Gleichzeitig Capturing in Echtzeit Bilder in zwei Emissions Kanäle unter Verwendung eines Dual-Kamera-Emissions-Splitting-System: Anwendungen in der Zelladhäsion

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, einen Adhäsionsassay in einer Parallelplatten-Flusskammer mithilfe eines Systems zur Aufteilung der Emission auf zwei Kameras durchzuführen, um in Echtzeit Bildsequenzen in zwei Farben gleichzeitig aufzuzeichnen. Dazu werden zunächst die beiden Kameras der Abbildungseinrichtung justiert. Anschließend werden die Zellen und das reaktive Substrat vorbereitet und die Parallelplatten-Flusskammer aufgebaut.

Die Kameraeinstellungen werden anschließend für die Aufnahme von Zwei-Farben-Bildern kalibriert, und es werden alle erforderlichen digitalen Korrekturen der Kameraausrichtung vorgenommen. Anschließend werden Bildsequenzen aufgezeichnet, die die Aufnahme von Zwei-Farben-Bildern mit hoher zeitlicher Auflösung veranschaulichen. Der Vorteil von Emissionsteilungssystemen mit zwei Kameras gegenüber Ein-Kamera-Systemen besteht darin, dass jeder Kamera unterschiedliche Belichtungszeiten zugewiesen werden können und das volle Sichtfeld beibehalten wird.

Mit dieser Technik können zentrale Fragen auf dem Gebiet der Zelladhäsion beantwortet werden, beispielsweise wie die Lokalisation von Adhäsionsmolekülen auf der Zelloberfläche dynamische biologische Prozesse wie Zellmigration, Entzündungen und die Metastasierung von Krebs beeinflussen könnte. Das folgende Verfahren erfordert ein invertiertes Epi-Fluoreszenzmikroskop, das mit einer Hochleistungslichtquelle, gekoppelt an einen Lichtleiter, einem Kombinations-Filterwürfel und einem dualen Kamera-Emissionssplitting-System ausgestattet sein sollte.

Die Mikroskopanlage sollte mit einem Computer verbunden sein, der eine Bildgebungssoftware ausführt, die in der Lage ist, Bilder aufzunehmen und zusammenzufügen, die von monochromen CCD-Kameras erfasst wurden. Hier wird die Mehrkamera-Software Stream Picks Five mit dem Simul Picks-Modul verwendet. Öffnen Sie zunächst Stream Picks Five im Aufgabenmenüband und wählen Sie Arbeitsbereich aus.

Danach ganz rechts auf dem Bildschirm den Arbeitsbereichs-Manager öffnen und einen neuen Arbeitsbereich auswählen. Nachdem die Kamera benannt wurde, den Anweisungen der Software folgen, um aus einer vorbefüllten Liste einen Grabber auszuwählen, der zum Kameramodell passt; ein kleines Kamerapiktogramm erscheint im Arbeitsbereich, um anzuzeigen, dass das Kamerabild empfangen wird. Objekte, die mit dem Mikroskop abgebildet werden, können nun auf dem Bildschirm betrachtet werden.

Wiederholen Sie diesen Vorgang für den zweiten Kameraarbeitsbereich und anschließend für den zusammengeführten Arbeitsbereich noch einmal, sodass alle Kameras verwendet werden. Eine Fehlermeldung wird angezeigt. Diese Meldung ist normal, da die zugewiesenen Kameras aus den Arbeitsbereichen eins und zwei dem zusammengeführten Arbeitsbereich im Andockfeld auf der rechten Seite des Anzeigebildschirms zugeordnet werden.

Die Bilder in Arbeitsbereich eins und zwei werden im kombinierten Arbeitsbereich als zwei pseudogefärbte Bilder überlagert. Der schwierigste Aspekt dieses Verfahrens ist die Kameraausrichtung. Um Erfolg zu gewährleisten, verwenden wir die vom Hersteller bereitgestellte Probe und folgen sorgfältig den Anweisungen des Herstellers.

Um die Kameras im Dual-Kamera-Emissionsaufteilungssystem auszurichten, leiten Sie Hellfeld- oder Phasenkontrastlicht zum Mikroskopokular. Platzieren Sie das metallbeschichtete Kalibrierungsgitter, das vom Hersteller mitgeliefert wurde, auf dem Mikroskoptisch und richten Sie das Gitter auf dem Mikroskoptisch rechtwinklig aus. Zeigen Sie das Gitter ohne Binning und ohne automatische Skalierung an, fokussieren Sie es scharf, und verschieben Sie dann – ohne es zu entfernen – das Dichroikgehäuse, um Kamera eins auszurichten.

Danach mit dem Fokusverstelleinstellrad am Seamount-Port eins das Bild erneut scharfstellen. Als Nächstes das Dichroikgehäuse vollständig in die Doppelkanal-Aufnahmeeinheit schieben, sodass das Bild durch das Dichroik auf beide Kameras aufgeteilt wird. Lockern Sie die 3 5 60 Viertelzoll-Verriegelungsschrauben und drehen Sie die zweite Kamera am weiblichen CM-Mount-Port zwei, bis die Ausrichtung des Gitters in beiden Bildern identisch ist. Mit dem Fokusverstelleinstellrad am C-Mount-Port zwei bringen Sie das Bild der zweiten Kamera in den Fokus.

Um die Ausrichtung abzuschließen, verwenden Sie den RL-Regler auf der rechten Seite von DC zwei, um die Positionen der kombinierten Bilder so anzupassen, dass die rechte Hebung erfolgt. Die vertikale Grenze der Bilder ist im zusammengeführten Arbeitsbereich exakt ausgerichtet. Verwenden Sie dann den UD-Regler, um die vertikale Ausrichtung des zweiten Bildes so zu justieren, dass die horizontalen Gitterlinien korrekt ausgerichtet sind.

Falls während der Auf-Ab-Ausrichtung eine leichte Kamerarotation auftritt, beheben Sie dieses Problem, indem Sie die drei 5/60-Zoll-Schrauben für Kamera zwei lösen und die Kamera drehen, bis das angezeigte Bild korrekt ausgerichtet ist. Bereiten Sie BET-20-Brustkrebszellen für einen Adhäsionsassay in einer Parallelplatten-Flusskammer vor, indem Sie sie gemäß dem beigefügten Dokument mit Anti-CD-24 und TECA-4-5-2 sowie den Sekundärantikörpern LOR-5-68 und 4-88 anfärben. Stellen Sie sicher, dass Sie nach der Färbung die entsprechenden Einzelfarben-Kontrollen vorbereiten, und geben Sie die Zellen anschließend in das Reservoir der Parallelplatten-Flusskammer. Schließen Sie zwei separate Schlauchstücke an die Einlass- und Auslassanschlüsse der Flusskammer an.

Ein Schlauch wird mit dem Reservoir verbunden, das die markierten Zellen in DPBS plus 0,1 % PSA enthält. Verbinden Sie den anderen Schlauch mit der Spritzenpumpe, die die Flüssigkeit mit einer festgelegten Flussrate abzieht. Schließen Sie eine Vakuumleitung an die Durchflusskammer an, und positionieren Sie die Durchflusskammer über der 35-Millimeter-Zellkulturschale, die eine Zellschicht aus Chinesischen Hamsterovarzellen exprimierend Lectin oder CHO-E-Zellen enthält.

Stellen Sie die Strömungskammer und die Dichtung der Strömungskammer so ein, dass eine ausreichende Vakuumdichtung gewährleistet ist. Ziehen Sie Flüssigkeit aus dem Reservoir ab und überwachen Sie die Montage der Strömungskammer auf eine ordnungsgemäße Dichtung. Schließlich platzieren Sie die montierte Strömungskammer auf dem Mikroskop, schalten Sie die Lichtquelle ein und richten Sie das Mikroskop durch manuelle Inspektion ein.

Stellen Sie sicher, dass sich das Dichroikgehäuse in der korrekten abgesenkten Betriebsposition befindet und sich nicht im Bypass-Modus befindet. Wechseln Sie manuell in den Fluoreszenzmodus und wählen Sie den grün-roten Fluoreszenzfilterblock, um die Belichtungszeit und die Verstärkung separat einzustellen. Bilden Sie die Zellen mittels roter Fluoreszenz in Kamera eins und grüner Fluoreszenz in Kamera zwei ab.

Den Dichroikspiegel bei Bedarf manuell niedergedrückt, um die Bilder zu erhalten. Anschließend eine Suspension von BT 20-Zellen, die nur mit roter Flora gefärbt wurden, aufgetragen. Vier konjugierte Antikörper im Reservoir, das mit dem Einlassanschluss der Parallelplatten-Flusskammer verbunden ist.

Verwenden Sie die Spritzenpumpe, um BT-20-Zellen über die Choi-Monoschicht in der Parallelplatten-Flusskammer zu perfundieren. Passen Sie in den Live-Einstellungen der Bildgebungssoftware die Belichtungszeit der ersten Kamera an, um ein Bild im roten Kanal zu erhalten. Stellen Sie die Belichtungszeit der zweiten Kamera auf die Belichtungszeit der ersten Kamera ein.

Wenn im grünen Kanal ein Bild beobachtet wird, sind Übersprechartefakte vorhanden. In diesem Fall halten Sie die Belichtungszeit in Kamera eins und Kamera zwei gleich und verringern Sie die Belichtungszeit, bis der Übersprechartefakt im grünen Kanal nicht mehr sichtbar ist. Passen Sie gegebenenfalls den Verstärkungsfaktor (Gain) von Kamera eins an, um die Bildsichtbarkeit im roten Kanal zu verbessern.

Entfernen Sie anschließend jegliche verbleibende BT-20-Zellsuspension aus dem Reservoir und ersetzen Sie die Suspension durch DPBS. Spülen Sie mithilfe der Spritzenpumpe die Lösung über die Cho-Monolayer, bis die BT-20-Zellen auf der Monolayer nicht mehr sichtbar sind. Befüllen Sie das Reservoir erneut mit der Suspension der BT-20-Zellen, die nur mit grünem Fluoro-4-konjugiertem Antikörper gefärbt wurden.

Wiederholen Sie den Kameralkalibrationsprozess unter Verwendung der einfarbigen grünen Steuerelemente. Definieren Sie diesmal die Belichtungszeit mit Kamera zwei, um Zellen im grünen Kanal abzubilden, ohne Übersprechartefakte im roten Kanal, der von Kamera eins erfasst wird. Verwenden Sie die Bildgebungssoftware, um gleichzeitig Bilder von den beiden monochromen CCD-Kameras in der Durchflusskammer zu betrachten. Experiment.

Vereinen Sie die Bilder, die von beiden Kameras aufgenommen wurden, mithilfe des Simul-Pics-Moduls von Stream Picks. Verwenden Sie digitale Korrekturanpassungen in Simul Pic oder alternativer Software, um die zusammengeführten Bilder räumlich auszurichten. Gegebenenfalls können die Bilder mit dem Simul-PIC-Modul auf horizontale, vertikale und rotationelle Abweichungen korrigiert werden.

Das System ist nun bereit, um zwei Farbbilder gleichzeitig aufzunehmen. Ein Adhäsionsassay mit einer Parallelplatten-Flusskammer wurde verwendet, um das in diesem Video beschriebene Emissionsteilungssystem mit zwei Kameras zu demonstrieren. Wie hier gezeigt, detektierte das System BT-20-Zellen, die mit anti-humanem CD24, dargestellt in Rot, und HECA-452, das an SCOs verwandte Moleküle bindet, dargestellt in Grün, fluoreszenzmarkiert waren.

Einige rollende Zellen zeigten rote, aber keine grünen Signale. Andere zeigten grüne Signale, jedoch keine roten Signale, und wieder andere Zellen zeigten sowohl rote als auch grüne Signale. Die Kameras behielten die optische und zeitliche Auflösung bei, um Zellmerkmale während des Wälzens und Überschlagens zu verfolgen, während die Zellen in Fließrichtung auf dem reaktiven Substrat rollten; die fusionierten Emissionskanäle zeigten die Verteilung und Kolokalisation von CD24- und Sialyl-Lewis-X-Molekülen auf der Oberfläche von BT20-Zellen, die über CHO-e-Mono-Schichten rollten und an ihnen hafteten.

Diese Bilder zeigen eine Vergrößerung einer einzelnen BT-20-Zelle, in der CD24- und Sialinsäure-Moleküle gemeinsam lokalisiert sind und als gelbe bis orangefarbene Punkte erscheinen, wenn die rot und grün pseudofarben kodierten Emissionskanäle überlagert werden. Insgesamt zeigt diese Information, dass das Emissionsteilungssystem mit zwei Kameras über die räumliche, zeitliche und optische Auflösung verfügt, die erforderlich ist, um zelluläre und molekulare Merkmale in Anwendungen wie Adhäsionsassays in Flusskammern aufzudecken, bei denen sich die Zellen schnell durch das Sichtfeld bewegen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein Dual-Kamera-Emissionsaufteilungssystem einrichtet und kalibriert oder einen Adhäsionsassay in einer parallelen Platten-Flusskammer in Echtzeit in zwei Farben bildlich darstellt. Diese Methode kann auf andere In-vitro-Assays angewendet werden, die Fluoreszenz nutzen, um das Zellverhalten zu untersuchen.