Gleichzeitig Capturing in Echtzeit Bilder in zwei Emissions Kanäle unter Verwendung eines Dual-Kamera-Emissions-Splitting-System: Anwendungen in der Zelladhäsion

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, einen Adhäsionsassay mit paralleler Plattendurchflusskammer unter Verwendung eines Dual-Kamera-Emissionsaufteilungssystems durchzuführen, um gleichzeitig Echtzeit-Bildsequenzen in zwei Farben aufzuzeichnen. Dazu werden zunächst die beiden Kameras auf dem Imaging-Setup ausgerichtet. Als nächstes werden die Zellen und das reaktive Substrat vorbereitet und die parallele Plattenströmungskammer eingerichtet.

Die Kameraeinstellungen werden dann für die zweifarbige Bildaufnahme kalibriert und alle erforderlichen digitalen Korrekturen an der Kameraausrichtung vorgenommen. Anschließend werden Bildsequenzen aufgenommen, die die Aufnahme von zweifarbigen Bildern mit hoher zeitlicher Auflösung demonstrieren. Der Vorteil von Dual-Kamera-Emissionssplitting-Systemen gegenüber Einzelkamerasystemen besteht darin, dass jeder Kamera unterschiedliche Belichtungszeiten zugewiesen werden können und das volle Sichtfeld erhalten bleibt.

Diese Technik kann dazu beitragen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der Zelladhäsion zu beantworten, z. B. wie sich die Lokalisierung von Adhäsionsmolekülen auf der Oberfläche von Zellen auf dynamische biologische Prozesse wie Zellmigration, Entzündung und Krebsmetastasierung auswirken könnte. Das folgende Verfahren erfordert ein inverses Epi-Fluoreszenzmikroskop. Dieser sollte mit einer hochintensiven Lichtquelle ausgestattet sein, die mit einem Lichtleiter gekoppelt ist, einem Kombifilterwürfel und einem Dual-Kamera-Emissionssplitting-Kamerasystem.

Das Mikroskop sollte an einen Computer angeschlossen werden, auf dem eine Bildgebungssoftware ausgeführt wird, die in der Lage ist, Bilder zu erfassen und zu kombinieren, die von monochromen CCD-Kameras aufgenommen wurden. Hier kommt die Multi-Kamera-Software stream picks five mit dem simul picks-Modul zum Einsatz. Öffnen Sie zunächst die fünf Stream-Auswahlen im Aufgabenmenüband und wählen Sie Arbeitsbereich aus.

Öffnen Sie dann ganz rechts auf dem Bildschirm den Arbeitsbereichs-Manager und wählen Sie Neuer Arbeitsbereich aus. Nachdem Sie die Kamera benannt haben, folgen Sie den Anweisungen der Software, um aus einer vorausgefüllten Liste ein passendes Grabber-Kameramodell auszuwählen, und ein kleines Kamerasymbol wird im Arbeitsbereich angezeigt, um anzuzeigen, dass der Kamera-Feed empfangen wurde. Objekte, die mit dem Mikroskop abgebildet wurden, können nun auf dem Bildschirm betrachtet werden.

Wiederholen Sie diesen Vorgang für den zweiten Kameraarbeitsbereich, wiederholen Sie diesen Vorgang dann für den zusammengeführten Arbeitsbereich noch einmal, und alle Kameras werden verwendet. Eine Fehlermeldung wird angezeigt. Diese Meldung bezieht sich auf die normalen Kameras, die den Arbeitsbereichen eins und zwei dem zusammengeführten Arbeitsbereich im Andockbereich auf der rechten Seite des Anzeigebildschirms zugewiesen sind.

Die Bilder in Workspace eins und zwei werden im zusammengeführten Workspace als zwei pseudofarbige Bilder überlagert. Der schwierigste Aspekt dieses Verfahrens ist die Kameraausrichtung. Um den Erfolg zu gewährleisten, verwenden wir die Herstellerfolie und halten uns dabei akribisch an die Anweisungen des Herstellers.

Um die Kameras im Dual-Kamera-Emissionsaufteilungssystem auszurichten, senden Sie Hellfeld- oder Phasenkontrastlicht an das Mikroskopokular. Legen Sie das vom Hersteller bereitgestellte metallisch beschichtete Kalibriergitter auf den Mikroskoptisch und quadrieren Sie das Gitter auf dem Mikroskoptisch. Zeigen Sie das Raster ohne Binning und ohne automatische Skalierung an, bringen Sie es in den Fokus, verschieben Sie es dann, aber entfernen Sie nicht das dichroitische Gehäuse, um die Kamera eins auszurichten.

Fokussieren Sie dann das Bild mit dem Fokuseinstellrad an Seamount-Port eins erneut. Schieben Sie als Nächstes das dichroitische Gehäuse vollständig in die Zweikanal-Erfassungsvorrichtung, so dass das Bild durch die dichroitische Folie auf beide Kameras aufgeteilt wird. Lösen Sie die Stellschrauben 3 5 60 Zoll und drehen Sie die zweite Kamera an der zweiten CM-Halterung, bis die Ausrichtung des Rasters in beiden Bildern identisch ist, indem Sie das Fokuseinstellrad an der zweiten C-Halterung einstellen und das Bild von Kamera zwei scharf stellen.

Um die Ausrichtung abzuschließen, verwenden Sie den RL-Knopf auf der rechten Seite von DC zwei, um die kombinierten Bildpositionen bis zum richtigen Hub anzupassen. Die vertikale Begrenzung der Bilder wird im zusammengeführten Arbeitsbereich genau ausgerichtet. Verwenden Sie dann den UD-Knopf, um die Ausrichtung des zweiten Bildes nach oben und unten anzupassen, bis die horizontalen Rasterbalken richtig ausgerichtet sind.

Wenn während der Ausrichtung nach oben nach unten eine leichte Kameradrehung auftritt, beheben Sie dieses Problem, indem Sie die Schrauben für Kamera zwei lösen und drehen, bis das angezeigte Bild richtig ausgerichtet ist. Bereiten Sie BET 20 Brustkrebszellen für den Adhäsionstest in der Parallelplatten-Durchflusskammer vor, indem Sie sie mit Anti-CD 24 und TECA 4 5 2 unter Verwendung von LOR 5 68 und 4 88 Sekundärzellen färben, wie im Begleitdokument beschrieben. Verbinden Sie zwei separate Schlauchlängen mit den Einlass- und Auslassöffnungen der Durchflusskammer.

Ein Schlauch wird mit dem Reservoir verbunden, das die markierten Zellen enthält, die in DPBS suspendiert sind und 0,1 % PSA enthalten. Verbinden Sie den anderen Schlauch mit der Spritzenpumpe, die Flüssigkeit mit einer bestimmten Durchflussrate absaugt. Schließen Sie eine Vakuumleitung an die Durchflusskammer an und positionieren Sie die Durchflusskammer über der 35-Millimeter-Gewebekulturschale, die eine Monoschicht aus Ovarialzellen des chinesischen Hamsters enthält, die Lektin oder Cho e-Zellen exprimieren.

Passen Sie die Dichtung der Durchflusskammer und der Durchflusskammer an, um eine ausreichende Vakuumabdichtung zu gewährleisten. Entnehmen Sie Flüssigkeit aus dem Behälter und überwachen Sie die Durchflusskammerbaugruppe für eine ordnungsgemäße Abdichtung. Setzen Sie abschließend die Durchflusskammerbaugruppe auf das Mikroskop und schalten Sie die Lichtquelle und den Mikroskopaufbau durch manuelle Inspektion ein.

Stellen Sie sicher, dass sich das dichroitische Gehäuse in der korrekten gedrückten Betriebsposition befindet und sich nicht im Bypass-Modus befindet. Wechseln Sie manuell in den Fluoreszenzmodus und wählen Sie den grün-roten Fluoreszenzfilterwürfel aus, um die Belichtungszeit und die Verstärkung separat zu bestimmen. Bilden Sie die Zellen mit roter Fluoreszenz in Kamera eins und grüner Fluoreszenz in Kamera zwei ab.

Drückte den dichroitischen Ton manuell nach Bedarf, um die Bilder zu erhalten. Als nächstes legen Sie eine Suspension von BT 20-Zellen ab, die nur mit roter Flora gefärbt sind. Vier konjugierte Antikörper im Reservoir, die mit der Einlassöffnung der Parallelplatten-Durchflusskammer verbunden sind.

Verwenden Sie die Spritzenpumpe, um BT 20-Zellen über die Choi-Monoschicht in der parallelen Plattendurchflusskammer zu perfundieren. Passen Sie in den Live-Einstellungen der Imaging-Software die Belichtungszeit der ersten Kamera an, um ein Bild im roten Kanal zu erhalten. Passen Sie die Belichtungszeit von Kamera zwei an die Belichtungszeit von Kamera eins an.

Wenn ein Bild im grünen Kanal beobachtet wird, sind Artefakte vorhanden, die durchbluten. Behalten Sie in diesem Fall die Belichtungszeit in Kamera eins und Kamera zwei bei, und reduzieren Sie die Belichtungszeit, bis das Durchscheinungsartefakt im grünen Kanal nicht mehr sichtbar ist. Passen Sie die Verstärkung der ersten Kamera an, um bei Bedarf die Sichtbarkeit des Bildes im Rotkanal zu verbessern.

Entfernen Sie anschließend alle verbleibenden BT 20-Zellensuspensionen aus dem Reservoir und ersetzen Sie die Suspension durch DPBS. Verwenden Sie die Spritzenpumpe, um die Lösung über der Choi-Monoschicht zu perfundieren, bis die BT 20-Zellen auf der Monoschicht nicht mehr sichtbar sind. Füllen Sie das Reservoir mit der Suspension von BT 20-Zellen auf, die nur mit grünem Fluor-4-konjugiertem Antikörper gefärbt sind.

Wiederholen Sie den Kamerakalibrierungsvorgang mit den grünen einfarbigen Steuerelementen. Diese Zeit definiert die Belichtungszeit mit Kamera zwei, um Zellen im grünen Kanal ohne Durchbluten von Artefakten im roten Kanal abzubilden, die von Kamera eins erfasst wurden. Verwenden Sie die Bildgebungssoftware, um gleichzeitig Bilder anzuzeigen, die von den beiden monochromen CCD-Kameras in der Durchflusskammer aufgenommen wurden. Experiment.

Führen Sie die von beiden Kameras gesammelten Bilder mit dem Modul "Simul Pics" von Stream Picks zusammen. Verwenden Sie digitale Korrekturanpassungen in simul pic oder alternativer Software, um die zusammengeführten Bilder räumlich auszurichten. Bei Bedarf können Bilder mit dem simul PIC Modul für horizontale, vertikale und rotierende Anpassungen korrigiert werden.

Das System kann nun für die gleichzeitige Aufnahme von zwei Farbbildern verwendet werden. Ein Adhäsionsassay mit paralleler Plattendurchflusskammer wurde verwendet, um das in diesem Video beschriebene Dual-Kamera-Emissionsaufteilungssystem zu demonstrieren. Wie hier gezeigt, detektierte das System BT 20-Zellen, die fluoreszenzmarkiert wurden mit dem Anti-Human-CD 24 (rot dargestellt) und HECA 4 52, das an SCOs verwandte Moleküle bindet (grün dargestellt).

Einige rollende Zellen zeigten rote, aber nicht grüne Signale an. Andere zeigten grüne Signale, aber keine roten Signale an, und wieder andere Zellen zeigten sowohl rote als auch grüne Signale an. Hier. Die Kameras behielten die optische und zeitliche Auflösung bei, um die Zellmerkmale auf einer Zelle zu verfolgen, die taumelte und über das Ende rollte, während sie auf dem reaktiven Substrat in Strömungsrichtung rollte. Die verschmolzenen Emissionskanäle zeigten die Verteilung und Kolokalisation von CD 24 und gesättigten Molekülen auf der Oberfläche von BT 20-Zellen, die rollen und an CHO e Monoschichten haften.

Diese Bilder zeigen den Zoom einer einzelnen BT 20-Zelle, in der CD 24 und gesättigte Moleküle kolokalisieren und als gelbe bis orangefarbene Flecken erscheinen, wenn die roten und grünen pseudofarbigen Emissionskanäle zusammengeführt werden. Zusammengenommen. Diese Informationen zeigen, dass das Dual-Kamera-Emissionsteilungssystem über die räumliche, zeitliche und optische Auflösung verfügt, die erforderlich ist, um zelluläre und molekulare Merkmale in Anwendungen wie Durchflusskammer-Adhäsionsassays aufzudecken, bei denen sich Zellen schnell durch das Sichtfeld bewegen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie ein Dual-Kamera-Emissionsteilungssystem einrichten und kalibrieren oder einen Adhäsionsassay mit paralleler Plattendurchflusskammer in Echtzeit in zwei Farben abbilden. Diese Methode kann auf andere In-vitro-Assays angewendet werden, die Fluoreszenz zur Untersuchung des Zellverhaltens verwenden.