Entwicklung eines Bioreaktors zur Verbesserung der Datenerfassung und des Modelldurchsatzes von künstlich hergestelltem Herzgewebe

Dreidimensionale Herzgewebe, die mit aus Stammzellen gewonnenen Kardiomyozyten biotechnologisch hergestellt wurden, haben sich als vielversprechende Modelle für die Untersuchung von gesundem und krankem menschlichem Myokard in vitro erwiesen und gleichzeitig Schlüsselaspekte der nativen Herznische rekapituliert. Dieses Manuskript beschreibt ein Protokoll zur Herstellung und Analyse von High-Content-Kardiomyozyten, die aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen erzeugt werden.

Unser In-vitro-Modell des aus dreidimensionalen Stammzellen gewonnenen menschlichen Herzmuskels verbessert die Biotreue herkömmlicher zweidimensionaler Zellkulturen und eliminiert gleichzeitig die Unterschiede zwischen den Spezies, die mit Labortierversuchen verbunden sind. Unser Multi-Tissue-Bioreaktor-Design mit stabilen Post-Trackern maximiert den Gewebeerfolg und verbessert die Genauigkeit der eingehenden Charakterisierung der Funktion von künstlich hergestelltem Herzgewebe. Da Herzinsuffizienz nach wie vor die häufigste Todesursache weltweit ist, ermöglichen unsere künstlich hergestellten Herzgewebe den Forschern, menschliche Herzerkrankungen zu modellieren und potenzielle Therapien zu untersuchen.

Positionieren Sie zunächst vier Aluminium-Negativ-Mastergüsse so im Gusshalter, dass die Pfostenlöcher mit dem Totraum gegenüber den dreieckigen Einlegeböden ausgerichtet sind. Platzieren Sie das Gerät zwischen zwei parallelen Halterungen und klemmen Sie die Seiten mit einem rechteckigen Stück 0,5 Millimeter dicker Silikonfolie als Dichtung zusammen, um ein Auslaufen des flüssigen PDMS zu verhindern. In einem flachen Behälter 0,5 Milliliter PDMS-Härter mit fünf Millilitern PDMS-Elastomerbasis im Verhältnis eins zu 10 mischen und fünf Minuten kräftig umrühren.

Entgasen Sie das PDMS-Gemisch in einer Vakuumkammer unter starkem Vakuum, bis die Blasen verschwinden. Gießen Sie dann die PDMS-Mischung auf die Gießapparatur und füllen Sie sie auf, um eine vollständige Abdeckung jedes Schlitzes zu gewährleisten. Fügen Sie kleine farbige Glasperlen auf den Körper der PDMS-Racks gegenüber der Seite mit den Pfosten hinzu, um die eindeutige Identifizierung jedes Racks zu gewährleisten.

Den Gießapparat waagerecht unter starkem Vakuum für mindestens 12 Stunden waagerecht in die Vakuumkammer stellen. Lassen Sie das PDMS 48 Stunden lang bei Raumtemperatur und fern von Staub aushärten, um eine vollständige Aushärtung und maximale Festigkeit der empfindlichen Stifte zu ermöglichen. Entfernen Sie die Klemme, die Halterungen und die Silikonfolie vom Gießapparat.

Schneiden Sie mit einer Rasierklinge aus Edelstahl die PDMS-Folie auf der Oberseite des Gießapparats und der Rahmenträger ab. Verwenden Sie die Finger, um die PDMS-Racks von den Seiten des Gusshalters zu trennen. Führen Sie eine stumpfe Rasierklinge aus Edelstahl in den Totraum zwischen Gips und Gipshalter ein und hebeln Sie sie auseinander, wobei Sie darauf achten, dass das PDMS, das den Totraum ausfüllt, mit dem Gipshalter verbleibt.

Schneiden Sie dann mit einer scharfen Edelstahlklinge die restlichen PDMS-Folien und die Totraum-PDMS von den Spitzen der Pfosten ab. Trennen Sie das PDMS-Gestell mit den Fingern langsam vom Gips auf der den Pfosten gegenüberliegenden Seite. Wechsle weiter die Seiten, bis die Pfosten frei von den Master-Casts sind.

Befreien Sie alle PDMS-Racks und die Pfosten, wie zuvor gezeigt, und verwenden Sie eine scharfe Rasierklinge, um alle verbleibenden überschüssigen PDMS von den Racks zu entfernen. Drucken Sie mit einem thermoplastischen 3D-Drucker für die Modellierung der schmelzenden Abscheidung die Komponenten der Stable-Post-Tracker-Gießapparatur (SPoT). Sorgen Sie für einen sicheren Presssitz zwischen den 3D-gedruckten Teilen und zwischen den PDMS-Racks und der dreizackigen Vorrichtung.

Vergewissern Sie sich auch, dass die PDMS-Racks eng mit den Pfosten zusammenpassen, die gerade den Boden der Vertiefungen erreichen, ohne verbogen zu werden. Mischen Sie 0,5 Milliliter schwarzes PDMS Teil A mit 0,5 Milliliter Teil B in einem kleinen Wägeschiffchen oder einem flachen Behälter, bis die Lösung eine gleichmäßige Farbe hat. Entgasen Sie das gemischte schwarze PDMS in einer Vakuumkammer unter starkem Vakuum für 20 Minuten.

Gießen Sie das entgaste schwarze PDMS auf die 3D-gedruckte Basis, um die Löcher zu füllen, und klopfen Sie, um sicherzustellen, dass keine Blasen zurückbleiben. Kratzen Sie so viel überschüssiges PDMS wie möglich von der Basis ab. Befestigen Sie das dreizackige Stück an der Basis und platzieren Sie die PDMS-Racks in den Nuten der dreizackigen Vorrichtung, wobei Sie darauf achten müssen, dass die Enden der Pfosten in das schwarze PDMS in den kreisförmigen Vertiefungen eintauchen.

Lassen Sie das schwarze PDMS 48 Stunden lang bei Raumtemperatur und fern von Staub aushärten. Schieben Sie das dreizackige Stück heraus, um die Spannung auf den Pfosten zu minimieren. Kratzen Sie mit einer kleinen Pinzette die dünne schwarze PDMS-Folie ab, die jeden SPoT umgibt, und führen Sie dann eine fein bestückte, gebogene Pinzette in die SPoT-Vertiefung ein, um sie von der 3D-gedruckten Basis zu befreien.

Untersuchen Sie die SPoTs und schneiden Sie alle schwarzen PDMS-Folien aus dem Gießprozess mit einer feinen Vannas-Schere ab. Stellen Sie sicher, dass die fertigen Pfosten die richtige Länge haben, indem Sie die PDMS-Racks auf den Polys-Handyrahmen montieren und diesen dann auf die schwarze Grundplatte schieben. Nachdem Sie den Bioreaktor autoklaviert und die Zellmischung vorbereitet haben, fahren Sie mit der Herstellung der hECTs fort.

Tragen Sie sterile Handschuhe, entfernen Sie die schwarze Grundplatte aus dem autoklavierten Beutel mit den Bioreaktorteilen und legen Sie ihn mit den Vertiefungen nach oben in eine 60-Milliliter-Schale. Pipettieren Sie 44 Mikroliter der Zellmischung langsam in jede Vertiefung, um das Eindringen von Blasen zu vermeiden. Tragen Sie ein frisches Paar steriler Handschuhe und entfernen Sie den Polysulfonrahmen mit den PDMS-Racks aus dem Autoklavenbeutel.

Senken Sie den Rahmen so auf die Grundplatte, dass die Enden des Rahmens in die Nuten am Ende der Grundplatte passen. Stellen Sie sicher, dass die Pfosten alle gerade sind und der Rahmen nicht gekippt ist, und stellen Sie den Bioreaktor in eine 60-Millimeter-Schale. Geben Sie einen Milliliter 10%FBS in Kardiomyozyten-Erhaltungsmedium in die 60-Milliliter-Schale, um die Luftfeuchtigkeit zu erhöhen, während sich die hECTs verfestigen.

Stellen Sie die Schale ohne Deckel in eine 100-Millimeter-Schale mit hohem Profil und decken Sie sie mit einem 100-Millimeter-Deckel ab, dann stellen Sie den Bioreaktor wieder in einen 37 Grad Celsius heißen und 5%igen Kohlendioxid-Inkubator, damit das Kollagen mit den Zellen in Suspension ein Gel bilden kann. Nach zwei Stunden nehmen Sie die Schale aus dem Inkubator. Geben Sie 13 Milliliter 10 % FBS in das Kardiomyozyten-Erhaltungsmedium und kippen Sie die Schale, damit das Medium zwischen der PTFE-Grundplatte und den PDMS-Racks fließen kann.

Untersuchen Sie den Bioreaktor von der Seite auf keine Luftblasen und legen Sie die Schale zurück in den Inkubator. Wenn Luft eingeschlossen ist, kippen Sie den Bioreaktor aus dem Medium, um die Blase brechen zu lassen, und senken Sie sie langsam wieder ab, oder verwenden Sie eine Mikropipette mit einer Gel-Ladespitze, um die Luft abzusaugen, ohne die Pfosten zu stören. Prüfen Sie die hECT-Verdichtung durch das Fenster im Rahmen.

Über 24 bis 96 Stunden verdichten sich die hECTs und werden undurchsichtig. Entfernen Sie die Grundplatte, wenn die hECTs um mindestens 30 % gegenüber dem ursprünglichen Durchmesser verdichtet sind. Füllen Sie die 60-Millimeter-Schale mit dem Bioreaktor mit Kardiomyozyten-Erhaltungsmedium, bis die Flüssigkeit mit dem Rand der Schale spült, und geben Sie 14 Milliliter in eine neue 60-Millimeter-Schale.

Tragen Sie sterile Handschuhe und drehen Sie den Bioreaktor in seiner Schale um, so dass die Bodenplatte oben liegt. Nachdem Sie die Grundplatte auf eingeschlossene Luftblasen untersucht haben, heben Sie sie langsam an und halten Sie sie waagerecht. Stellen Sie sicher, dass die Beitragstipps im Fokus sind.

Schalten Sie den Schwellwertschalter ein und stellen Sie den Schieberegler so ein, dass die SPoTs gut abgegrenzt sind und ihre Form nicht ändern, wenn sich der hECT zusammenzieht. Verwenden Sie das Rechteck-Werkzeug, um ein Rechteck um eines der SPoTs zu zeichnen, und klicken Sie auf die Schaltfläche "Eins festlegen" im Feld "Pfostenbegrenzungen", um die Rechteckposition um das SPoT festzulegen und sicherzustellen, dass das SPoT immer innerhalb der Begrenzung des Rechtecks bleibt. Wiederholen Sie den Vorgang für den anderen Beitrag und zeichnen Sie ihn unter Satz zwei auf.

Passen Sie die Einstellungen für die Objektgröße an, um zu verhindern, dass das Programm kleinere Objekte verfolgt, und stellen Sie sicher, dass die Anzahl der verfolgten Objekte in jedem Rechteck konstant bleibt. Die Schnittstelle zeigt den gemessenen Abstand zwischen den verfolgten Objekten in Echtzeit an. Verwenden Sie dieses Diagramm, um das Rauschen zu überwachen.

Geben Sie unter der Überschrift Hertz für die Stimulationsfrequenz den Bereich der gewünschten Frequenzen und das gewünschte Intervall für die Schritte von min bis max an. Wählen Sie in den Feldern auf der rechten Seite die gewünschte Einstellzeit aus, damit sich der hECT an die neue Schrittfrequenz anpassen kann, und geben Sie dann die Aufnahmezeit und die Stimulationsspannung an. Starten Sie das Programm, indem Sie auf die Schaltfläche "Programm starten" klicken.

Nachdem die Daten einer Frequenz aufgezeichnet wurden, erhöhen Sie die Stimulatorfrequenz um das gewünschte Intervall für eine neue Aufnahme, bis die maximale Frequenz erreicht ist. Hier werden repräsentative Bilder von hECTs von unten gezeigt, die ohne SPoTs und mit SPoTs erstellt wurden. Die SPoTs stellten eine einzige definierte Form bereit, die während der Datenerfassung verfolgt werden sollte.

In einigen extremen Fällen wurde das Tracking-Objekt sogar verdeckt. Eine zuverlässigere Form für die optische Nachführung und Rauschunterdrückung ermöglichte die Messung von schwachem Gewebe mit einer entwickelten Kraft von nur einem Mikro-Newton. Die SPoTs boten eine Kappengeometrie, die den hECT-Verlust verhinderte.

Die gemessene hEKT-Funktion war über eine längere Kulturzeit im aktuellen Pacing-Setup mit dem beheizten Tisch stabil. Im Vergleich zu Messungen bei physiologischer Temperatur zeigten hECTs eine veränderte Kontraktionsdynamik bei Raumtemperatur mit langsameren Kontraktions- und Relaxationsraten. Bei höheren Frequenzen waren die hECTs bei Raumtemperatur tendenziell schwächer.

Bei niedrigeren Frequenzen waren die hECTs bei Raumtemperatur tendenziell stärker. Bei einer Temperatur von 36 Grad Celsius hatten die hECTs eine höhere spontane Beat-Rate und einen größeren Bereich an Aufnahmefrequenzen. Die temperaturkontrollierte Umgebung gewährleistet die physiologische Relevanz der gemessenen hECT-Funktion.

Darüber hinaus erleichtert das gemeinsame Medienbad des Multi-Gewebe-Bioreaktors die Untersuchung der parakrinen Signalübertragung zwischen hECTs unterschiedlicher zellulärer Zusammensetzung. Die Hinzufügung von SPoTs zu unserem Multi-Gewebe-Bioreaktor ermöglicht es Forschern, erkrankte Myokarde mit ungewöhnlich hoher oder niedriger Spannung effizient zu untersuchen, die sonst von den Enden unverschlossener Stifte abrutschen würden.