Name: Gleichzeitig Capturing in Echtzeit Bilder in zwei Emissions Kanäle unter Verwendung eines Dual-Kamera-Emissions-Splitting-System: Anwendungen in der Zelladhäsion (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-04T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Lernen Sie die Einrichtung eines Dual-Kamera-Emissions-Splitting-Systems für Zelladhäsionsassays in Echtzeit. Diese Methode ermöglicht die simultane Aufnahme hochauflösender Bildsequenzen in zwei Farben.

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Die Autoren danken Dr. Douglas Goetz (Institut für Chemische und Biomolekulare Ingenieurwissenschaften, Ohio University) und Dr. Fabian Benencia (Department of Biomedical Sciences, Ohio University) für aufschlussreiche Diskussionen und Kritik Manuskript danken. Wir danken auch Dr. Christopher Huppenbauer für hilfreiche technische Diskussionen (W. Nuhsbaum Inc.). Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse von der National Science Foundation (CBET-1106118) und der National Institutes of Health (1R15CA161830-01) unterstützt.

1. Software-Installation <ol><li> Kaufen StreamPix 5 Multi-Kamera-Software mit SimulPix Modul oder andere Imaging-Software in der Lage, das Sammeln und Kombinieren von Bildern durch monochrome CCD-Kameras eingefangen. </li><li> Mindestanforderungen für StreamPix 5 sind: Ein PC mit Core 2 Duo ausgestattet mit 2,4 GHz oder besser mit 2 GB RAM oder höher. Ein unterstützter IEEE digitale oder analoge Kamera und kompatible Framegrabber. Windows-XP/7/Vista 32 oder 64 Bit. Ein Monitor mit Auflösung 1024 x 768 oder höher. Eine Grafikkarte mit guter 2D-Leistung (OCU auszudrücken 16x oder besser wird empfohlen) und 7200-RPM-Festplattenlaufwerk für die Aufzeichnung mit RAID-O-Konfiguration. </li></ol> 2. Installation von Dual-Kamera-System, das Zwei-Farben-Simultan-Echtzeit-Imaging <ol><li> Schließen Sie das DC2 Photometrics Emissions Splitter oder ähnliche Doppelkamera Emissionstrenneinrichtung, an das Mikroskop, indem Sie den DC2 C-Mount-Adapter in den Videoanschluss des MICROscope so dass das Gehäuse des dichroitischen auf der Vorrichtung zugänglich ist. </li><li> Legen Sie zwei monochrome CCD-Kameras in weibliche C-Mount-1 und weibliche C-Mount-2. Identische Kameras sind bevorzugt. Ähnliche Kameras verwendet werden, aber die Kompatibilität ist von internen Hardware, vor allem der CCD-Bildsensor. </li><li> Verwenden Imaging-Software, um Bilder von beiden Kameras anzuzeigen. Die folgenden Schritte (2.3.1 - 2.3.4) gelten für StreamPix 5 mit SimulPix Modul und muss für andere Multi-Kamera-Imaging-Software angepasst werden. <ol><li> Offene StreamPix 5 und wählen Sie &quot;Arbeitsplatz&quot; in der Task-Band. </li><li> Öffnen Sie &quot;Arbeitsbereich-Manager&quot; am rechten Bildschirmrand und wählen Sie &quot;neuen Arbeitsbereich&quot;. </li><li> Nach der Benennung eine Kamera, folgen Sie Software dazu aufgefordert, einen Grabber aus einem bereits besiedelten Liste auswählen. Wählen Sie den passenden Grabber das Kameramodell, und wiederholen Sie für die zweite Kamera Arbeitsbereich. Für die fusionierte Arbeitsbereich noch einmal wiederholen, aber &quot;alle Kameras im Einsatz sind&quot; Fehler message erscheint. Diese Meldung ist normal. </li><li> Sobald die fusionierte Arbeitsbereich geladen wird, weisen Kameras aus dem Arbeitsbereich 1 und 2 Arbeitsbereich zu dem neuen Arbeitsbereich in der auf der rechten Seite des Bildschirm befindet Docking Panel. </li></ol></li><li> Richten Kameras in der Dual-Kamera-Emissionsspaltsystem. <ol><li> Richten Kameras im Hellfeld oder Phasenkontrast mit dem Kalibrierungsgitter vom Hersteller mit einem PlanApo 40X-Objektiv (oder höher) zur Verfügung gestellt. </li><li> Senden Licht in die Mikroskop-Okulare, legen Sie die mit metallischem Überzug Kalibrierungsgitter, die vom Hersteller auf dem Mikroskoptisch zur Verfügung gestellt wurde, und die Quadratur des Rasters auf dem Mikroskoptisch. </li><li> Bringen Sie das Gitter in den Fokus. </li><li> Verdrängen, aber nicht entfernen, den dichroitischen Gehäuse Kamera 1 (Bypass-Kamera) auszurichten. Zeigen Sie das Netz ohne Binning und ohne Autoskalierung. Stellen Sie das Bild mit dem Scharfstellknopf auf C-Mount-Anschluss ein. </li><li> Schieben Sie das Gehäuse in die dichroitischen Dual channel Fassungseinrichtung vollständig, so dass das Bild durch den dichroitischen beiden Kameras aufgeteilt. </li><li> Lösen Sie die drei 5/64 &quot;Stellschrauben drehen und die zweite Kamera auf der weiblichen C-Mount-2, bis die Ausrichtung des Rasters ist in beiden Bildern identisch. Mit der Fokus-Einstellung Wahl auf C-Mount-Anschluss 2, bringen das Bild von der Kamera 2 in den Fokus. </li><li> Schließen Sie die Ausrichtung mit dem kombinierten Bild in der zusammengeführten Arbeitsbereich der Bildbearbeitungssoftware. Dies erlaubt es, eine Echtzeit-Pseudoüberlagerung der beiden Bilder des Kalibrierungsgitter sehen. Anpassen der Bildpositionen kombiniert mit nur einem R / L-Knopf auf der rechten Seite des DC2. Stellen Sie diesen Regler, bis rechts / links vertikale Begrenzung der Bilder wird präzise ausgerichtet. </li><li> Verwenden Sie die U / D-Regler, um den Auf / Ab-Ausrichtung des zweiten Bildes anpassen, bis die horizontalen Gitterstäbe richtig ausgerichtet sind. </li><li> Wenn während der Auf / Ab-Ausrichtung eine leichte Drehung der Kamera auftritt, dieses Problem zu korrigieren, indem Sie die drei 5/64 &quot;Zoll Eindrehenws zur Kamera 2 und zu drehen, bis das angezeigte Bild richtig ausgerichtet ist. </li></ol></li></ol> 3. Herstellung von Krebszellen für Parallel-Kennzeichen Flusskammer Adhäsionsassay <ol><li> Kultur BT-20-Brustkrebszellen in Minimum Essential Medium (MEM) ergänzt Medium mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin-Streptomycin bei 37 ° C und 5,0% CO 2, wie zuvor beschrieben 2 abzuschließen. </li><li> Ernte Krebszellen mit einer verdünnten Trypsin-Behandlung und zählen Zellen mit einer Zählkammer. </li><li> Wasch und Zellen zu suspendieren 10 7 Zellen / ml in 0,1% Albumin aus Rinderserum (BSA) in DPBS mit Calcium und Magnesium (DPBS +). </li><li> Verdünnte primäre Antikörper, gereinigtes Maus-anti-Mensch-CD24 und gereinigte Ratten HECA-452 (Anti-sialofucosylated Antigene), um eine vorbestimmte optimale Konzentration in 0,1% BSA-DPBS +. Zellen inkubieren 30 min 9, 10. </li><li> Centrifuge Zellen bei 1.200 min um ein Zellpellet zu erhalten. AspiRate primärer Antikörper, und waschen die Zellen zweimal mit 0,1% BSA DBPs +. </li><li> Verdünnte sekundäre Antikörper, Ziegen-Anti-Maus-IgG AlexaFluor 568 (Emissions max, 603 nm) und Ziege-anti-Ratte-IgM AlexaFluor 488 (Emissions max, 519 nm), um eine vorbestimmte optimale Konzentration in 0,1% BSA-DPBS +. Inkubieren Zellen für 30 min. </li><li> Waschen der Zellen zweimal auszusetzen 0,1% BSA in DPBS + 10 6 Zellen / ml in 0,1% BSA-DPBS +. </li></ol> 4. Herstellung von Reaktiv Substrat für Parallel-Kennzeichen Flusskammer Adhesion Assay <ol><li> Verbindung von zwei getrennten Rohrlängen zu den Einlass-und Auslassöffnungen der Parallelplattenflusskammer, die innerhalb eines 35-mm-Gewebekulturschale passt. Ein Rohr wird in das Reservoir der markierten Zellen in 0,1% BSA-DPBS + und das andere an der Spritzenpumpe, die Flüssigkeit bei einer bestimmten Strömungsgeschwindigkeit zurückzuziehen ausgesetzt verbinden. </li><li> Schließen Sie eine Vakuumleitung zur Strömungskammer ein. </li><li> Die Flusskammer Position über der 35 mm-Gewebekultur dish, das eine Monoschicht aus Ovarzellen des chinesischen Hamsters E-Selectin (CHO-E) exprimieren. CHO-E-Zellen wurden in MEM-Komplettmedium bei 37 ° C gezüchtet und 5,0% CO 2 2. </li><li> Die Durchflusskammer und / oder Strömungskammer Dichtung einen angemessenen Vakuumdichtung 1 zu gewährleisten. </li><li> Ziehen Flüssigkeit aus dem Behälter, die Überwachung der Durchflusskammer-Anordnung für die richtige Dichtung und ohne sichtbare Anzeichen von Luftblasenbildung ein. </li><li> Zeigen Flusskammer Montage auf Mikroskop (Leica DMI 6000B) ein. </li></ol> 5. Zwei-Farben-Bildaufnahme <ol><li> Strom ein Leica EL-6000 kompakte Lichtquelle, oder ein ähnliches Gerät, um Licht mit hoher Intensität und Paar es in einen Lichtleiter zu erzeugen. Verwenden Sie ein inverses Mikroskop, dieses Licht durch eine Kombination Filterwürfel, dh G / R (grün / rot) Filterwürfel passieren, um Fluorophore einer gewünschten Farbe / Intensität zu erregen. </li><li> Stellen Sie sicher, dichroitischen Gehäuse ist in der richtigen Arbeitsposition (depressiv) undnicht in den Bypass-Modus. </li><li> Betreiben Sie in der Fluoreszenz-Mikroskop-Modus und wählen Sie das richtige Fluoreszenzfilterwürfel (grün / rot). </li><li> Bestimmen Sie die Belichtungszeit und Gain-Kamera 1 (rot, 620 ± 60 nm) und die Kamera 2 (grün, 535 ± 40 nm). <ol><li> Drücken Sie den dichroitischen um Bilder sowohl in den roten und grünen Emissions Kanäle zu erhalten. Verwenden Sie eine Durchflusskammer-Assays mit Zellen nur mit dem roten Fluoreszenzfarbstoff markiert und erhalten ein Bild in den roten Kanal, indem die Belichtungszeit der Kamera 1 in &quot;Live-Einstellungen&quot; der Imaging-Software. </li><li> Passen Sie die Belichtungszeit der Kamera 2 auf die Belichtungszeit der Kamera ein. Wenn ein Bild in den grünen Kanal beobachtet, vorliegen Durchbluten Artefakte und die Belichtungszeit in beiden Kameras verringert werden muss. </li><li> Halten der Belichtungszeitwert in der Kamera 1 und Kamera 2, die Belichtungszeit zu verringern, bis das Durchbluten Artefakt nicht mehr im grünen Kanal sichtbar. Stellen Sie die Verstärkung der Kamera ein Bild zu verbessern visibility im roten Kanal, falls erforderlich. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 5.4.1 - 5.4.3 mit Zellen nur mit dem grünen Fluorophor markiert, aber definieren Belichtungszeit mit der Kamera 2 Bildzellen im grünen Kanal ohne Durchbluten Artefakte im roten Kanal von Kamera 1 gesammelt. </li><li> Retitrate Antikörper, wenn Durchbluten Artefakte nicht beseitigt werden 11, oder wenn Belichtungszeiten von Kamera 1 und Kamera 2 wesentlich sind solche, die zusammengeführt Bilder können zeitlich falsch ausgerichtet sein. </li></ol></li><li> Verwenden Imaging-Software, um Bilder gleichzeitig von zwei monochrome CCD-Kameras in der Flusskammer Experiment gefangen zu sehen. </li><li> Merge Bilder von beiden Kameras mit dem SimulPix Modul StreamPix 5 oder eine alternative Software-Paket gesammelt. </li><li> Verwenden digitalen Korrekturanpassungen in SimulPix oder alternative Software, um räumlich richten Sie die zusammengeführten Bilder, falls erforderlich. Bilder können mit dem Modul SimulPix für horizontale, vertikale korrigiert werdenUnd Dreheinstellungen. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Die Dual-Kamera-Emissionsspaltsystem hat die räumliche, zeitliche und optische Auflösung benötigt, um qualitativ hochwertige Bilder in Anwendungen, bei denen Zell-oder Molekularbewegung schnell ist zu erfassen. Bei der Erzeugung der repräsentative Ergebnisse, Parameter in der Dual-Kamera-Emissionsspaltsystem, einschließlich Software-Einstellungen und Kameraeinstellungen wurden optimiert, um eine zusammengeführte Bildfolge, in der Walz-und adhärenten Zellen waren zeitlich und räumlich ausgerichtet zu erhalten. Diese Opti...

Verfahren zur Analyse von Molekülen auf der Zelloberfläche, wie z. B. Immunfärbung Sonden einzusetzen, die chemisch mit Fluorophoren konjugiert sind, was den Nachweis von Zielmolekülen. Live-Cell-Imaging-und hydrodynamischen Fluss-basierte Zelladhäsionsassays werden typischerweise mit monochromen CCD-Kameras entwickelt, um physiologische Prozesse auf zellulärer und / oder molekularer Ebene 1, 2 erfassen aufgezeichnet. Diese Kameras sind sehr empfindlich, liefern schnelle Bildraten (mehr als 30 Bilder pro Sekunde) und bieten außergewöhnliche zeitliche Auflösung (durch schnelle Bildraten und kurzen Belichtungszeiten). Allerdings kann nur Monochrom-Kameras erfassen einen einzigen Emissionskanal (Erfassung eines einzelnen Fluorophors), um Bilder zu sammeln. Einzelne Kamera Emissions Splitting-Systeme können integriert werden, um mehrere Emissionskanäle zu erfassen, aber oft reduzieren das Sichtfeld und benötigen die gleiche Belichtungszeit für die Abbildung aller Kanäle. Um das volle Farbspektrum von Zellen mit multip beschriftet erfassenle Fluorophore, eine Farbkamera kann als Alternative verwendet werden. Allerdings sind Farbkameras in der Regel nicht in der Lage, die für Live-Cell-Imaging in bestimmten Anwendungen gewünschten zeitlichen Auflösung. Eine weitere bildgebende Gerät ist für Anwendungen, bei denen es vorteilhaft ist, Bild lebenden Zellen bei mehreren Wellenlängen ist, unter Beibehaltung einer hohen zeitlichen Auflösung benötigt. Ein Hauptanwendungsgebiet ist die experimentelle Parallelplattenflusskammer Adhäsionstest, in denen Zellen in physiologisch relevanten Bedingungen über einen potentiell reaktive Substrat 1, 3 perfundiert. Zellen, die in Strömungs spezifische Zelloberflächenmoleküle exprimieren, haften und rollen auf dem Substrat, beispielsweise eine Zell-Monoschicht exprimieren Adhäsionsmoleküle oder Oberfläche adsorbiert extrazelluläre Matrixproteine, 4, 5. Rollzellen können Rotations-und Translationsbewegung in Bruchteilen einer Sekunde durchlaufen. Molekularen Eigenschaften auf Walzen und adhärente Zellen, wie Cluster von Zelloberflächenmolekülen, auch die Potentiometeral aktive Reorganisation auf der Zelloberfläche zu unterziehen. Somit muß Abbildungssysteme eine außergewöhnliche zeitliche Auflösung liefern (30 Frames pro Sekunde oder mehr und &quot;nahe Null&quot; Belichtungszeiten), um eine Bildfolge, die die Schritt-für-Schritt-Fortschreiten der Zelle Walzen 6, 7 veranschaulicht zu erzeugen. Dual-Kamera-Emissionsspaltsysteme sind in der Lage, diese Anforderungen zu erfüllen für die Bildgebung von Zellen mit mehreren Fluorophoren markiert. Dual-Kamera-Emissionsspaltsysteme aufgeteilt und Filterfluoreszenzkanäle in zwei ähnliche Kameras erfassen gleichzeitig zwei räumlich identisch, aber Fluorophor spezifische Bilder unter Beibehaltung der vollen Sichtfeld. Diese Technologie ermöglicht den direkten Vergleich der in Echtzeit in jedem Kanal aufgenommene Bild und ermöglicht dem Benutzer, schnell zwischen Kamera-Modelle wechseln mit verschiedenen Imaging-Funktionen. Diese Funktion ist nützlich, um Einstellungen für Bild-Capture-Einstellungen in eine Kamera, die besser damit das System zu erfassenFluorophore mit unterschiedlichen Intensitäten, Gültigkeitsdauer und Extinktionskoeffizienten 8. Gekoppelt mit Imaging-Software, Dual-Kamera-Emissionsspalt Systeme ermöglichen die Echtzeit-Aufzeichnung von Live-Cell-Imaging-Tests in mehreren Wellenlängen und kann in vitro-Assays, die Fluoreszenz zu verwenden, um das Verhalten der Zelle untersuchen zu verbessern.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagenz/Material</td></tr><tr><td>BT-20 Zellen</td><td>ATCC</td><td>HTB-19</td><td></td></tr><tr><td>CHO-E Zellen</td><td>Geschenk von Dr. R. Sackstein (Brigham and Women' s Hospital, Harvard Medical School)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MEM </td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30024.01</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Thermo</td><td>Scientific SV30010</td><td></td></tr><tr><td>0.25% Trypsin / 0.1% EDTA</td><td>Thermo Scientific</td><td>SV30031.01</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30028.02</td><td></td></tr><tr><td>DPBS+</td><td>Life Technologies</td><td>14080-055</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>HECA-452 monoklonaler Antikörper</td><td>BD Biosciences</td><td>555946</td><td></td></tr><tr><td>monoklonaler Anti-Human-CD24-Antikörper</td><td>BD Biosciences</td><td>555426</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ratten-IgM AlexaFluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A21212</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Maus-IgG AlexaFluor 568</td><td>Invitrogen</td><td>A11004<</td><td></td></tr><tr>td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>EXi Blaue Fluoreszenzmikroskopie Digitale CCD-Kamera</td><td>Q Imaging</td><td>EXI-BLU-R-F-M-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Retiga EXi FAST 1394 Digitale CCD-Kamera</td><td>Q Imaging</td><td>RET-EXi-F-M-12-C</td><td></td></tr><tr><td>DC2 Emissionssplitter</td><td>Photometrie</td><td>DC2</td><td></td></tr><tr><td>Inverses Fluoreszenzmikroskop</td><td>Leica</td><td>DMI6000 B</td><td></td></tr><tr><td>Streampix 5 Software</td><td>Norpix</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

gleichzeitig capturing in echtzeit bilder in zwei emissions kanäle unter verwendung eines dual-kamera-emissions-splitting-system: anwendungen in der zelladhäsion

Simultaneously Capturing Real-time Images in Two Emission Channels Using a Dual Camera Emission Splitting System: Applications to Cell Adhesion

Multi-Color-Immunfluoreszenz-Mikroskopie, um bestimmte Moleküle in der Zellmembran erkennen kann, mit Parallelplattenlaufkammer Assays zu Mechanismen, die Zell-Adhäsion unter dynamischen Strömungsbedingungen zu untersuchen gekoppelt werden. Beispielsweise können Krebszellen mit mehreren Fluorophoren über eine möglicherweise reaktive Substrat zu modellieren Mechanismen der Krebsmetastasierung perfundiert werden. Allerdings, Multi-Channel einzelnen Kamera-Systeme und Farbkameras zeigen Mängel in der Bildaufnahme für die Echtzeit-Live-Zellanalyse. Um diese Einschränkungen zu überwinden, eine Dual-Kamera-Emissionsspaltsystem verwendeten wir gleichzeitig erfassen Echtzeit-Bildsequenzen von fluoreszenzmarkierten Zellen in der Flusskammer. Dual-Kamera-Systeme Emissionsspaltfilter definierten Wellenlängenbereichen in zwei monochrome CCD-Kameras, wodurch gleichzeitig erfassen zwei räumlich identisch, aber Fluorophor-spezifische Bilder. Anschließend werden psuedocolored Ein-Kanal-Bilder in einer einzigen kombiniertenEchtzeit-Sequenz zusammengeführt, die mehrere Zielmoleküle auf Zellen, die sich schnell über einen Bereich von Interesse offenbaren kann.

Eine Parallelplattenlaufkammer Haftung Assay wurde verwendet, um eine Dual-Kamera-Emissionsspaltsystem, die gleichzeitig in zwei Emissionskanäle erfasst Echtzeit-Bildsequenzen (Abbildung 1) zu demonstrieren. Die Dual-Kamera-Emissionsspaltsystem erkannt BT-20-Zellen, die mit Fluoreszenz-Anti-Human-CD24 und HECA-452 (Erkennung sialofucosylated Antigene) monoklonale Antikörper und entsprechenden Sekundärantikörper (Abbildung 2) markiert waren. Einige Roll Zellen angezeigt rote Signale (CD2...

Dual-Kamera-Emissionsspaltanlagen für zwei-Farben-Fluoreszenz-Mikroskopie erzeugen Echtzeit-Bildsequenzen mit außergewöhnlichen optischen und zeitlichen Auflösung, einem Bedarf von lebenden Zellassays einschließlich Parallelplattenlaufkammer Adhäsions-Assays. Als Software wird verwendet, um Bilder von gleichzeitig erworben Emissionskanäle verschmelzen, pseudocolored Bildsequenzen produziert.

Gleichzeitig Capturing in Echtzeit Bilder in zwei Emissions Kanäle unter Verwendung eines Dual-Kamera-Emissions-Splitting-System: Anwendungen in der Zelladhäsion

Multi-color immunofluorescence microscopy to detect specific molecules in the cell membrane can be coupled with parallel plate flow chamber assays to ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, einen Adhäsionsassay in einer Parallelplatten-Flusskammer mithilfe eines Systems zur Aufteilung der Emission auf zwei Kameras durchzuführen, um in Echtzeit Bildsequenzen in zwei Farben gleichzeitig aufzuzeichnen. Dazu werden zunächst die beiden Kameras der Abbildungseinrichtung justiert. Anschließend werden die Zellen und das reaktive Substrat vorbereitet und die Parallelplatten-Flusskammer aufgebaut.Die Kameraeinstellungen werden anschließend für die Aufnahme von Zwei-Farben-Bildern kalibriert, und es werden alle erforderlichen digitalen Korrekturen der Kameraausrichtung vorgenommen. Anschließend werden Bildsequenzen aufgezeichnet, die die Aufnahme von Zwei-Farben-Bildern mit hoher zeitlicher Auflösung veranschaulichen. Der Vorteil von Emissionsteilungssystemen mit zwei Kameras gegenüber Ein-Kamera-Systemen besteht darin, dass jeder Kamera unterschiedliche Belichtungszeiten zugewiesen werden können und das volle Sichtfeld beibehalten wird.Mit dieser Technik können zentrale Fragen auf dem Gebiet der Zelladhäsion beantwortet werden, beispielsweise wie die Lokalisation von Adhäsionsmolekülen auf der Zelloberfläche dynamische bio

simultaneously-capturing-real-time-images-two-emission-channels-using

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Die Aufspaltung der Proteine ​​entweder innerhalb der Plasmamembran oder in intrazellulären Orten eines Regulierungsmechanismus, stark beeinflussen können Signalisierung Ergebnisse, daher zu verstehen Signalisierung ist es wichtig, die räumliche und zeitliche Verhalten der beteiligten Proteine ​​zu untersuchen. Wir beschreiben hier eine TIRF-Mikroskopie basierendes System zur Signaltransduktion in T-Zellen zu studieren, aber ist breit anwendbar.

Ein TIRF Mikroskopie-Technik für Echtzeit-, Einzigartige Bilder aus dem TCR und der damit verbundenen Signalproteine

Förster Resonanz Energie Transfer (FRET)-Mikroskopie ist eine leistungsstarke Technik für die Echtzeit-Überwachung der Signalwege in lebenden Zellen mit verschiedenen Biosensoren als Reporter. Hier beschreiben wir, wie eine benutzerdefinierte Epifluoreszenz bauen FRET Imaging-System aus handelsüblichen Komponenten und wie es zu benutzen für Experimente FRET.

FRET-Mikroskopie zur Echtzeit-Überwachung der Signalisierung Events in lebenden Zellen mit unimolekularen Biosensors

Quelle: Bello-Gamboa, A. et al., Imaging the Human Immunological Synapse.J. Vis. Exp.(2019) Dieses Video zeigt die in vitro Studie der immunologischen Synapsenbildung zwischen einer Antigen-präsentierenden Zelle und Helfer-T-Lymphozyten unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops. T-Zell-Rezeptoren von T-Helfer-Lymphozyten interagieren mit einem Antigen-MHC-II-Komplex in Antigen-präsentierenden Zellen und bilden immunologische Synapsen, gefolgt von sekretorischen Vesikelbewegungen in Richtung...

Immunologische Synapsenbildung zwischen T-Helferzellen und Antigen-präsentierenden Zellen

Quelle: Kulkarni, M. et al. Bildgebung von Ca2+ Dynamik in den Axon-Terminals der Zapfen-Photorezeptoren der Netzhaut der Maus. J. Vis. Exp. (2015)Dieses Video zeigt den Einsatz der Zwei-Photonen-Mikroskopie zur Überwachung der Kalziumdynamik in Zapfen-Photorezeptoren einer transgenen Mausnetzhaut. Es beschreibt die Schritte zur Vorbereitung von Netzhautschnitten, zur Bildgebung von FRET-basierten Kalzium-Biosensoren und zur Analyse von Fluoreszenzänderungen zur Quantifizierung des...

Zwei-Photonen-Mikroskopie zur Überwachung der Kalziumdynamik in retinalen Zapfen-Photorezeptoren von Mäusen

Wir beschreiben eine Live-Cell-Imaging-Verfahren, das einen Einblick in die Dynamik Protein während der T-Zell-Aktivierung. Wir zeigen die kombinierte Nutzung des T-Zell-Ausbreitung Assay, konfokale Mikroskopie und Bildanalyse zu liefern quantitative Ergebnisse zu folgen Signalisierung Komplexbildung während T-Zell-Aktivierung.

Echtzeit-Live-Imaging von T-Zell-Signaling Complex Formation

Wir demonstrieren die Verwendung von Fluoreszenz-Photoaktivierungs-Lokalisierungsmikroskopie (FPALM), um gleichzeitig mehrere Arten von fluoreszenzmarkierten Molekülen in Zellen abzubilden. Die beschriebenen Techniken ermöglichen die Lokalisierung von Tausenden bis Hunderttausenden einzelner fluoreszierend markierter Proteine mit einer Genauigkeit von Dutzenden von Nanometern innerhalb einzelner Zellen.

Simultane Multicolor-Imaging biologischer Strukturen mit Fluoreszenzphotoaktivierung Lokalisationsmikroskopie

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die multi-Color Lokalisierung der einzelnen Membranproteine in Organellen der lebenden Zellen. Um Fluorophore zu befestigen, sind selbst Kennzeichnung Proteine verwendet. Proteine, befindet sich in verschiedenen Membranen Kompartimenten des die gleichen Organellen lokalisiert werden können, mit einer Genauigkeit von ~ 18 nm.

Multi-Color-Lokalisierung Mikroskopie des einzigen Membranproteine in Organellen der lebenden Säugetier-Zellen

Hier präsentieren wir Ihnen eine praktische Anleitung für eine integrierte Mikroskopie Bausystem, das konventionelle Epi-fluoreszierende Bildgebung, Einzelmolekül-Erkennung-basierte Höchstauflösung Bildgebung und Multi-Color Einzelmolekül-Erkennung übergeht, einschließlich Einzelmolekül-Fluoreszenz Resonanz Energietransfer imaging, in einer Aufspannung auf kostengünstige Weise.

Durchführung von mehreren Imaging-Modi mit einem Fluoreszenzmikroskop

Eine erweiterte Mikroskop, die es ermöglichen schnelle und hochauflösende werden Bildgebung des isolierten Plasmamembran sowohl die umliegenden intrazelluläre Volumen präsentiert. Die Integration von spinning-Disk und Gesamtbetrag interne Reflexion Fluoreszenzmikroskopie in einer Aufspannung ermöglicht live-imaging-Experimente bei hohen Erfassungsraten bis zu 3,5 s pro Bildstapel.

Visualisierung von Adhäsion Bildung in den Zellen durch erweiterte Spinning-Disk-Total Internal Reflection-Fluoreszenz-Mikroskopie

Wir beschreiben einen bildgebenden Ansatz zur Bestimmung des durchschnittlichen oligomeren Zustands von mEGFP-getaggten Rezeptor-Oligomeren, die durch Ligandenbindung in der Plasmamembran lebender Zellen induziert werden. Das Protokoll basiert auf der Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Mikroskopie in Kombination mit der Number and Brightness (N&amp;B)-Analyse.

Oligomerisierungsdynamik von Zelloberflächenrezeptoren in lebenden Zellen durch totale interne Reflexionsfluoreszenzmikroskopie kombiniert mit Zahlen- und Helligkeitsanalyse

Dieses Protokoll präsentiert eine Sammlung von Sarkomer-, Kalzium- und makroskopischen geometrischen Daten aus einer aktiv kontrahierenden Herztrabekula ex vivo. Diese simultanen Messungen werden durch die Integration von drei Bildgebungsmodalitäten ermöglicht.

Simultane Hellfeld-, Fluoreszenz- und optische Kohärenztomographische Bildgebung kontrahierender Herztrabekel Ex Vivo

Lernen Sie die Einrichtung eines Dual-Kamera-Emissions-Splitting-Systems für Zelladhäsionsassays in Echtzeit. Diese Methode ermöglicht die simultane Aufnahme hochauflösender Bildsequenzen in zwei Farben.

Gleichzeitig Capturing in Echtzeit Bilder in zwei Emissions Kanäle unter Verwendung eines Dual-Kamera-Emissions-Splitting-System: Anwendungen in der Zelladhäsion (Video) | JoVE Journal

Gleichzeitig Capturing in Echtzeit Bilder in zwei Emissions Kanäle unter Verwendung eines Dual-Kamera-Emissions-Splitting-System: Anwendungen in der Zelladhäsion

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