Bewertung der chimären Antigenrezeptor-T-Zell-assoziierten Toxizität unter Verwendung eines Xenograft-Mausmodells für Patienten mit akuter lymphatischer Leukämie

Dieses Protokoll verwendet menschliche CAR-T- und Tumorzellen und demonstriert genau die Toxizitäten, die mit der Verabreichung von CART19 verbunden sind. Daher rekapitulieren wir, was in der Klinik beobachtet wurde. Der Hauptvorteil dieser Plattform besteht darin, dass sie ein übersetzbares und klinisch relevantes Modell bietet, bei dem menschliche T-Zellen und Tumorzellen verwendet werden.

Dieses Modell ermöglicht nicht nur eine effiziente Bewertung von CART19-assoziierten Toxizitäten, sondern ermöglicht es uns auch, besser zu verstehen, wie wir diese Toxizitäten durch verbesserte Behandlungsstrategien überwinden können. Überwachen Sie zunächst die zweimal täglich verabreichten CART19-Mäuse, um Veränderungen ihres Wohlbefindens zu beurteilen, wie z. B. motorische Schwäche, gekrümmter Körper und Gewichtsverlust. Sobald die Mäuse motorische Schwäche und Gewichtsreduktion entwickeln, wird ihr peripheres Blut entnommen, um die Tumorlast zu analysieren.

Und führen Sie eine Serumisolierung für Zytokine durch, wie im Manuskript beschrieben. Nach der Isolierung werden die Serum-Mikrozentrifugenröhrchen bei 80 Grad Celsius gelagert und mit dem Cera die Chemokine und Zytokine mit dem Multiplex-Assay analysiert. Für die MRT-Bildgebung werden 120 Mikroliter Gadolinium mit 880 Mikrolitern Kochsalzlösung gemischt und in eine Ein-Milliliter-Insulinspritze gegeben.

Injizieren Sie 100 Mikroliter der zubereiteten Lösung intraperitoneal in jede Maus. Betäuben Sie die Maus und legen Sie sie auf die Nagetier-kompatible Cradle-Sonde. Dann die Zähne an der Beißstange einhaken.

Ziehen Sie den Kopf der Maus in die 25-Millimeter-Volumenspule und stellen Sie den Nasenkonus ein, der mit dem Isofluran-Anästhesiesystem verbunden ist. Ziehen Sie den Knopf der Beißleiste fest, um die Position für die Dauer des Scans beizubehalten. Befestigen Sie zur Beurteilung der Atmung die Sonde eines Atemüberwachungsgeräts in der Nähe des Zwerchfells und befestigen Sie sie mit chirurgischem Klebeband.

Halten Sie die Atemfrequenz zwischen 20 und 60 Atemzügen pro Minute, damit der Zustand der Mäuse stabil bleibt. Führen Sie die Tiersonde in die kleine Bohrung innerhalb des Vertical Bore Small Animal MRT-Systems ein und stellen Sie den Kopf des Tieres in der Mitte der Spule ein. Sichern Sie das Gerät mit dem Schloss in aufrechter Position und schließen Sie das Gerät an den Computer an.

Öffnen Sie als Nächstes die ParaVision-Software, um die Scanpositionen und Scantypen einzurichten. Bestimmen Sie die optimalen sagittalen und axialen Positionen, während Sie sie für alle Versuchsgruppen konsistent halten. Um die T1-gewichteten MRT-Daten zu erfassen, verwenden Sie eine T1-gewichtete Multi-Slice-Multi-Echo-Sequenz mit einer Wiederholungszeit von 300 Millisekunden, einer Echozeit von 9,5 Millisekunden, einem Sichtfeld von 4,00 x 2,00 x 2,00 Zentimetern und einer Matrix von 192 x 96 x 96.

Verwenden Sie für T2-gewichtete MRT-Bilder eine Multi-Slice-Multi-Echo-Sequenz mit ähnlichen Parametern. Sobald die Scans abgeschlossen sind, entfernen Sie die Sonde aus der Bohrung und ziehen Sie die Maus vorsichtig heraus, indem Sie die Zähne von der Beißstange entfernen. Nach der Extraktion der Daten aus der Software wurde eine Analysesoftware für die Quantifizierung und das 3D-Volumen-Rendering der Hyperintensitätsregionen verwendet CD19+ Tumorzellpopulationen wurden zwischen Mäusen, die mit CART19 behandelt wurden, und unbehandelten Mäusen mit Durchflusszytometrie verglichen.

Eine signifikante Gewichtsreduktion wurde bei Mäusen beobachtet, die mit CART19-Zellen behandelt wurden. Gewichtsverlust wird als Symptom des CRS-Auftretens angesehen, das mit CART-Zell-assoziierten Toxizitäten zusammenhängt. Ein Multiplex-Assay zeigte die Expression von Zytokinen und Chemokinen im Serum von NSG-Mäusen vor und nach der Verabreichung von CART19.

T2-gewichtete Bilder zeigten Hinweise auf Ödeme und mögliches entzündliches Infiltrat während der Neuroinflammation bei CART19-behandelten Mäusen. Die T1-gewichtete MRT zeigte eine Kontrastmittelverstärkung innerhalb des Hirnparenchyms, was auf eine erhöhte Gefäßpermeabilität hindeutet. Dreidimensionale Rekonstruktionen des Nagetiergehirns wurden auf der Grundlage von T1-Hyperintensitätsregionen zusammengestellt, die der vaskulären Permeabilität entsprechen, die das Volumen des Gadolinium-Austritts im Gehirn wiedergibt.

Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass die tägliche körperliche Überwachung der Mäuse nach der Verabreichung von CART19 zusammen mit peripheren Blutungen der beste Indikator ist, um mit der MRT fortzufahren, um Veränderungen im Gehirn, die auf CRS oder Neurotoxizität hinweisen, vollständig zu beurteilen. Diese Technologie ist auf weitere CAR-T-Zell-Therapien anwendbar und wird es Wissenschaftlern ermöglichen, potenzielle Toxizitäten, die sich aus neuartigen CAR-T-Zellen ergeben, effizient zu testen. Dieses vorgeschlagene Modell ist ein Sprungbrett, um zu verstehen, wie CAR-T-Zell-assoziierte Toxizitäten überwacht, behandelt und zur Validierung neuer CAR-T-Zell-Modelle verwendet werden können.