Sie die Einsätze mit einer sterilen Pinzette sofort in acht Milliliter Wachstumsmedium in einer Nicht-Gewebekultur-Sechs-Well-Platte und lassen Sie die Zellen über Nacht erholen. Um die Differenzierung des Fettgewebes einzuleiten, überführen Sie die Einsätze in acht Milliliter adipogenes Medium und kultivieren Sie sie 28 Tage lang mit täglichem Mediumwechsel.

Um die osteochondralen Einheiten zu konstruieren, platzieren Sie die Einsätze in Bioreaktorkammern mit zwei Strömen, verschließen Sie die Vertiefungen und infundieren Sie die beiden Ströme separat mit einer Durchflussrate von fünf Mikrolitern pro Minute mit 35 Millilitern osteogenem Medium und 35 Millilitern chondrogenem Medium. Halten Sie die Zellen für die Differenzierung für 28 Tage aufrecht, indem Sie alle zwei Wochen Spritzenwechsel mit den jeweiligen Medientypen durchführen. Um die Fibroblasten abzuleiten, differenzieren Sie die MSCs in 2D-Kultur in einem 150 Quadratzentimeter großen T-Gewebezellkulturkolben mit 20 Millilitern fibrogenem Medium für 21 Tage.

Pflegen Sie den wöchentlichen Wechsel des Mediums. Verwenden Sie nach 21 Tagen vier Milliliter Trypsin, um die Zellen abzulösen. Verkapseln Sie die 3D-Gele in den Einsätzen.

Um synovial-ähnliches fibröses Gewebe (SFT) zu erhalten, befolgen Sie ein ähnliches Protokoll. Verbinden Sie den Silikonschlauch mit einem Innendurchmesser von 0,062 Zoll und einem Außendurchmesser von 0,125 Zoll an einem Ende mit der Minijoint-Bioreaktorstange und am anderen Ende mit den Köderverriegelungsanschlüssen F 1/16. Autoklavieren Sie dann die 3D-Minijoint-Bioreaktoren zusammen mit den Silikonschläuchen und -deckeln.

Bereiten Sie 35 Milliliter Nährmedium vor, das für die Minijoint-Kultur verwendet werden soll, und laden Sie es in die Mediumreservoirs. Verwenden Sie eine gerade Pinzette, um die osteochondralen Einheiten aus dem Dual-Flow-Bioreaktor in die rechte Vertiefung des Minijoint-Bioreaktors zu übertragen. Übertragen Sie den Fettgewebeeinsatz und den Fasergewebeeinsatz in die linke bzw. mittlere Vertiefung, bevor Sie alle Vertiefungen mit sterilisierten Deckeln abdecken.

Verbinden Sie die Minijoint-Clip-Einlässe mit den Medium-Reservoirs und die Auslässe mit Spritzen. Montieren Sie dann die Spritzen auf einer Spritzenpumpe. Bringen Sie die Pumpe und die Späne in einen Inkubator.

Stellen Sie die mittleren Behälter außerhalb des Inkubators auf Eis. Betreiben Sie die Pumpe im Entnahmemodus und saugen Sie das Medium aus dem Mediumreservoir in die Minijoint-Bioreaktorkammer. Setzen Sie diesen Minijoint-Kulturprozess 28 Tage lang fort.

Um die Gelenkentzündung und Knorpeldegeneration zu modellieren, fügen Sie dem fibrogenen Mediumstamm sieben Tage lang Interleukin mit 10 Nanogramm pro Milliliter hinzu. Stellen Sie sicher, dass Sie die Spritze am dritten Tag austauschen, bevor Sie frisches Interleukin ein Beta in das fibrogene Medium geben. Für die Arzneimitteltests wird das Medikament nach dreitägiger Interleukin-Ein-Beta-Behandlung entweder im gemeinsam genutzten Medium verabreicht, um eine intraartikuläre Verabreichung zu simulieren, oder in allen Medientypen, um eine systemische Verabreichung zu simulieren.

Sammeln Sie nach siebentägiger Interleukin-Ein-Beta-Behandlung einzelne Gewebe für die Analyse. Nachdem Sie die Einsätze mit einer sterilen Pinzette entfernt haben, drücken Sie eine Biopsienstanze durch die Mitte des Einsatzes, um das Gel zu entfernen und das Gel in PBS zu legen. Als nächstes schneiden Sie die osteochondralen Gele in zwei Hälften, während Sie die Genexpression beurteilen.

Sammeln und zentrifugieren Sie ca. 1,5 Milliliter Medien aus jeder Medienquelle bei 14.000 g für 10 Minuten. Nachdem Sie das Sediment verworfen haben, frieren Sie das konditionierte Medium in flüssigem Stickstoff ein. Für die histologische Färbung und Immunfärbung wird zunächst das osteochondrale und synovialartige fibröse Gewebe (SFT-Proben) in 10%igem gepuffertem Formalin fixiert und in Ethanol aufsteigender Konzentrationen dehydriert.

Löschen Sie die Probe in Xylol, betten Sie sie in Paraffin ein und schneiden Sie die Proben schließlich in sechs Mikrometer Dicke. Im Falle von Fettgewebe werden die 10%igen gepufferten formalen und fixierten Proben direkt mit ölroter O-Lösung oder BODIPY gefärbt. Die gewebespezifischen Phänotypen waren für die einzelnen Mikrogewebe gut erhalten.

Alle Gewebe des Minigelenks wurden gesammelt, um ihre Phänotypen nach 28-tägiger Kultivierung zu analysieren. Die knöcherne Komponente des Mikrogewebes der osteochondralen Einheiten exprimierte hohe Konzentrationen von Osteocalcin. Im Knorpelanteil des Osteochondren exprimierte das Gewebe signifikant hohe Konzentrationen von Kollagen Typ zwei und Aggrecan.

Die Expressionsniveaus der repräsentativen adipogenen Gene, Adiponektin und Leptin, waren im Fettgewebe höher. Die Ablagerung von Calciummineralien, alkalischer Phosphatase und Osteocalcin-Protein wurde vor allem in der Knochengröße von osteochondralen Mikrogeweben beobachtet. Die Knorpelseite des osteochondralen Gewebes zeigte gut retinierte Glykosaminoglykane und Kollagen Typ zwei.

Die Expression der mit der Knorpelzellhypertrophie assoziierten Marker, Kollagen Typ 10 und indischer Igel, war nach 28 Tagen Kultur signifikant herunterreguliert. Im Fettgewebe wurde eine reichliche Ablagerung von Lipidtröpfchen festgestellt. Die Immunfluoreszenzfärbung zeigte nach vierwöchiger Kultivierung eine robuste Expression von Lubricin und Cadherin 11 durch die OFS.

In einem Krankheitsmodell führte die Behandlung mit IL one beta zu Zellapoptose und erhöhten MMP-13-Spiegeln in der SFT. Der Knorpelabbau wurde mit IL one beta behandelt, was auf das Auftreten von Crosstalk zwischen dem osteochondralen Gewebe und der OFS hindeutet. Die therapeutische Wirksamkeit von Naproxen durch systemische Verabreichung zeigte einen reduzierten Knorpelabbau in IL one beta minijoint.

Die realtime PCR zeigte, dass die vier potenziell krankheitsmodifizierenden Arthrosemedikamente den Knorpelverlust teilweise rückgängig machten. Die wichtigsten Schritte dieses Verfahrens sind die Vernetzung der Gele in den Inserts und die Insert-Platzierung im Bioreaktor. Der Chip ermöglicht es, den Beitrag anderer Risikofaktoren bei Arthrose zu untersuchen, wie z. B. Fettleibigkeit und mechanische Verletzungen.

Es kann auch zur Untersuchung anderer Gelenkerkrankungen verwendet werden.