Name: Bewertung der chimären Antigenrezeptor-T-Zell-assoziierten Toxizität unter Verwendung eines Xenograft-Mausmodells für Patienten mit akuter lymphatischer Leukämie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-10T12:35:00.000+00:00
Duration: 6 min 8 s
Description: Erfahren Sie die Bewertung von CAR-T-Zell-Toxizitäten bei akuter lymphatischer Leukämie unter Verwendung eines patientenbezogenen Xenograft-Mausmodells. Diese Methode ermöglicht klinisch relevante Erkenntnisse für sicherere Immuntherapiestrategien.

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Diese Arbeit wurde teilweise durch die National Institutes of Health (R37CA266344, 1K99CA273304), das Verteidigungsministerium (CA201127), die K2R-Pipeline der Mayo Clinic (S.S.K.), das Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (S.S.K.) und die Predolin Foundation (R.L.S.) unterstützt. Darüber hinaus möchten wir uns bei den Mitarbeitern der Mayo Clinic NMR Core Facility bedanken. Abbildung 1 wurde im Jahr BioRender.com

Dieses Protokoll folgt den Richtlinien des Institutional Review Board (IRB), des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC A00001767) und des Institutional Biosafety Committee (IBC, Bios00000006.04) der Mayo Clinic.
HINWEIS: Alle Materialien, die für die Arbeit mit Mäusen verwendet werden, müssen steril sein.
1. Injektion von Busulfan an NSG-Mäuse
<ol><li>Besorgen Sie sich männliche, 8-12 Wochen alte, immungeschwächte NOD-SCID IL2rγnull (NSG) Mäuse und wiegen Sie sie vor der Injektion. HINWEIS: Für statistische Signifikanz wird empfohlen, mindestens fünf Mäuse pro Gruppe zu verwenden und dieses Experiment mindestens einmal mit weiblichen Mäusen zu wiederholen.</li>
	<li>Bereiten Sie Busulfan für die intraperitoneale (i.p.) Injektion vor. Füllen Sie die Spritze mit einer 1-ml-Insulinspritze langsam und vorsichtig mit genau 30 mg/kg Busulfan, gefolgt von einer i.p.-Injektion an die Mäuse, und setzen Sie sie zurück in den Käfig.</li>
</ol>2. Injektion von ALLEN patienteneigenen Blasten (CD19+) in die NSG-Mäuse
HINWEIS: Dieses Protokoll folgt den Richtlinien des Institutional Biosafety Committee (IBC, Bios00000006.04) der Mayo Clinic.
<ol><li>Entnahme von primären leukämischen Blasten aus dem peripheren Blut von Patienten mit rezidivierter und refraktärer ALL.</li>
	<li>Bereiten Sie die Zielzellen für die intravenöse (i.v.) Injektion vor.<ol><li>Zählen Sie CD19+ -Zielzellen mit einem Hämozytometer und zeichnen Sie das endgültige Volumen und die Konzentration der Zellen auf. HINWEIS: Um die Zelllebensfähigkeit zu bestimmen, wird dringend empfohlen, Trypanblau beim Zählen der Zellen zu verwenden.</li>
		<li>Die Zellen werden durch Zentrifugation bei 300 × g für 5 min bei 4 °C pelletiert.</li>
		<li>Das Zellpellet wird in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) auf eine Endkonzentration von 50 × 106 Zellen/ml in einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen resuspendiert und auf Eis gelegt.</li>
		<li>Das 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit den Zielzellen mit dem Finger vortexen, bis die Zellen vollständig homogenisiert sind.</li>
		<li>Füllen Sie die Spritze mit einer 1-ml-Insulinspritze langsam und vorsichtig mit genau 100 μl der vorbereiteten Zielzellen und schnippen Sie die Spritze, um Blasen zu entfernen. HINWEIS: Das Volumen von 100 μl reicht für die Verabreichung von 5 × 106 Zellen an jede Maus.</li>
		<li>Legen Sie die Mäuse für 5-10 Minuten unter warmes Licht. Sobald die Schwanzvene angeschwollen und mit bloßem Auge besser sichtbar ist, setzen Sie die Mäuse in eine geeignete Einsperr-/Fixierungskammer.</li>
		<li>Wischen Sie den Schwanz der Maus mit einem Alkoholtupfer ab. Injizieren Sie die Zielzellen direkt in die Schwanzvene (i.v.) und setzen Sie die Maus zurück in den Käfig. Nach der Inokulation der Zielzellen sind die Mäuse täglich oder wie von der örtlichen Tierethikkommission empfohlen zu überwachen.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Beurteilung des Tumortransplantats
<ol><li>Beurteilen Sie ab 6 Wochen nach der Injektion der Zielzelle das Tumortransplantat, indem Sie die Expression von CD19+ -Zellen im peripheren Blut mittels Durchflusszytometrie messen.</li>
	<li>Peripherer Bluttest zur Beurteilung der CD19+ -Expansion<ol><li>Entnehmen Sie den Mäusen 6-8 Wochen nach der Injektion der CART19-Zellen Blut. HINWEIS: Es gibt verschiedene Methoden, um Blut zu entnehmen. Für dieses Protokoll ist die submandibuläre Blutentnahme die bevorzugte Methode der Wahl.</li>
		<li>Die Maus wird mit Isofluran in einer Induktionskammer mit 5% Isofluran anästhesiert. Sobald die Anästhesie erreicht ist, wird das durch einen Nasenkegel eingeatmete Isofluran bei 1-3% gehalten. HINWEIS: Es wird dringend empfohlen, Augensalbe aufzutragen, um Augentrockenheit zu verhindern.</li>
		<li>Nehmen Sie die Maus aus der Kammer und halten Sie die Maus mit der nicht-dominanten Hand fest, indem Sie die lose Haut über dem Hals greifen. Punktieren Sie die Vene mit einer Lanzette etwas hinter dem Unterkiefer. HINWEIS: Nur die Spitze der Nadel (1-2 mm) ist erforderlich, um in die Vene einzudringen.</li>
		<li>Wenn das Blut tropft, sammeln Sie mindestens 50 μl in einem mit Heparin beschichteten Röhrchen und mischen Sie es gut, indem Sie das Röhrchen mehrmals auf und ab drehen. 30 μl Blut in ein 5-ml-Polystyrolröhrchen mit rundem Boden überführen. HINWEIS: Für das verbleibende Blut das Röhrchen bei 17.000 × g 10 Minuten bei 4 °C nach unten schleudern. Das Serum (überstehende Schicht) wird in ein sauberes und beschriftetes 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführt und bei −80 °C gelagert (zur Verwendung im Zytokin-Assay).</li>
		<li>2 ml Lysepuffer (10-facher Lysepuffer auf Ammoniumchlorid-Basis, mit nukleasefreiem Wasser auf 1x verdünnt) in das 5-ml-Röhrchen mit rundem Boden geben, das das Blut enthält. Sehr gut mischen, indem man das Röhrchen verwirbelt. Inkubieren Sie das Röhrchen 20 Minuten lang bei Raumtemperatur, um eine ordnungsgemäße Lyse der roten Blutkörperchen zu gewährleisten.</li>
		<li>2 ml Flusspuffer (PBS, 0,2 g/l Kaliumchlorid, 0,2 g/l einbasisches Kaliumphosphat, 8 g/l Natriumchlorid und 1,15 g/l dibasisches Natriumphosphat mit 2 % fötalem Rinderserum und 1 % Natriumazid) hinzufügen.</li>
		<li>Das Röhrchen wird bei 300 × g 5 min bei 4 °C zentrifugiert. Dekantieren Sie den Überstand und fügen Sie 2 ml Durchflusspuffer hinzu. Wiederholen Sie diesen Waschschritt 2x.</li>
		<li>Den Inhalt der Tube vorsichtig umfüllen. Beobachten Sie die geringe Menge an Flüssigkeit mit einem Pellet, das im Röhrchen verbleibt. Fügen Sie 100 μl Flusspuffer hinzu und resuspendieren Sie ihn sehr gut.</li>
		<li>Die gesamte verbleibende Flüssigkeit im 5-ml-Durchflussrohr wird in eine 96-Well-Platte überführt. Stellen Sie sicher, dass jede Probe ordnungsgemäß beschriftet ist. Geben Sie 100 μl Durchflusspuffer in die entsprechenden Vertiefungen und zentrifugieren Sie die 96-Well-Platte bei 650 × g für 3 Minuten bei 4 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Beurteilung der Expansion der CD19+ -Zielzellen mittels Durchflusszytometrie (Abbildung 2).<ol><li>Bereiten Sie eine Mastermischung vor, die 0,3 μl Lebend-/Totfärbung, 0,13 μg (2,5 μl) Anti-Human-CD19-Antikörper, 0,06 μg (2,5 μl) Anti-Human-CD45-Antikörper, 5 μg (2,5 μl) Anti-Maus-CD45 und 42,2 μl Flusspuffer für insgesamt 50 μl pro Probe enthält. Im Dunkeln bei Raumtemperatur 15 min inkubieren.</li>
		<li>Mit 150 μl Fließpuffer waschen und anschließend bei 650 × g für 3 min bei 4 °C zentrifugieren. Dekantieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 195 μl Flusspuffer und 5 μl Zählperlen.</li>
		<li>Erfassen Sie auf einem Durchflusszytometer, um das Niveau der CD19+ -Zellexpression zu bestimmen. Zu Gating- und Analysezwecken wird zuerst die interessierende Population (CD19+) basierend auf den Vorwärts- und Seitenstreueigenschaften gegatet, gefolgt von einer einzelnen Gating-Population und dann lebenden Zellen. Sobald die lebenden Zellen mit Gates versehen sind, beurteilen Sie die CD45-Population des Menschen im Vergleich zur CD45-Population der Maus und gleiten Sie aus der menschlichen Population die CD19+ -Zielpopulation aus.</li>
	</ol></li>
	<li>Quantifizieren, um die in 70 μl vorhandene Menge zu bestimmen, und dann in Zellen/μl unter Verwendung von Gleichung (1) ausdrücken: Absolute CD19+-Zellzahl = ([CD19+-Zellen/Zählkügelchen] × Anzahl der Zählkügelchen innerhalb von 5 μl)/70 HINWEIS: Wiederholen Sie den peripheren Bluttest alle 5 Tage, um die CD19+ -Zellexpansion zu beurteilen. Sammeln Sie nicht mehr als 200 μl Blut kumulativ alle 2 Wochen in Übereinstimmung mit den Richtlinien der örtlichen Tierethikkommission. Sobald die Mäuse eine Krankheitslast von ≥10 Zellen/μl erreicht haben, randomisieren sie sie in CART19-Zell- oder Kontrollgruppen (Abschnitt 4).</li>
</ol>4. Verabreichung von CART19-Zellen in vivo
<ol><li>Präparation der CART19-Zellen (~Tag 80): HINWEIS: Die Generierung von CART19-Zellen wurde zuvor veröffentlicht 27,30,31. Dieses Verfahren muss in einer Biosicherheitswerkbank der Stufe 2+ mit aseptischer Technik und persönlicher Schutzausrüstung durchgeführt werden.<ol><li>Die CART19-Zellen in einem Wasserbadbehälter (37 °C) auftauen. Waschen Sie dann die Zellen in warmem T-Zell-Medium (TCM), um das Dimethylsulfoxid zu entfernen. HINWEIS: TCM besteht aus 10% humanem AB-Serum (v/v), 1% Penicillin-Streptomycin-Glutamin (v/v) und serumfreiem hämatopoetischem Zellmedium27,30.</li>
		<li>Die CART19-Zellen werden bei 300 × g 8 min bei 4 °C zentrifugiert und in warmer TCM auf eine Endkonzentration von 2 × 106 Zellen/ml resuspendiert. Lassen Sie die CART-Zellen über Nacht, jedoch nicht länger als 16 Stunden, in einem Inkubator (37 °C, 5 % CO2) ruhen.</li>
	</ol></li>
	<li>Verabreichung von CART19-Zellen per i.v. Injektion (Tag ~80)<ol><li>Zählen Sie die CART19-Zellen und schleudern Sie sie bei 300 × g für 8 Minuten bei 4 °C.</li>
		<li>Die CART19-Zellen werden mit 10 ml PBS resuspendiert und bei 300 × g für 8 Minuten bei 4 °C heruntergeschleudert.</li>
		<li>Resuspendieren Sie die CART19-Zellen mit PBS auf eine Endkonzentration von 40 × 106 Zellen/ml, überführen Sie die Zellen in ein steriles 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und legen Sie sie auf Eis.</li>
		<li>Führen Sie CART19-Zellschwanzveneninjektionen (wie oben beschrieben) durch, indem Sie 100 μl resuspendierte Zellen i.v. injizieren. HINWEIS: Ein Volumen von 100 μl reicht für die Verabreichung von 4 × 106 Zellen an jede Maus. Schließen Sie eine Gruppe unbehandelter Mäuse als Negativkontrolle ein.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Bewertung der zellassoziierten Toxizität von CART19
<ol><li>Überwachen Sie die Mäuse nach der Verabreichung von CART19-Zellen 2x täglich, um Veränderungen ihres Wohlbefindens zu beurteilen, wie z. B. motorische Schwäche, gekrümmter Körper und Gewichtsverlust. HINWEIS: Alle diese körperlichen Veränderungen korrelieren mit CRS-Symptomen in diesem Modell28.</li>
	<li>Sobald die Mäuse beginnen, eine motorische Schwäche und eine Gewichtsreduktion zu entwickeln (10-20 % Reduktion gegenüber dem Ausgangswert), wird peripheres Blut entnommen, um die Tumorlast zu analysieren, und eine Serumisolierung auf Zytokine gemäß der in Abschnitt 3 beschriebenen Methodik durchgeführt (Abbildung 3).</li>
	<li>Lagern Sie die Serum-Mikrozentrifugenröhrchen bei −80 °C und verwenden Sie die Seren, um die Chemokine und Zytokine mit einem Multiplex-Assay zu analysieren (Abbildung 4). HINWEIS: Wenn die Mäuse Anzeichen einer Lähmung der Hintergliedmaßen zeigen, moribund oder lethargisch erscheinen und der Gewichtsverlust > 20% ihres Körpergewichts beträgt, bis zu dem Punkt, der ihre Fähigkeit einschränkt, Nahrung und/oder Wasser zu erreichen, dann werden sie der Euthanasie unterzogen.</li>
</ol>6. MRT-Bildgebung
ANMERKUNG: Ein präklinischer (für Kleintiere) MRT-Scanner mit einem Magneten mit vertikaler Bohrung wurde für die in vivo Magnetresonanz und Bildaufnahme verwendet32,33.
<ol><li>Mischen Sie 120 μl Gadolinium + 880 μl Kochsalzlösung und geben Sie sie in eine 1-ml-Insulinspritze. Injizieren Sie 100 μl in jede Maus (i.p.). HINWEIS: Gadolinium sollte 15-20 Minuten vor Beginn des Experiments injiziert werden.</li>
	<li>Die Maus wird mit Isofluran (2-3%) in einer Induktionskammer für 10-15 Minuten anästhesiert. HINWEIS: Es wird dringend empfohlen, Augensalbe aufzutragen, um Augentrockenheit zu verhindern.</li>
	<li>Legen Sie die Mauswirbelsäule auf die Nagetier-kompatible Cradle-Sonde. Positionieren Sie dann die Maus, indem Sie ihre Zähne in die Beißleiste einhaken.</li>
	<li>Ziehen Sie den Kopf der Maus in die 25-mm-Volumenspule und stellen Sie den Nasenkonus ein, der mit dem Isofluran-Anästhesiesystem verbunden ist. Ziehen Sie den Knopf der Beißleiste fest, um die Position für die Dauer des Scans beizubehalten. HINWEIS: Wenn Sie eine kontrastmittelverstärkte MRT-Untersuchung durchführen, stellen Sie sicher, dass das Gadolinium (in diesem Fall) oder das Kontrastmittel mindestens 10 Minuten vor dem Einsetzen des Geräts in den Bohrungsmagneten injiziert wird. Während der gesamten Zeit der Bildgebung werden die Mäuse durch die Inhalation von 2-3% Isofluran in der Luft über den Nasenkonus betäubt und gleichzeitig ihre Atemfrequenz überwacht.</li>
	<li>Verwenden Sie zur Beurteilung der Atmung ein Atem-/Atemüberwachungsgerät. HINWEIS: Es ist wichtig, auch die Körpertemperatur zu bestimmen, um eine mögliche Unterkühlung aufgrund einer längeren Anästhesieexposition zu verhindern. Es wird empfohlen, Wärmekissen zu verwenden, um die Körpertemperatur zu kontrollieren.<ol><li>Befestigen Sie die Atemmonitorsonde in der Nähe des Zwerchfells und befestigen Sie sie mit chirurgischem Klebeband. Halten Sie die Atemfrequenz zwischen 20 und 60 Atemzügen pro Minute, damit der Zustand der Maus stabil ist. HINWEIS: Diese Rate sorgt für stabilere MRT-Bilder und verhindert Bewegungsartefakte im aufgenommenen Bild. Wenn die Atemfrequenz höher als der Bereich von 20-60 Atemzügen pro Minute ist, erhöhen Sie die Konzentration von Isofluran. Wenn die Atemfrequenz weniger als 20 Atemzüge pro Minute beträgt, ist die Anästhesie zu tief; Daher muss die Konzentration verringert werden.</li>
	</ol></li>
	<li>Führen Sie die Tiersonde in die kleine Bohrung innerhalb des Kleintier-MRT-Systems mit vertikaler Bohrung ein. Stellen Sie den Kopf des Tieres in der Mitte der Spule ein. Sichern Sie das Gerät mit dem Schloss, damit es aufrecht stehen kann, und schließen Sie das Gerät an den Computer an.</li>
	<li>Öffnen und verwenden Sie die Software (z. B. Paravision), um die Scanpositionen und Scantypen einzurichten. Bestimmen Sie die optimalen axialen und sagittalen Positionen, während Sie sie für alle Versuchsgruppen konsistent halten. HINWEIS: Es wird empfohlen, die Aufnahme eines Probescans als Referenz vor den eigentlichen MRT-Scans in voller Länge zu verwenden.</li>
	<li>Fahren Sie mit der MRT-Datenerfassung fort (wie zuvor beschrieben32,34,35,36). Erhalten Sie sowohl T1-gewichtete als auch T2-gewichtete MRT-Bilder mit dem unten empfohlenen Aufbau.<ol><li>Verwenden Sie für T1-gewichtete MRT-Bilder die T1-gewichtete Multislice-Multiecho-Sequenz (MSME) mit einer Wiederholungszeit (TR) von 300 ms, einer Echozeit (TE) von 9,5 ms, einem Sichtfeld (FOV) von 4 cm x 2 cm x 2 cm und einer Matrix von 192 x 96 x 96.</li>
		<li>Für T2-gewichtete MRT-Bilder wurde eine Multislice-Multiecho-Sequenz (MSME) mit einer TR von 300 ms, einer TE von 9,5 ms, einem FOV von 4 cm x 2 cm x 2 cm und einer Matrix von 192 x 96 x 96 verwendet.</li>
	</ol></li>
	<li>Sobald die Scans abgeschlossen sind, entfernen Sie die Sonde aus der Bohrung. Entferne die Maus vorsichtig, indem du die Zähne von der Beißstange entfernst. Überwachen Sie das Tier in einem separaten Käfig, bis es wieder bei vollem Bewusstsein ist und eine ausreichende motorische Funktion wiedererlangt hat.</li>
	<li>Verwenden Sie nach der Extraktion der Daten aus der Software eine Analysesoftware für die Quantifizierung und das 3D-Volumen-Rendering (Abbildung 4) der Hyperintensitätsregionen. HINWEIS: Wenn möglich, wird dringend empfohlen, zwei separate verblindete Beobachter für die Datenanalyse zu haben.</li>
</ol>

S.S.K. ist Erfinder von Patenten auf dem Gebiet der CAR-Immuntherapie, die an Novartis (durch eine Vereinbarung zwischen der Mayo Clinic, der University of Pennsylvania und Novartis) und an Mettaforge (über die Mayo Clinic) lizenziert sind. R.L.S. und S.S.K. sind Erfinder von Patenten auf dem Gebiet der CAR-Immuntherapie, die an Humanigen lizenziert sind. S.S.K. erhält Forschungsgelder von Kite, Gilead, Juno, Celgene, Novartis, Humanigen, MorphoSys, Tolero, Sunesis, Leahlabs und Lentigen.

In diesem Bericht wurde eine Methodik zur Bewertung von CART-Zell-assoziierten Toxizitäten unter Verwendung eines ALL-PDX-Modells beschrieben. Genauer gesagt versucht dieses Modell, zwei lebensbedrohliche Toxizitäten, CRS und NI, nachzuahmen, die Patienten häufig nach der Infusion von CART-Zellen erleben. Es rekapituliert viele Kennzeichen von CART-Toxizitäten, die in der Klinik beobachtet wurden: Gewichtsverlust, motorische Dysfunktion, Neuroinflammation, entzündliche Zytokin- und Chemokinproduktion und die Infiltration...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/64535">Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-derived Xenograft Mouse Model</a>. The Authors section was updated from:
Claudia Manriquez Roman1,2,3,4,5 
R. Leo Sakemura1,2 
Fang Jin6 
Roman H. Khadka6 
Mohamad M. Adada1,2 
Elizabeth L. Siegler1,2 
Aaron J. Johnson6 
Saad S. Kenderian1,2,6 
1T Cell Engineering Laboratory, Mayo Clinic, Rochester, 
2Division of Hematology, Mayo Clinic, Rochester, 
3Mayo Clinic Graduate School of Biomedical Sciences, Mayo Clinic, Rochester, 
4Department of Molecular Medicine, Mayo Clinic, Rochester, 
5Regenerative Sciences PhD Program, Mayo Clinic, Rochester, 
6Department of Immunology, Mayo Clinic, Rochester
to:
Claudia Manriquez Roman1,2,3,4,5 
R. Leo Sakemura1,2 
Brooke L. Kimball1,2 
Fang Jin6 
Roman H. Khadka6 
Mohamad M. Adada1,2 
Elizabeth L. Siegler1,2 
Aaron J. Johnson6 
Saad S. Kenderian1,2,6 
1T Cell Engineering Laboratory, Mayo Clinic, Rochester, 
2Division of Hematology, Mayo Clinic, Rochester, 
3Mayo Clinic Graduate School of Biomedical Sciences, Mayo Clinic, Rochester, 
4Department of Molecular Medicine, Mayo Clinic, Rochester, 
5Regenerative Sciences PhD Program, Mayo Clinic, Rochester, 
6Department of Immunology, Mayo Clinic, Rochester

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/64535">Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-derived Xenograft Mouse Model</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-derived Xenograft Mouse Model

Die chimäre Antigenrezeptor-T-Zelltherapie (CART) hat die Krebsimmuntherapie revolutioniert. Es hat sich als erfolgreich bei der Behandlung von rezidivierter/refraktärer akuter lymphatischer Leukämie (ALL), großzelligem B-Zell-Lymphom, Mantelzell-Lymphom, follikulärem Lymphom und multiplem Myelom 1,2,3,4,5,6,7 erwiesen, was zu den jüngsten FDA-Zulassungen geführt hat. Trotz der anfänglichen Erfolge in klinischen Studien führt die Behandlung mit der CART-Zelltherapie zu Toxizitäten, die oft schwerwiegend und gelegentlich tödlich sind. Zu den häufigsten Toxizitäten nach CART-Zelltherapie gehört die Entwicklung von CRS und NI, die auch als Immuneffektorzell-assoziiertes Neurotoxizitätssyndrom (ICANS) bezeichnet werden8,9. CRS wird durch die Überaktivierung und massive Expansion von CART-Zellen in vivo verursacht, was zur anschließenden Sekretion mehrerer inflammatorischer Zytokine führt, darunter Interferon-γ, Tumornekrosefaktor-α, Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF) und Interleukin-6 (IL-6). Dies führt zu Hypotonie, hohem Fieber, Kapillarlecksyndrom, Atemversagen, Multiorganversagen und in einigen Fällen zum Tod10,11. CRS entwickelt sich in 50-100% der Fälle nach CART19-Zelltherapie11,12,13. ICANS ist ein weiteres einzigartiges unerwünschtes Ereignis im Zusammenhang mit der CART-Zelltherapie und ist gekennzeichnet durch generalisierte Hirnödeme, Verwirrtheit, Benommenheit, Aphasie, motorische Schwäche und gelegentlich Krampfanfälle 9,14. Jeder Grad von ICANS tritt bei bis zu 70 % der Patienten auf, und die Grade 3-4 werden bei 20-30 % der Patienten berichtet 5,10,15,16. Insgesamt sind CRS und ICANS weit verbreitet und können tödlich sein.
Die Behandlung von ICANS nach einer CART-Zelltherapie ist eine Herausforderung. Bei den meisten Patienten mit ICANS kommt es auch zu CRS17, das häufig mit dem IL-6-Rezeptorantagonisten Tocilizumab oder Steroiden18 behandelt werden kann. Ein früherer Bericht zeigte, dass eine frühzeitige Intervention mit Tocilizumab die Rate des schweren CRS verringerte, aber keinen Einfluss auf die Inzidenz oder den Schweregrad von ICANShatte 19. Derzeit gibt es keine wirksame Behandlung oder Prophylaxe für ICANS, und es ist von entscheidender Bedeutung, Präventionsstrategien zu untersuchen20.
Es wird angenommen, dass myeloische Zellen und assoziierte Zytokine/Chemokine die Haupttreiber für die Entwicklung von CRS und ICANSsind 21. Während CRS in direktem Zusammenhang mit der extremen Erhöhung der Zytokine und der T-Zell-Expansion steht, ist die Pathophysiologie von ICANS weitgehend unbekannt22,23. Daher ist es zwingend erforderlich, ein Mausmodell zu etablieren, das diese Toxizitäten nach der CART-Zelltherapie rekapituliert, um die Mechanismen zu untersuchen und Präventionsstrategien zu entwickeln.
Derzeit gibt es mehrere präklinische Tiermodelle, die zur Untersuchung, Optimierung und Validierung der Wirksamkeit von CART-Zellen sowie zur Überwachung der damit verbundenen Toxizitäten verwendet werden. Dazu gehören syngene, xenotransplantierte, immunkompetente transgene, humanisierte transgene und patientenabgeleitete Xenotransplantat-Mäuse sowie Primatenmodelle. Jedes dieser Modelle hat jedoch Nachteile, und einige spiegeln nicht die tatsächliche Wirksamkeit oder Sicherheitsbedenken von CART-Zellen wider24,25. Daher ist es unerlässlich, das beste Modell für die beabsichtigten Ziele der Studie sorgfältig auszuwählen.
In diesem Artikel wird versucht, die Methodik zu beschreiben, die zur Bewertung von CART-Zell-assoziierten Toxizitäten, CRS und NI, unter Verwendung eines ALL-patientenabgeleiteten Xenotransplantats (PDX) in vivo verwendet wird (Abbildung 1). Konkret werden bei den hier beschriebenen Methoden CART19-Zellen verwendet, die im Labor der Autoren nach zuvor beschriebenen Protokollen erzeugt wurden. Kurz gesagt, menschliche T-Zellen werden mit Hilfe einer Dichtegradiententechnik aus gesunden mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) des Spenders isoliert, an Tag 0 mit CD3/CD28-Kügelchen stimuliert und an Tag 1 mit CARs lentiviral transduziert, die aus einem CD19-gerichteten einkettigen variablen Fragment bestehen, das mit 4-1BB- und CD3ζ-Signaldomänen fusioniert ist. Diese CART-Zellen werden dann expandiert, am Tag 6 entkläutet und am Tag 8 kryokonserviert 26,27,28,29,30. Wie bereits erwähnt, werden die Mäuse einer lymphodepletierenden Behandlung unterzogen, gefolgt von der Verabreichung von patienteneigenen leukämischen Blasten (ALL)28. Zunächst wird die Tumortransplantation durch submandibuläre Blutentnahme überprüft. Nach Etablierung einer entsprechenden Tumorlast werden den Mäusen CART19-Zellen verabreicht. Dann werden die Mäuse täglich gewogen, um das Wohlbefinden zu beurteilen. Die Kleintier-Magnetresonanztomographie (MRT) wird durchgeführt, um die NI zu beurteilen, zusammen mit Schwanzblutungen, um die T-Zell-Expansion und die Zytokin-/Chemokinproduktion zu beurteilen. Die unten beschriebenen Techniken werden dringend empfohlen, um als Modell zur Untersuchung von CART-Zell-assoziierten Toxizitäten in einem PDX-Modell verwendet zu werden.

<table><tbody><tr><td>&nbsp; APC Anti-Human CD19</td><td>Biolegend</td><td>302211</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol Vorbereitung Pad</td><td>Wecol</td><td>6818</td><td></td></tr><tr><td>Analyze 14.0 Software</td><td>AnalyzeDirect Inc.</td><td>N/A</td><td>https://analyzedirect.com/analyze14/</td></tr> <tr><td>Künstliche Tränen (Mineralöl und Vaseline)</td><td>Akorn</td><td>17478-062-35</td><td>Topisches ophtalmisches Gel zur Vorbeugung von Augentrockenheit</td></tr><tr><td>BD FACS Lysing Solution&nbsp;</td><td>BD</td><td>349202</td><td>Lysierungspuffer für rote Blutkörperchen</td></tr><tr><td>BD Micro-Fin IV Insulinspritzen</td><td>BD</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>Brillian Violet 421 Anti-Human CD45</td><td>Biolegend</td><td>304032</td><td></td></tr><tr><td>Bruker Avance II 7 Tesla</td><td>Bruker Biospin</td><td>N/A</td><td>MRT-Gerät</td></tr><tr><td>Busulfan (NSC-750)</td><td>Selleckchem</td><td>S1692</td><td></td></tr><tr><td>CountBright absolute Zählperlen</td><td>Invitrogen</td><td>C36950</td><td></td></tr><tr><td>CytoFLEX System B4-R2-V2</td><td>Beckman Coulter</td><td>C10343</td><td>Durchflusszytometer</td></tr><tr><td>Dulbecco's phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Gibco</td><td>14190-144&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ERT-Steuer-/Gating-Modul&nbsp;</td><td>SA Instruments</td><td>Modell 1030</td><td>Beatmungs- und Gating-System zur Überwachung von Kleintieren</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Millipore Sigma</td><td>F8067</td><td></td></tr><tr><td>Hämozytometer</td><td>Bright-Line</td><td>Z359629-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Human-AB-Serum; männliche Spender; Typ AB; US</td><td>Corning</td><td>35-060-CI</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran (flüssig)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>792632</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Fixierbares Aqua Dead Cell Stain Kit, für 405 nm Anregung</td><td>Invitrogen</td><td>L34966</td><td></td></tr><tr><td>Microvette 500 Lithium-Heparin</td><td>Sarstedt</td><td>20.1345.100</td><td>Blutentnahmeröhrchen</td></tr><tr><td>MILLIPLEX Huma/Zytokin/Chemokin Magnetische Beads Panel</td><td>Millipore Sigma</td><td>HCYTMAG-60K-PX38</td><td>Immunologie-Multiplex-Assay zur Identifizierung von Zytokinen und Chemokinen</td></tr><tr><td>Omniscan</td><td>Ge Healthcare Inc.</td><td>0407-0690-10</td><td>Gegenmittel auf Gadoliniumbasis</td></tr><tr><td>Pd Anti-Maus CD45</td><td>Biolegend</td><td>103106</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin-Glutamin (100x), Flüssigkeit</td><td>Gibco</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>Reagenzglas aus Polystyrol mit rundem Boden</td><td>Corning</td><td>352008</td><td></td></tr><tr><td>Natriumazid, 5% (w/v)</td><td>Ricca Chemical</td><td>7144.8-16</td><td></td></tr><tr><td>Edelstahl Chirurgisch Klinge</td><td>Bard-Parker</td><td>371215</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 15 serumfreies hämatopoetisches Zellmedium</td><td>Lonza</td><td>04-418Q</td><td></td></tr></tbody></table>

bewertung der chimären antigenrezeptor-t-zell-assoziierten toxizität unter verwendung eines xenograft-mausmodells für patienten mit akuter lymphatischer leukämie

Assessment of Chimeric Antigen Receptor T Cell-Associated Toxicities Using an Acute Lymphoblastic Leukemia Patient-Derived Xenograft Mouse Model

Die chimäre Antigenrezeptor-T-Zelltherapie (CART) hat sich zu einem leistungsstarken Werkzeug für die Behandlung mehrerer Arten von CD19+ -Malignomen entwickelt, was kürzlich zur FDA-Zulassung mehrerer CD19-gerichteter CART-Zelltherapien (CART19) geführt hat. Die CART-Zelltherapie ist jedoch mit einer einzigartigen Reihe von Toxizitäten verbunden, die ihre eigene Morbidität und Mortalität mit sich bringen. Dazu gehören das Zytokin-Freisetzungssyndrom (CRS) und die Neuroinflammation (NI). Die Verwendung präklinischer Mausmodelle war für die Forschung und Entwicklung der CART-Technologie von entscheidender Bedeutung, um sowohl die Wirksamkeit von CARTs als auch die Toxizität von CARTs zu bewerten. Zu den verfügbaren präklinischen Modellen zur Erprobung dieser adoptiven zellulären Immuntherapie gehören syngene, xenotransplantierte, transgene und humanisierte Mausmodelle. Es gibt kein einzelnes Modell, das das menschliche Immunsystem nahtlos widerspiegelt, und jedes Modell hat Stärken und Schwächen. Diese Methodenarbeit zielt darauf ab, ein von Patienten abgeleitetes Xenotransplantatmodell zu beschreiben, das leukämische Blasten von Patienten mit akuter lymphatischer Leukämie als Strategie zur Bewertung von CART19-assoziierten Toxizitäten, CRS und NI verwendet. Es hat sich gezeigt, dass dieses Modell sowohl die CART19-assoziierten Toxizitäten als auch die therapeutische Wirksamkeit in der Klinik rekapituliert.

Das Ziel dieses Protokolls ist es, CART-Zell-assoziierte Toxizitäten anhand eines PDX-Mausmodells aus Tumorzellen von Patienten mit ALL zu bewerten (Abbildung 1). Zunächst erhielten NSG-Mäuse i.p. Injektionen von Busulfan (30 mg/kg) mit dem Ziel, sie immunsupprimieren und die Transplantation von CART-Zellen zu erleichtern28. Am nächsten Tag erhielten sie ~5 × 106 PBMCs (i.v.), die von ALLEN Patienten stammten. Die Mäuse wurden ~13 Wochen lang mit d...

In dieser Arbeit beschreiben wir ein Protokoll, in dem ein von Patienten mit akuter lymphatischer Leukämie abgeleitetes Xenograft-Modell als Strategie zur Bewertung und Überwachung von CD19-gerichteten chimären Antigenrezeptor-T-Zell-assoziierten Toxizitäten verwendet wird.

Bewertung der chimären Antigenrezeptor-T-Zell-assoziierten Toxizität unter Verwendung eines Xenograft-Mausmodells für Patienten mit akuter lymphatischer Leukämie

Chimeric antigen receptor T (CART) cell therapy has emerged as a powerful tool for the treatment of multiple types of CD19+ malignancies, which has led to ...

Dieses Protokoll verwendet menschliche CAR-T- und Tumorzellen und demonstriert genau die Toxizitäten, die mit der Verabreichung von CART19 verbunden sind. Daher rekapitulieren wir, was in der Klinik beobachtet wurde. Der Hauptvorteil dieser Plattform besteht darin, dass sie ein übersetzbares und klinisch relevantes Modell bietet, bei dem menschliche T-Zellen und Tumorzellen verwendet werden.Dieses Modell ermöglicht nicht nur eine effiziente Bewertung von CART19-assoziierten Toxizitäten, sondern ermöglicht es uns auch, besser zu verstehen, wie wir diese Toxizitäten durch verbesserte Behandlungsstrategien überwinden können. Überwachen Sie zunächst die zweimal täglich verabreichten CART19-Mäuse, um Veränderungen ihres Wohlbefindens zu beurteilen, wie z. B. motorische Schwäche, gekrümmter Körper und Gewichtsverlust. Sobald die Mäuse motorische Schwäche und Gewichtsreduktion entwickeln, wird ihr peripheres Blut entnommen, um die Tumorlast zu analysieren.Und führen Sie eine Serumisolierung für Zytokine durch, wie im Manuskript beschrieben. Nach der Isolierung werden die Serum-Mikrozentrifugenröhrchen bei 80 Grad Celsius gelagert und mit dem Cera die Chemokine und Zytokine mit dem Multiplex-Assay analysiert. Für die MRT-Bildgebung werden 120 Mikroliter Gadolinium mit 880 Mikrolitern Kochsalzlösung gemischt und in eine Ein-Milliliter-Insulinspritze gegeben.Injizieren Sie 100 Mikroliter der zubereiteten Lösung intraperitoneal in jede Maus. Betäuben Sie die Maus und legen Sie sie auf die Nagetier-kompatible Cradle-Sonde. Dann die Zähne an der Beißstange einhaken.Ziehen Sie den Kopf der Maus in die 25-Millimeter-Volumenspule und stellen Sie den Nasenkonus ein, der mit dem Isofluran-Anästhesiesystem verbunden ist. Ziehen Sie den Knopf der Beißleiste fest, um die Position für die Dauer des Scans beizubehalten. Befestigen Sie zur Beurteilung der Atmung die Sonde eines Atemüberwachungsgeräts in der Nähe des Zwerchfells und befestigen Sie sie mit chirurgischem Klebeband.Halten Sie die Atemfrequenz zwischen 20 und 60 Atemzügen pro Minute, damit der Zustand der Mäuse stabil bleibt. Führen Sie die Tiersonde in die kleine Bohrung innerhalb des Vertical Bore Small Animal MRT-Systems ein und stellen Sie den Kopf des Tieres in der Mitte der Spule ein. Sichern Sie das Gerät mit dem Schloss in aufrechter Position und schließen Sie das Gerät an den Computer an.Öffnen Sie als Nächstes die ParaVision-Software, um die Scanpositionen und Scantypen einzurichten. Bestimmen Sie die optimalen sagittalen und axialen Positionen, während Sie sie für alle Versuchsgruppen konsistent halten. Um die T1-gewichteten MRT-Daten zu erfassen, verwenden Sie eine T1-gewichtete Multi-Slice-Multi-Echo-Sequenz mit einer Wiederholungszeit von 300 Millisekunden, einer Echozeit von 9,5 Millisekunden, einem Sichtfeld von 4,00 x 2,00 x 2,00 Zentimetern und einer Matrix von 192 x 96 x 96.Verwenden Sie für T2-gewichtete MRT-Bilder eine Multi-Slice-Multi-Echo-Sequenz mit ähnlichen Parametern. Sobald die Scans abgeschlossen sind, entfernen Sie die Sonde aus der Bohrung und ziehen Sie die Maus vorsichtig heraus, indem Sie die Zähne von der Beißstange entfernen. Nach der Extraktion der Daten aus der Software wurde eine Analysesoftware für die Quantifizierung und das 3D-Volumen-Rendering der Hyperintensitätsregionen verwendet CD19+ Tumorzellpopulationen wurden zwischen Mäusen, die mit CART19 behandelt wurden, und unbehandelten Mäusen mit Durchflusszytometrie verglichen.Eine signifikante Gewichtsreduktion wurde bei Mäusen beobachtet, die mit CART19-Zellen behandelt wurden. Gewichtsverlust wird als Symptom des CRS-Auftretens angesehen, das mit CART-Zell-assoziierten Toxizitäten zusammenhängt. Ein Multiplex-Assay zeigte die Expression von Zytokinen und Chemokinen im Serum von NSG-Mäusen vor und nach der Verabreichung von CART19.T2-gewichtete Bilder zeigten Hinweise auf Ödeme und mögliches entzündliches Infiltrat während der Neuroinflammation bei CART19-behandelten Mäusen. Die T1-gewichtete MRT zeigte eine Kontrastmittelverstärkung innerhalb des Hirnparenchyms, was auf eine erhöhte Gefäßpermeabilität hindeutet. Dreidimensionale Rekonstruktionen des Nagetiergehirns wurden auf der Grundlage von T1-Hyperintensitätsregionen zusammengestellt, die der vaskulären Permeabilität entsprechen, die das Volumen des Gadolinium-Austritts im Gehirn wiedergibt.Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass die tägliche körperliche Überwachung der Mäuse nach der Verabreichung von CART19 zusammen mit peripheren Blutungen der beste Indikator ist, um mit der MRT fortzufahren, um Veränderungen im Gehirn, die auf CRS oder Neurotoxizität hinweisen, vollständig zu beurteilen. Diese Technologie ist auf weitere CAR-T-Zell-Therapien anwendbar und wird es Wissenschaftlern ermöglichen, potenzielle Toxizitäten, die sich aus neuartigen CAR-T-Zellen ergeben, effizient zu testen. Dieses vorgeschlagene Modell ist ein Sprungbrett, um zu verstehen, wie CAR-T-Zell-assoziierte Toxizitäten überwacht, behandelt und zur Validierung neuer CAR-T-Zell-Modelle verwendet werden können.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

Rezeptortyrosinkinasen sind bei vielen Krebs ektopisch exprimiert und sind als therapeutische Ziele bei akuter Leukämie identifiziert. Dieses Manuskript beschreibt eine effiziente Strategie für die präklinische Evaluierung von Tyrosinkinase-Inhibitoren für die Behandlung der akuten Leukämie.

Präklinische Evaluierung von Tyrosinkinase-Inhibitoren für die Behandlung von akuter Leukämie

Mantel-Zell-Lymphom (MCL) ist ein schwer zu B-Zell-Störung zu behandeln, und es ist ebenso schwierig, zur Einrichtung eines Xenograft-Maus-Modell der primären MCL zu studieren und Therapeutika zu entwickeln. Hier beschreiben wir die erfolgreiche Etablierung von MCL Xenotransplantate bei Mäusen zu helfen, die zugrunde liegende Biologie zu verstehen.

Tumor Engraftment in einem Xenograft-Maus-Modell der menschlichen Mantel-Zell-Lymphom

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die Produktion und präklinische Tests der murinen CD19 Auto T-Zellen durch retrovirale Transduktion und Nutzung als Therapie gegen etablierte Phänomen A20 B-Zell-Lymphom bei Mäusen BALB/c mit oder ohne lymphodepleting Vorklimatisierung.

Ein Phänomen B-Zell-Lymphom Mausmodell für präklinische Bewertung von CD19-Auto-T-Zellen

Wir beschreiben ein quantitatives Echtzeit-In-vitro-Zytolyse-Assay-System zur Bewertung der Wirksamkeit von chimeric antigenen Antigen-Rezeptor-T-Zellen, die auf flüssige und solide Tumorzellen abzielen. Dieses Protokoll kann erweitert werden, um andere Immuneffektorzellen sowie Kombinationsbehandlungen zu bewerten.

Ein Echtzeit-Potenz-Assay für chimerantigene Antigen-Rezeptor-T-Zellen, die auf feste und hämatologische Krebszellen abzielen

Hier stellen wir ein Protokoll zur Induzieren und Bewertung von Krankheiten bei einem xenogenen Transplantat-versus-Host-Krankheitsmodell (XenoGVHD) vor. xenoGVHD bietet ein In-vivo-Modell zur Untersuchung der Immunsuppression menschlicher T-Zellen. Darüber hinaus beschreiben wir, wie man menschliche T-Zellen in Geweben mit digitaler PCR als Werkzeug zur Quantifizierung der Immunsuppression erkennt.

Induktion und Bewertung der Graft-Versus-Host-Krankheit in einem xenogenen Murine-Modell und Quantifizierung menschlicher T-Zellen in Mausgeweben mit digitaler PCR

Hier beschreiben wir eine in-vitro-Kokultur Methode rekursiv Herausforderung Tumor gezielt T-Zellen, die phänotypische und funktionelle Analyse der Antitumor-T-Zell-Aktivität ermöglicht.

In Vitro Tumor Zelle Rechallenge für vorausschauende Bewertung der Chimeric Antigen-Rezeptor-T-Zell-Antitumor-Funktion

Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung von Mäusen mit menschlichem Immunsystem (KIS) für immunonkologische Studien. Anweisungen und Überlegungen zur Verwendung dieses Modells zum Testen von humanen Immuntherapeutika an menschlichen Tumoren, die in dieses Modell implantiert wurden, werden vorgestellt, wobei der Schwerpunkt auf der Charakterisierung der Reaktion des menschlichen Immunsystems auf den Tumor liegt.

Erprobung von Krebsimmuntherapeutika in einem humanisierten Mausmodell mit menschlichen Tumoren

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Herstellung von Doppelemulsionströpfchen, die eine T-Zelle und eine Krebszielzelle verkapseln, um die Zellabtötung auf Einzelzellebene zu untersuchen. Diese Methode ermöglicht die duale Quantifizierung sowohl zytotoxischer Moleküle als auch der Apoptose der Zielzellen innerhalb einer großen Population von T-Zellen.

Tröpfchenbasierter Zytotoxizitätsassay zur Beurteilung von chimären Antigenrezeptor-T-Zellen auf Einzelzellebene

Dieses Protokoll beschreibt die In-Ovo-Xenotransplantation von patienteneigenen B- und T-Zellen der akuten lymphatischen Leukämie (ALL), die 4 Tage nach der Injektion erfolgt.

In Ovo Xenotransplantation von patienteneigenen Zellen der akuten lymphatischen Leukämie (ALL) (PDX-ALL)

Das Protokoll zielt darauf ab, ein Mausmodell zur Erzeugung von Schüben akuter lymphatischer Leukämie zu beschreiben, basierend auf der Dynamik des Ansprechens auf eine Induktionschemotherapie.

Mausmodell des Leukämie-Rezidivs zur Induktionschemotherapie bei akuter lymphatischer Leukämie

Erfahren Sie die Bewertung von CAR-T-Zell-Toxizitäten bei akuter lymphatischer Leukämie unter Verwendung eines patientenbezogenen Xenograft-Mausmodells. Diese Methode ermöglicht klinisch relevante Erkenntnisse für sicherere Immuntherapiestrategien.

Bewertung der chimären Antigenrezeptor-T-Zell-assoziierten Toxizität unter Verwendung eines Xenograft-Mausmodells für Patienten mit akuter lymphatischer Leukämie (Video) | JoVE Journal

Bewertung der chimären Antigenrezeptor-T-Zell-assoziierten Toxizität unter Verwendung eines Xenograft-Mausmodells für Patienten mit akuter lymphatischer Leukämie

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